Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

VirWaTest, une méthode de point d'utilisation pour la détection des virus dans les échantillons d'eau

8.3K vues

⸱

DOI :

10.3791/59463

⸱

11 mai 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Viruses Contaminants of Water and Food (VIRCONT), Department of Genetics, Microbiology and Statistics, Section of Microbiology, Virology and Biotechnology, University of Barcelona, 2Grupo de Investigación Biodiversidad, Medio Ambiente y Salud (BIOMAS), Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarias (FICA), Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Américas, 3Municipal Laboratory - Waters of Mataró, 4GenIUL

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici VirWaTest, qui est une méthode simple, abordable et portable pour la concentration et la détection des virus à partir d'échantillons d'eau au point d'utilisation.

Résumé

Les virus excrétés par les humains et les animaux peuvent contaminer les sources d'eau et présenter un risque pour la santé humaine lorsque cette eau est utilisée pour boire, irriguer, laver, etc. L'indicateur classique des bactéries fécales ne vérifie pas toujours la présence d'agents pathogènes viraux, de sorte que la détection des agents pathogènes viraux et des indicateurs viraux est pertinente afin d'adopter des mesures d'atténuation des risques, en particulier dans les scénarios humanitaires et dans les zones où les flambées virales d'origine hydrique sont fréquentes.

À l'heure actuelle, plusieurs tests commerciaux permettant la quantification des bactéries indicateurs fécales (FIB) sont disponibles pour des tests au point d'utilisation. Cependant, de tels tests commerciaux ne sont pas disponibles pour la détection des virus. La détection des virus dans les échantillons d'eau de l'environnement nécessite de concentrer plusieurs litres en plus petits volumes. De plus, une fois concentrés, la détection des virus repose sur des méthodes telles que l'extraction de l'acide nucléique et la détection moléculaire (p. ex., les essais en chaîne de polymérase (PCR] des génomes viraux).

La méthode décrite ici permet la concentration de virus à partir d'échantillons d'eau de 10 L, ainsi que l'extraction d'acides nucléiques viraux au point d'utilisation, avec un équipement simple et portable. Cela permet de tester des échantillons d'eau au point d'utilisation de plusieurs virus et est utile dans les scénarios humanitaires, ainsi que dans n'importe quel contexte où un laboratoire équipé n'est pas disponible. Alternativement, la méthode permet de concentrer les virus présents dans les échantillons d'eau et l'expédition du concentré à un laboratoire à température ambiante pour une analyse plus approfondie.

Introduction

Pendant les premières phases de toute urgence humanitaire, l'accès à l'approvisionnement en eau potable, à l'assainissement et à l'hygiène est essentiel à la survie des personnes touchées. Par conséquent, la surveillance de la qualité de l'eau est une priorité pour prévenir les flambées d'origine hydrique. Il est bien connu que l'eau contaminée est souvent à l'origine de maladies, mais il est souvent difficile de déterminer les sources d'éclosions virales telles que le virus de l'hépatite E (VHE), même avec la disponibilité de méthodes de laboratoire conventionnelles. Le contrôle de la qualité de l'eau est basé sur la quantification de FIB1,2,3,4. Cependant, il a été largement documenté qu'il n'y a aucune corrélation entre l'absence de FIB et la présence d'agents pathogènes d'origine hydrique virale tels que le rotavirus (RoV), le norovirus (NoV), ou le VHE5,6. Ainsi, l'utilisation des critères de qualité de l'eau basés sur la FIB pourrait entraîner une sous-estimation des risques associés à la présence d'agents pathogènes viraux d'origine hydrique. La surveillance de virus indicateurs, tels que les adénovirus humains (HAdV), ou d'agents pathogènes spécifiques serait utile pour définir l'exposition aux agents pathogènes viraux et identifier la source potentielle de l'infection humaine7,8, 9,10 et en validant l'efficacité des mesures d'assainissement11.

Jusqu'à présent, la détection des virus dans ces scénarios reposait sur un personnel qualifié et une logistique complexe. VirWaTest (virwatest.org) vise le développement d'une méthode simple, abordable et portable pour la concentration et la détection subséquente des virus à partir d'échantillons d'eau au point d'utilisation.

La concentration du virus est basée sur le principe de la flocculation organique de 10 Échantillons d'eau L, par lequel les virus sont récupérés en plus petits volumes12,13. Les flocs sont recueillis et ajoutés à un tampon qui lyse les virus et empêche les acides nucléiques de se dégrader lorsqu'ils sont stockés à température ambiante pendant au plus 2 semaines.

La méthode d'extraction de l'acide nucléique est basée sur l'utilisation de particules magnétiques auxquelles les acides nucléiques obtiennent adsorbed. Ils peuvent être transférés d'un tampon de lavage à un autre et enfin dans le tampon d'élution à l'aide d'une pipette magnétique à laquelle les particules se fixent. Les suspensions d'acide nucléique viral obtenues peuvent être expédiées à un laboratoire de référence où la détection peut être effectuée à l'aide de méthodes moléculaires basées sur pcR. Pour chaque extraction d'acide nucléique, deux quantités différentes sont testées pour exclure l'inhibition enzymatique provenant de l'échantillon. Alternativement, avec une disponibilité minimale de l'équipement, les tests PCR peuvent être exécutés au point d'utilisation. L'ensemble du processus est conçu pour être exécuté indépendamment d'une alimentation électrique (figure 1).

Un essai quantitatif de PCR pour détecter le HAdV, excrété par l'homme et trouvé dans des échantillons d'eaux usées en concentrations élevées, a été adapté pour être exécuté au point d'utilisation. Le VHA est utilisé comme indicateur viral fécal humain. Un PCR pour la quantification du bactériophage MS2 a également été adapté puisque MS2 est utilisé dans VirWaTest comme contrôle des processus. La méthode peut être personnalisée pour la détection de tout virus d'intérêt.

Après le développement, la méthode VirWaTest a été appliquée par les utilisateurs dans deux contextes différents en République d'Afrique centrale (RCA) et en Equateur, fournissant des commentaires sur l'application du protocole dans des situations réelles.

À notre connaissance, il s'agit de la première procédure qui permet la concentration et la détection des virus au point d'utilisation, indépendamment de toute alimentation électrique, de gros équipements et de conditions de congélation/refroidissement. Il est recommandé de prélever deux répliques de chaque échantillon d'eau afin d'obtenir des résultats robustes.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Préparation et emballage

REMARQUE : Les matériaux/équipements à emballés figurent dans le tableau 1. Utilisez des gants pour manipuler les réactifs nécessaires au contrôle des processus, les réactifs de concentration, les réactifs d'extraction d'acide nucléique et les réactifs de détection. Portez des lunettes de protection pour manipuler les réactifs requis pour l'extraction d'acide nucléique.

  1. Contrôle du processus
    1. Préparer la culture des stocks de bactériophages MS2 (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) contenant 1 x 1010 PFU/mL en laboratoire en suivant la procédure ISO 10705-1:199514.
    2. Ensuite, aliquot 10 l de la suspension par tube contenant 1 x 108 PFU en tubes de 10 ml et laisser l'eau s'évaporer à 37 oC. Utilisez un tube par échantillon d'eau.
    3. De plus, préparez un tube contenant 10 ml d'eau distillée stérile par échantillon prélevé.
  2. Réactifs de concentration
    1. Pour la solution de lait écrémé préfloculé (PSM), utilisez les quantités suivantes pour concentrer cinq échantillons d'eau de 10 L.
      1. Préparer un tube en plastique contenant 5 g de lait écrémé.
      2. Préparer un sac en plastique à fermeture éclair contenant 16,66 g de sels de mer.
      3. Préparer une bouteille en plastique contenant 500 ml d'eau distillée.
    2. Préparer les réactifs nécessaires à l'ajustement du pH. Utilisez les quantités suivantes pour ajuster le pH du MSP et de cinq échantillons d'eau de 10 L.
      1. Ajouter 5 g d'acide citrique 1 hydrate dans un tube en plastique de 10 ml.
        CAUTION: L'acide citrique provoque une irritation grave quand il entre en contact avec les yeux. Si cela se produit, rincez l'œil avec précaution avec de l'eau pendant plusieurs minutes. Si l'irritation persiste, consulter un médecin.
      2. Mettre 2 g d'hydroxyde de sodium dans un tube en plastique de 10 ml.
        CAUTION : L'hydroxyde de sodium peut causer de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. En cas d'ingestion, rincer la bouche. N'induisez pas de vomissements. S'il entre en contact avec les yeux, rincer prudemment à l'eau pendant plusieurs minutes. Ensuite, consultez un médecin.
      3. Mettre 25 ml d'eau distillée stérile dans un récipient en plastique.
      4. Mettre 50 ml d'eau distillée stérile dans un récipient en plastique.
    3. Préparer le sachet de conditionnement d'échantillon utilisé pour la flocculation, la solution de conservation utilisée pour préserver les acides nucléiques, et le sachet neutralisant pour neutraliser l'eau et les matériaux jetés. Utilisez les quantités suivantes pour chaque échantillon d'eau de 10 L à tester.
      1. Mettre 15 g de sels de mer et 8 g d'acide citrique 1 hydrate dans un sac en plastique à fermeture éclair pour le sachet de conditionnement.
      2. Ajouter 2 mL de tampon de lyse (Table des matériaux) et 0,3 ml d'agent de conservation de l'acide nucléique (Tableau des matériaux) à un tube de 5 ml.
        CAUTION: Le tampon de Lysis contient de la guanidine thiocyanate et du Triton X-100. Le contact avec l'acide libère les gaz toxiques, et il est nocif s'il est avalé, inhalé, ou entre en contact avec la peau. En cas d'ingestion, rincer la bouche. N'induisez pas de vomissements. S'il entre en contact avec la peau, lavez-le avec beaucoup d'eau. Ensuite, consultez un médecin. L'agent de conservation de l'acide nucléique provoque une irritation de la peau et des yeux et est nocif s'il est avalé. S'il entre en contact avec la peau ou les yeux, rincer à l'eau abondante pendant plusieurs minutes. Dans tous les cas, surtout si avalé et se sentir mal, consulter un médecin.
      3. Mettre 40 g de poudre de détergent dans quatre sacs en plastique à fermeture éclair.
        CAUTION : Le détergent à poudre cause l'irritation d'oeil. S'il entre en contact avec les yeux, rincer à l'eau abondante pendant plusieurs minutes. Si l'irritation persiste ou si elle est avalée, consultez un médecin.
  3. Réactifs d'extraction d'acide nucléique
    1. Mettre 50 l de particules magnétiques (Tableaudes matériaux)et 1 ml d'éthanol 96 % dans un tube de 5 ml qui constitue le tampon de liaison.
      CAUTION: Le tampon de particules magnétiques contient de l'azide de sodium, qui forme un gaz toxique lorsqu'il entre en contact avec des acides ou des ions métalliques lourds et est toxique s'il est ingéré ou lorsqu'il entre en contact avec la peau. En cas d'ingestion ou en contact avec la peau, rincez la bouche ou la peau avec de l'eau abondante et consultez un médecin. L'éthanol est un liquide et une vapeur hautement inflammables qui causent une irritation oculaire grave. Éloignez-vous de la chaleur, des surfaces chaudes, des étincelles et de toute autre source d'inflammation. S'il entre en contact avec la peau ou les yeux, rincer à l'eau abondante. En cas d'ingestion de grandes quantités d'eau et/ou en cas d'inhalation, aller à l'extérieur dans l'air frais. Dans tous les cas, consulter un médecin.
    2. Ajouter 500 l, 600 l et 200 l de tampons de lavage 1, 2 et 3, respectivement (Tableau des matériaux), à trois tubes de 2 ml.
      CAUTION : Les tampons de lavage contiennent du piocyanate de guanidinium et du chlorure de guanidinium, qui sont nocifs s'ils sont inhalés ou avalés et irritent la peau et les yeux. Le contact avec les acides libère des gaz très toxiques. S'ils entrent en contact avec la peau ou les yeux, rincez avec de l'eau abondante. En cas d'ingestion, rincer la bouche avec de l'eau abondante. N'induisez pas de vomissements. Consultez toujours un médecin.
    3. Ajouter 120 l de tampon d'élution (Table des Matériaux) à un tube de 0,5 ml.
  4. Réactifs de détection HAdV et MS2
    REMARQUE : Deux réactions différentes d'extraction d'acide nucléique peuvent être analysées simultanément dans chaque analyse de PCR si un thermocycler de 8 puits est employé. Pour tous les essais de PCR, préparer l'eau de biologie moléculaire aliquoted dans des tubes de 1,5 ml.
    1. Détection hAdV
      1. Préparer un mélange contenant 10 l d'amorce adflade AdF de 22,5 M, 10 l d'amorce inversée AdR de 22,5 M, et 5 l de sonde AdP de 11,25 M (tableau 2).
      2. Ajouter 2,5 l de l'mélange dans les tubes 1 à 8 d'une bande tubulaire. Laissez-le sécher à température ambiante, fermez les tubes et protégez-les de la lumière.
      3. Couper la bande en la divisant en deux bandes : tubes 1-5 et tubes 6-8.
      4. Préparer une dilution en série des suspensions d'ADN contenant la séquence nucléotide de la région amplifiée de HAdV. Sécher à l'air 1 l de suspensions contenant 1 x 105, 1 x 107, et 1 x 109 GC/mL dans des tubes 6-8.
        REMARQUE : Gardez les tubes contenant les amorces, la sonde et les suspensions séchées à l'air à l'abri de la lumière.
    2. Détection MS2
      1. Préparer un mélange contenant 10 'L de 25 'M pecson-2F amorce avant, 10 'L de 25 'M pecson-2R amorce inversée, et 2,5 'L de 25 'M pecP-2 sonde (tableau 2).
      2. Ajouter 2,25 l de l'mélange dans les tubes 1 à 8 d'une bande tubulaire. Laissez-le sécher à température ambiante, fermez les tubes et protégez-les de la lumière.
      3. Couper la bande en la divisant en deux bandes : tubes 1-5 et tubes 6-8.
      4. Procédez comme à l'étape 1.4.1.4 mais utilisez une suspension standard conçue pour MS2 à la place.

2. Concentration virale

REMARQUE : Utilisez des gants en tout temps pendant la collecte de l'échantillon, la préparation du réactif, la flocculation, la collecte des flocs et les procédures d'élimination des déchets. Portez des lunettes de protection pendant la procédure de préparation du réactif.

  1. Collecte d'échantillons
    1. Recueillir un échantillon d'eau de 10 L dans un seau à fond plat avec un couvercle. Recueillir un minimum de deux répliques pour chaque échantillon.
      REMARQUE : Il est important d'utiliser des seaux clairs pour visualiser le granule. Si l'échantillon d'eau contient du matériel en suspension (p. ex. sable, algues), laissez-le sédimenter et, ensuite, recueillir le supernatant d'eau dans un nouveau seau.
    2. Enregistrez le volume recueilli, ainsi que l'emplacement et la date de collecte, pour chaque échantillon d'eau.
    3. Placez un agitateur magnétique relié à une batterie sous un support de seau et placez le seau contenant l'échantillon d'eau sur son support.
      REMARQUE : Recherchez une surface plane dans un endroit frais et gardez les seaux contenant les échantillons d'eau de la lumière directe du soleil.
  2. Préparation des réactifs
    1. réagents d'ajustement de pH
      1. Verser la poudre d'acide citrique et les granulés d'hydroxyde de sodium dans les pots contenant 25 et 50 ml d'eau distillée, respectivement.
      2. Secouez doucement à la main jusqu'à ce que l'acide citrique et l'hydroxyde de sodium soient complètement dissous.
        ATTENTION : Ne versez pas l'eau sur les granulés d'hydroxyde de sodium. Au lieu de cela, versez les granulés d'hydroxyde de sodium sur l'eau.
    2. Lait écrémé préfloculé
      1. Placez un sac de stand-up sur un agitateur magnétique et versez 500 ml d'eau distillée dedans. Déposez un aimant remuant à l'intérieur du sac et allumez l'agitateur magnétique.
      2. Verser le contenu d'un sachet de sel de mer et d'un tube de lait écrémé dans le sac de stand-up et remuer pendant 5 minutes à vitesse moyenne pour les dissoudre.
      3. Ajouter 3 ml d'acide citrique à la solution PSM à l'aide d'une pipette Pasteur pour s'assurer que le pH se situe entre 3,4 et 3,6. Mesurez le pH de la solution PSM à l'aide de bandes d'indicateur de pH. Ajoutez de plus petites quantités d'acide citrique et d'hydroxyde de sodium à mesure que le pH se rapproche de 3,5.
      4. Éteignez l'agitateur magnétique et assurez-vous que les flocs sont visibles. Utilisez une lampe de poche pour aider à visualiser les flocs.
  3. Floculation
    1. Déposez un aimant remuant dans l'eau, installez l'agitateur magnétique à une vitesse maximale et allumez-le. Assurez-vous que l'aimant en remuant commence à tourner.
    2. Ajouter 10 ml d'eau distillée dans un tube de contrôle des processus. Inverser le tube à quelques reprises pour réhydrater le bouillon viral et verser la solution dans l'eau.
    3. Verser le contenu d'un sachet de conditionnement d'échantillon dans l'eau et remuer pendant 5 min.
    4. Mesurer le pH de l'échantillon d'eau à l'aide de bandes d'indicateur de pH. Ajoutez quelques gouttes d'acide citrique ou d'hydroxyde de sodium à l'échantillon d'eau pour vous assurer que le pH se situe entre 3,4 et 3,6. Ajoutez de plus petites quantités d'acide citrique et d'hydroxyde de sodium à mesure que le pH se rapproche de 3,5.
    5. Ajouter 100 ml de la solution PSM à l'aide d'un contenant de 100 ml.
    6. Scellez le seau avec le couvercle, régler l'agitateur magnétique à vitesse minimale, et laisser l'eau en remuant pendant 8 h.
    7. Éteignez l'agitateur magnétique et laissez l'eau immobile pendant au moins 5 h pour permettre aux flocs de se déposer.
  4. Collection Floc
    1. Construire un système de siphonnage composé d'un contrôleur de pipette, deux pipettes, et un tube en plastique, pour aspirer le surnatant d'eau pour décharger l'eau sur les flocs.
      1. Fixez une pipette à extrémité de bande de 10 ml au contrôleur de pipette. Ensuite, attachez la pointe de la pipette au tube en plastique.
      2. Retirez le filtre d'une pipette à pointe ouverte de 10 ml à l'aide d'une pince à épiler et attachez la pipette au tube en plastique.
    2. Placez un seau vide sur le sol.
    3. Immerger le bout de la pipette à pointe ouverte dans l'eau. Assurez-vous de le garder près de la surface de l'eau pour éviter de déranger les flocs. Aspirez le surnatant d'eau jusqu'à ce qu'il atteigne la pipette à extrémité du ruban adhésif.
    4. Pincer le tube en plastique à l'extrémité attaché à la pipette à l'extrémité du ruban adhésif et le détacher de la pipette.
    5. Placer le tube dans un seau vide. Relâchez la pression sur le tube pour laisser l'eau s'écouler dans le seau vide.
    6. Pincez le tube en plastique pour arrêter le débit d'eau lorsque le niveau d'eau est sur le point d'atteindre l'aimant en mouvement et déplacer la pipette loin du seau.
    7. Secouez le seau pour resuspendre les flocs et versez-les dans un sac en plastique de 500 ml. Laisser les flocs se contenter de 1 h de plus.
    8. Aspirez soigneusement le supernatant d'eau à l'aide d'une pipette de 50 ml et d'un contrôleur manuel de pipette, évitant de déranger les flocs.
    9. Aspirez les flocs à l'aide d'une pipette de 100 ml et transférez-les dans un tube de centrifugeuse gradué de 50 ml. Notez le volume final du concentré d'échantillon et transférez 1 ml de celui-ci dans un tube de 5 ml contenant la solution de conservation, à l'aide d'une pipette Pasteur.
      REMARQUE : Il est important que le tube de centrifugeuse soit gradué afin que le volume final de l'échantillon concentré puisse être mesuré aussi précisément que possible et enregistré.
    10. Effectuer l'extraction d'acide nucléique dans le champ. Vous pouvez également entreposer la solution de conservation contenant les virus à 20-30 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à 15 jours ou les expédier à un laboratoire de référence pour une analyse plus approfondie.
  5. Élimination des déchets et réutilisation des matériaux
    1. Ajouter le contenu d'un sachet d'agent neutralisant dans le seau contenant l'eau jetée. Mélanger l'eau, puis, laisser encore pendant 30 min.
    2. Disposer de l'eau traitée comme déchets généraux.
    3. Placez les pipettes et le tube en plastique à l'intérieur du seau. Remplissez le seau d'eau et versez le contenu d'un sachet d'agent neutralisant.
    4. Lavez-les pendant au moins 30 minutes pour les stériliser et rincez-les avec de l'eau propre abondante pour enlever tout agent neutralisant restant.

3. Extraction d'acide nucléique

REMARQUE : Utilisez des gants et portez toujours des lunettes de protection pendant la procédure d'extraction de l'acide nucléique.

  1. Opération pipette magnétique
    1. Familiarisez-vous avec le fonctionnement de la pipette magnétique avant d'effectuer l'extraction.
  2. Extraction d'acide nucléique
    1. Disposer les tubes contenant les réactifs nécessaires à l'extraction dans un rack, de gauche à droite : tampon de liaison, tampons de lavage et tampon d'élution. Définir le nombre approprié de tubes en fonction du nombre d'échantillons ou de répliques analysés.
    2. Transférer 1 ml de concentré d'échantillon dans le tube contenant le tampon de liaison, à l'aide d'une pipette Pasteur jetable. Inverser le tube 8x à 10x pour homogénéiser la solution.
    3. Incuber la solution à température ambiante pendant 10 min tout en mélangeant continuellement, soit à l'aide d'une orbitale solaire, soit manuellement.
    4. Recueillir les particules magnétiques à l'aide de la pipette magnétique et une pointe propre, qui peut être réutilisée pour les trois tampons de lavage.
    5. Relâchez les particules magnétiques dans le tube contenant 500 l de tampon de lavage 1. Lavez-les en secouant doucement la solution avec la pointe pendant 30 s et collectez-les.
    6. Transférer les particules magnétiques dans le tube contenant 600 l de tampon de lavage 2. Lavez-les en secouant doucement la solution avec la pointe pendant 30 s et collectez-les.
    7. Transférer les particules magnétiques dans le tube contenant 200 l de tampon de lavage 3. Lavez-les en secouant doucement la solution avec la pointe pendant 30 s et collectez-les.
    8. Relâchez les particules magnétiques dans le tube contenant le tampon d'élution et jetez la pointe.
    9. Incuber la solution à température ambiante pendant 5 min tout en mélangeant continuellement, en utilisant l'orbitale solaire.
      REMARQUE : Le mélange des particules magnétiques dans le tampon d'élution est une étape cruciale. En cas d'absence d'orbitale, mélanger continuellement à la main pendant le temps d'incubation.
    10. Remplacez la pointe de la pipette magnétique par une nouvelle et collectez les particules magnétiques du tampon d'élution. Assurez-vous d'enlever complètement les particules magnétiques du tampon d'élution, car elles peuvent interférer avec les méthodes de détection moléculaire.
    11. Jetez la pointe avec les particules qui y sont attachées. Procédez à l'analyse PCR, expédions le tampon d'élution à un laboratoire de référence, ou stockez le tampon d'élution à 4 oC pour une analyse plus approfondie.

4. Détection virale à l'aide d'un thermocycleur en temps réel à huit tubes à piles

REMARQUE : Utilisez des gants et portez toujours des lunettes de protection pendant la procédure de détection de l'acide nucléique. Remplacez les gants pour les nouveaux lors de l'exécution d'une nouvelle expérience PCR pour éviter la contamination croisée.

  1. HAdV quantitative PCR
    1. Ajouter 14 ll d'eau sans nucléane aux tubes 2, 4 et 5.
    2. Ajouter 4 ll de mélange PCR dans les tubes 1-5.
    3. Ajouter 14 L d'extraction d'acide nucléique de l'échantillon A au tube 1 et 14 L de l'échantillon B au tube 3.
    4. Ajouter 2 ll d'acides nucléiques extraits de l'échantillon A au tube 2 et 2 L de l'échantillon B au tube 4. Fermez la bande à cinq tubes.
    5. Ajouter 14 ll d'eau sans nucléane aux tubes 6, 7 et 8.
    6. Ajouter 4 ll de ce mélange dans les tubes 6, 7 et 8, et les fermer.
    7. Mettre les deux bandes dans le thermocycler et sélectionner la course appropriée (tableau 3).
    8. Jeter le tube d'eau et garder l'acide nucléique extrait dans le congélateur, si possible, ou, si ce n'est pas le cas, dans un endroit frais protégé de la lumière au cas où un deuxième essai doit être effectué.
    9. Nettoyez les micropipettes, la grille, le matériel de travail et tout le matériel correctement avec un nettoyant à l'acide nucléique, et jetez le sac en plastique contenant la pointe utilisée, les gants et les tubes.
      CAUTION: Démaquillant d'acide nucléique est un liquide très inflammable et de la vapeur. Ne respirez pas la brume de pulvérisation et évitez tout contact du liquide avec les yeux ou la peau. Sinon, rincez immédiatement avec de l'eau abondante et consultez un médecin.
    10. Recueillir les résultats et analyser les données obtenues.
  2. MS2 PCR quantitatif
    1. Ajouter 14 ll d'eau sans nucléane aux tubes 2, 4 et 5.
    2. Ajouter 4 L de mélange PCR et 0,5 l d'enzyme de transcriptase inversée dans les tubes 1-5.
    3. Ajouter 14 L d'extraction d'acide nucléique de l'échantillon A au tube 1 et 14 L de l'échantillon B au tube 3.
    4. Ajouter 1 l d'acides nucléiques extraits de l'échantillon A au tube 2 et 1 L de l'échantillon B au tube 4. Fermez la bande à cinq tubes.
    5. Ajouter 15,5 l d'eau sans nucléane dans les tubes 5, 6, 7 et 8, et les fermer.
    6. Ajouter 4 ll de mélange PCR et 0,5 l d'enzyme de transcriptase inversée aux tubes 6, 7 et 8.
    7. Mettre les deux bandes dans le thermocycler et sélectionner la course appropriée (tableau 3).
    8. Procédez comme décrit dans les étapes 4.1.8 à 4.1.10.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Développement de méthodes

Cette procédure a été développée dans le Laboratoire des virus contaminants de l'eau et de l'alimentation avec la collaboration de GenIUL et d'Oxfam Intermon. Il se compose de trois étapes différentes. La première, la concentration virale de particules, est une adaptation d'une méthode de flocculation du lait écrémé précédemment décrite12,

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La méthode VirWaTest permet la concentration de virus et l'extraction d'acide nucléique à partir d'échantillons d'eau au point d'utilisation par des utilisateurs non expérimentés. Il s'agit d'un protocole abordable, rapide et simple. La concentration est basée sur le principe de la flocculation organique à l'aide de lait écrémé, par lequel le pH faible et les conditions de conductivité élevée font des protéines de lait écrémés agréger en flocs les virus adsorb à. Lorsque les flocs se sédimentent, il est facile de les rec...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

VirWaTest était un projet de recherche financé par le programme HIF (Fonds humanitaire d'innovation) de l'ELHRA (Améliorer l'apprentissage et la recherche pour l'aide humanitaire). Les auteurs reconnaissent les équipes wash qui ont gentiment collaboré à cette étude. L'analyse des échantillons en Equateur a été financée par Oxfam Equateur et Direccion de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT.17.01). S. Bofill-Mas est boursier Serra-Hunter à l'Université de Barcelone.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)Solis BioDyne08-14-00001Comprend la sonde 5x HOT FIREPol de Solis Biodyne qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 réactions
bandelettes de microtubes avec capuchonsdD Biolab840637profil bas, parois minces, adaptées pour les batteries PCR quantitatives et
qualitatives et adaptateurs d’alimentation pour agitateur magnétiqueGenIUL900011674Comprend une alimentation de voiture 12V
adaptateur Support de godetGenIUL900011648Support en aluminium
Godet, 10 LCater4You10LTRPolypropilène, inviolable, couleur claire
Tube à centrifuger, 50 mLLabBoxCTSP-E50-050Polypropylène, stérile, gradué, avec jupe
Acide citrique 1-hydrate, 500 gPanReac AppliChem1410181211pur, qualité pharmaceutique, 1 kilogramme
Bouteille en PET transparentLabBoxFPET-500-088Couleur transparente, PET, Bouchon non inclus
Lait écrémé Difco, 500 gBecton Dickinson232100
Bouclier d’ADN/ARN déshydraté, 250 mLZymo ResearchR1100-250Milieu de préservation de l’ADN/ARN, 250 mL
Contrôleur de pipette Easy9LabBox EAS9-001-0010,3 &mu ; m filtre, Pipettes de 0,1 à 100 mL, Porte-pipette en silicone autoclavable
Eppendorf Tube, 0,5 mLEppendorf0030121023Polypropilène, Safe-Lock
Eppendorf Tube Eppendorf, 2 mLEppendorf0030120094Polypropilène, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5 mLdD Biolab999542Polypropylène, stérile, Éthanol gradué
96 % V/V, 1 LPanreac AppliChem361085-1611de laboratoire UV, IR et HPLC
LabBoxFORS-007-002Extrémité mince, incurvée, L= 120 mm
Agitateur magnétiqueGenIUL900017000Marqueur à batterie
dD Biolab929203Noir, Pointe extra fine, Résistant à l’eau, Séchage rapide, Pour plastique et verrerie
Micro Rota-rack pour microtubesdD Biolab377824 modules, L x l x H= 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Cycler PCR en temps réelCoyote Biosciences, ChineMini-8Portable, Fonctionne avec des alimentations 12V ou des batteries externes, Deux canaux, Capacité pour 8 tubes
Tampon de lyse NucliSensBiomérieux200292réactifs pour jusqu’à 48 isolations, Stocker à température ambiante
Pipette sérologique à pointe ouverte, 10 mLDeltalab900136NStérile, emballé individuellement (papier/plastique)
Bouchon à vis en PE PP28LabBoxTP28-004-020Pour bouteilles en PET
Bandelette indicatrice de pHLabBoxWSPH-001-001Plage de pH 2,8 à pH 4,4, 50 bandelettes par paquet
Tube à essai en plastiqueQuimikals300913Comprend un capuchon
Pipette en polyéthylène PasteurLabBoxPIPP-003-500Grauée, volume total de 7 ml, Fiole à vis en
polypropylène non stérile avec bouchon à vis, 150 mLDeltalab409726Bouchon à vis, stérile, gradué jusqu’à 100 mL
Flacon à vis en polypropylène avec bouchon à vis, 60 mLDeltalab409526GBouchon à vis, stérile, gradué jusqu’à 50 mL
Détergent en poudre en poudre--Savon en poudre ordinaire pour laver les vêtements
Câbles d’alimentation pour agitateur magnétiqueGenIUL900011692Connexion entre piles et agitateurs magnétiques
Outil magnétique QuickPickBioNobile24001Outil portatif pour particules magnétiques
Embouts QuickPick en boîteBioNobile24296Sans RNase, autoclave, 96 unités
QuickPick XL Particules magnétiques d’ADNgBioNobileSN511003,2 mL
Sels de merSigma-AldrichS9883-500GUn mélange de sels artificiels ressemblant étroitement à la composition des sels dissous de l’eau de mer
Tube en siliconeLabBoxSILT-006-005Rouleau de 5 mètres, Intérieur ø ; x Extérieur  ; ø ;= 6 x 10 mm
Granulés d’hydroxyde de sodium, 98,5 - 100,5 %VWR Produits chimiques28244295granulés, 1 kg
Plate-forme rotative solaireSOL-EXPERT Group70020Plaque acrylique, 10 tr/min, prend en charge jusqu’à 300 grammes
SOLIScript Kit de sonde en 1 étapeSolis BioDyne08-57-00250Comprend le mélange de sondes 5x One-Step de Solis Biodyne (mélange qPCR) et 40x One-Step SOLIScript Mix (enzyme de transcriptase inverse), 250 réactions
Kit d’extraction de virus ARN SPEEDTOOLSBioTools21.141-4197Comprend le tampon BAW (tampon de lavage 1), le tampon BAV3 (tampon de lavage 2 et 3) et le tampon BRE (tampon d’élution) de BioTools.
SpinBar Octhaedral Stir MagnetdD Biolab045926Pivot Ring, L x  ; ø ; = 38 x 8 mm,
Pipette sérologique bleue à extrémité de ruban, 10 mLDeltalabPN10E1Stérile, emballée individuellement (papier/plastique)
Pipette sérologique à extrémité de ruban, 50 mLDeltalab900043stérile, emballée individuellement (papier/plastique)
Termi-DNA-Tor - Dissolvant d’acidenucléiqueBioTools22001-4291Dissolvant d’acides nucléiques, de bactéries, de champignons et de mycoplasmes de matériaux et de surfaces, 450 mL
Réactif de biologie moléculaire dans l’eau, 1LSigma-AldrichW4502-1LSans nucléases ni protéases, 0,1 &mu ; m Sac
Whirl-Pak filtré, 540 mLDeltalab 200361Fond stable
Zip Lock Plain BagLabBoxBZIP-080-100Polyéthylène, L x l= 120 x 80 mm
8 Pour Pince à épiler

Références

  1. The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
  2. Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
  3. World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
  4. World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
  5. Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
  6. Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
  7. Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
  8. Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
  9. Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
  10. Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
  11. Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
  12. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  13. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
  14. International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
  15. Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
  16. Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
  17. Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
  18. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Détection viraleconcentration viraleextraction d'acides nucléiquesméthode VirWaTestparticules magnétiquesessais PCRadénovirus humainscontrôle MS2
VirWaTest, une méthode de point d'utilisation pour la détection des virus dans les échantillons d'eau
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.