Évaluation de la multiplicité synaptique à l’aide de Patch-clamp de la cellule entière électrophysiologie

Résumé

Nous présentons ici un protocole permettant d’évaluer la multiplicité synaptique fonctionnelle à l’aide d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp en tranches cérébrale aiguë.

Résumé

Dans le système nerveux central, une paire de neurones forment souvent des multiples contacts synaptiques et/ou sites de libération neurotransmetteur fonctionnelle (multiplicité synaptique). Multiplicité synaptique est plastique et change au cours du développement et dans les conditions physiologiques différentes, étant un facteur déterminant pour l’efficacité de la transmission synaptique. Ici, nous exposons les expériences pour estimer le degré de multiplicité des synapses se terminant sur un neurone postsynaptique donné à l’aide d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp en tranches cérébrale aiguë. Plus précisément, enregistrement de voltage clamp est utilisé pour comparer la différence entre l’amplitude des courants postsynaptiques excitateurs spontanées (sEPSCs) et les courants postsynaptiques excitateurs miniature (mEPSCs). La théorie derrière cette méthode est que des entrées afférentes qui présentent une multiplicité montrera sEPSCs grande, dépendante du potentiel d’action en raison de la sortie synchrone qui survient à chaque contact synaptique. En revanche, libération de potentiel d’action indépendante (qui est asynchrone) générera plus petite amplitude mEPSCs. Cet article décrit un ensemble d’expériences et d’analyses pour caractériser l’existence d’une multiplicité synaptique et traite les exigences et les limites de la technique. Cette technique peut être appliquée afin d’étudier comment différentes interventions comportementales, pharmacologiques ou environnementales en vivo affectent l’organisation des contacts synaptiques dans certaines zones du cerveau différentes.

Introduction

La transmission synaptique est un mécanisme fondamental pour la communication entre les neurones et donc fonction du cerveau. La transmission synaptique est aussi labile et peut changer son efficacité de manière dépendante de l’activité ainsi qu’en réponse à des signaux modulatory¹. Ainsi, l’examen de la fonction synaptique a été un thème majeur de la recherche en neurosciences. Cellule entière patch clamp électrophysiologie est une technique polyvalente qui permet de comprendre, de concevoir des modèles expérimentaux et analyses de données, des mécanismes biophysiques et moléculaires approfondies de la transmission synaptique. Une approche cou....

Protocole

Toutes les expérimentations animales sont approuvées par le Comité de protection des animaux de l’Université de Western Ontario selon le Canadian Council on Animal Care Guidelines (PUA #2014-031).

1. les solutions

1. Solution de tranchage
   1. Référer au tableau 1 pour la composition de la solution de tranchage.
   2. Préparer une solution 20 x à l’avance et les conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.
   3. Pour 1 x tranchage de solution, dissoudre NaHCO₃, glucose et saccharose dans ddH₂O et ajoutez le bouillon de 20 x. Assurez-vous que l’osmolarité est entre 3....

Résultats

Le protocole ci-dessus décrit une méthode permettant d’utiliser électrophysiologie de germes entiers patch clamp pour examiner le degré de multiplicité synaptique, à l’aide de neurones hypothalamiques souris à titre d’exemple. Cette technique de préparation de tranche devrait produire des cellules viables en bonne santé qui n’ont pas une membrane gonflée ou noyau (Figure 1). Chaque étape du protocole est important pour la santé du tissu et la qualité des enregistrements.<.......

Discussion

Une condition importante pour une expérience d’électrophysiologie de pince patch réussie est d’obtenir des tranches/cellules saines. Notre protocole décrit est optimisé pour les tranches hypothalamiques qui contiennent les neurones PVN. Autre cerveau peuvent exiger des zones modifiées solutions et méthodes tranchage^21,22,23,24. Pour l’enregistrement, il est essentiel pour n’accepter les enregis.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue de 1 mL	BD	309659
10 lames	Fisher Scientific/autres	35698
22 lames	VWR/autres	21909-626
22 &mu ; Filtres à seringue M	Milipore	09-719-000
Adson foreceps	Harvard Instruments	72-8547
Ciseaux aigus coudés	Harvard Instruments	72-8437
Clampex	Molecular Devices	pClamp 10
Lame à double tranchant	VWR	74-0002
Papier filtre	Sigma/autres	1001090
Pinceau fin	Fisher/divers	15-183-35/divers
Tube de dispersion de gaz	VWR	LG-8680-120
Isoflurane	Fresenius Kabi/autres	M60303
Krazy colle	divers	divers
Mini analyse	Synaptosoft	MiniAnalysis 6
Osmomoter	Wescor Inc	Modèle 5600
Parafilm	Sigma	PM-996
Pipette Pasteur	VWR	14672-200
ph-mètre	Mettler Toledo	FE20-ATC
Poire en caoutchouc	VWR	82024-550
Manche de scalpel n° 3	Harvard Instruments	72-8350
Manche de scalpel n° 4	Harvard Instruments	72-8356
Lame à un seul tranchant	VWR	55411-050
Trancheuse vibrante	Leica	VT1200S
Système de purification d’eau	Millipore	Milli-Q Academic A10
Couvercle de plaque	de puits Fisher/divers	07-201-590/divers
Produits chimiques/réactifs
Sondes moléculaires 4-AP	Sigma	275875
BAPTA		B1204
CaCl2*2H2O	Sigma	C7902
CdCl2	sigma	202908
DNQX	Tocris	189
EGTA	Sigma	E3889
glucose	Sigma	G5767
HEPES	Sigma	H3375
K2-ATP	Sigma	A8937
KCl	Sigma	P9333
K-gluconate	Sigma	G4500
MgCl2*6H2O	Sigma	M2670
Qualité biologie moléculaire water	Sigma	W4502-1L
Na3GTP	Sigma	G8877
NaCl	Bioshop	SOD001.1
Na-gluconate	Sigma	S2054
NaH2PO4	Sigma	71504
NaHCO3	Sigma	S6014
Picrotoxine	sigma	P1675
SrCl	Sigma	255521
saccharose	Bioshop	SUC507.1
TTX	Alamone Labs	T-550
yDGG	Tocris	6729-55-1