On décrit un modèle d’animal de rongeur simple et fiable pour la stéatohépatite non alcoolisée (NASH), obtenu par le logement non-SPF des animaux et l’administration d’un régime spécifique riche en graisses. Nous décrivons l’identification des sous-ensembles de cellules immunitaires hépatiques et adipeuses pour récapituler les conditions immunologiques humaines en exposant les souris aux germes de l’environnement.
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Article de méthode
Un modèle avancé de murine pour la stéatohépatite non alcoolisée en association avec le diabète de type 2
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’obésité est associée à une inflammation chronique de bas grade et à une résistance à l’insuline, contribuant à une prévalence croissante des maladies métaboliques chroniques, telles que le diabète de type 2 et la stéatohépatite non alcoolisée (NASH). Des recherches récentes ont établi que les cellules immunitaires pro-inflammatoires infiltrent le tissu adipeux hypertrophique obèse et le foie. Compte tenu de l’importance émergente des cellules immunitaires dans le contexte de l’homéostasie métabolique, il est nécessaire de quantifier et de caractériser leur modification au cours du développement du diabète de type 2 et de la NASH. Cependant, les modèles animaux qui induisent des caractéristiques pathophysiologiques typiques de la NASH humaine sont clairsemés.
Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé pour identifier les sous-ensembles de cellules immunitaires isolés du foie et du tissu adipeux dans un modèle de souris fiable de NASH, établi par le logement des souris de régime riche en graisses (HFD) dans des conditions non-spécifiques sans agent pathogène (SPF) barrière pendant au moins sept semaines. Nous démontrons la manipulation des souris dans des conditions non-SPF, la digestion des tissus et l’identification des macrophages, des cellules tueuses naturelles (NK), des cellules dendritiques, des sous-ensembles de cellules B et T par cytométrie en flux. Des diagrammes de cytométrie de flux représentatifs de souris SPF HFD et de souris non-SPF sont fournis. Pour obtenir des données fiables et interprétables, l’utilisation d’anticorps, de méthodes précises et précises pour la digestion tissulaire et la bonne blocage dans les expériences de cytométrie en flux sont des éléments critiques.
L’intervention pour rétablir l’exposition à l’antigène physiologique chez les souris en les abritant dans des conditions non-SPF et une exposition non spécifique aux antigènes microbiens pourrait fournir un outil pertinent pour étudier le lien entre les altérations immunologiques, l’alimentation induite l’obésité et les complications liées à long terme.
Introduction
L’obésité est un trouble multifactoriel et un facteur de risque majeur pour le développement de maladies cardiaques, accident vasculaire cérébral, stéatohépatite non alcoolisée (NASH), diabète de type 2 (Diabetes) et certains types de cancer. La prévalence de l’obésité augmente rapidement à l’échelle mondiale. Aujourd’hui, 2,1 milliards personnes, soit près de 30% de la population mondiale, sont obèses ou en surpoids1. La résistance à l’insuline associée à l’obésité peut conduire à un diabète, lorsque les cellules bêta des îlots pancréatiques épuisés ne parviennent pas à compenser le besoin accru d’insuline pour maintenir l’homéostasie du glucose2.
Le tissu adipeux est composé de divers types de cellules, y compris les adipocytes, les cellules endothéliales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Pendant la progression de l’obésité, les changements dans le nombre et l’activité des cellules immunitaires peuvent conduire à une inflammation de bas grade du tissu adipeux hypertrophique3,4. Plus précisément, il a été constaté que la consommation excessive d’énergie, accompagnée de niveaux chroniquement élevés de glucose sanguin, de triglycérides et d’acides gras libres, conduit à l’hypoxie adipocytes, au stress du réticulum endoplasmique, à la fonction mitochondriale altérée et sécrétion de cytokine améliorée, entraînant l’activation de cellules immunitaires adipeuses pro-inflammatoires5,6. Les recherches passées ont principalement porté sur l’immunité innée, mais plus récemment, les cellules immunitaires adaptatives (cellules T et B) sont apparues comme des régulateurs importants de l’homéostasie du glucose. Ils possèdent des fonctions inflammatoires (y compris les cellules t+ 1 + t, les cellules r et B) ou principalement des tâches régulatrices (y compris les cellules t (Treg) régulatrices, les cellules de la cellule) et peuvent à la fois exacerber ou protéger contre la résistance à l’insuline7,8 , le 9.
En outre, plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer comment l’obésité augmente la stéatohépatite, y compris une augmentation de la production de cytokines par le tissu adipeux10. La Nash, la forme progressive de la maladie du foie gras non alcoolisée et une lourde charge sanitaire dans les pays développés, est histologiquement caractérisée par des hépatocytes gonflé, l’accumulation de lipides, la fibrose et l’inflammation péricellulaire et peut progresser vers une cirrhose, une maladie hépatique de stade final ou un carcinome hépatocellulaire. Plusieurs régimes (par exemple le régime de méthionine et de choline déficient11) sont connus pour induire la pathologie hépatique de Nash-like dans des modèles animaux non-humains, mais la plupart de ces approches ne récapitulent pas les conditions humaines de la Nash et de son métabolisme conséquences, car elles nécessitent soit une élimination génique spécifique, des manipulations diététiques non physiologiques, soit un manque de résistance à l’insuline typique de la NASH humaine. En outre, notre compréhension des mécanismes sous-jacents des maladies métaboliques est actuellement basée sur des expériences réalisées avec des souris de laboratoire hébergées dans des conditions spécifiques à l’agent pathogène (SPF) standard. Ces installations barrières sont anormalement hygiéniques et ne considèrent pas la diversité microbienne que les humains doivent rencontrer, ce qui peut expliquer les difficultés du processus de traduction des études animales aux approches cliniques12,13 , le 14.
Pour étudier les différents sous-ensembles de cellules immunitaires dans le tissu adipeux et le foie pendant le développement de la résistance à l’insuline et de la NASH dans un modèle avancé de souris reproduisant des conditions immunologiques humaines, des souris ont été logées dans des cages individuelles en semi stérile conditions sans barrière. Les souris logées dans des conditions exposées à l’antigène ont développé une pathologie hépatique similaire à celle de NASH après 15 semaines d’alimentation en graisses (HFD)13. Comparativement aux souris fps appariées par âge, ils ont développé une stéatose macrovésiculaire, une infiltration hépatique et l’activation des cellules immunitaires.
Ce manuscrit décrit une analyse de cytométrie de flux robuste pour définir et compter les sous-ensembles de cellules immunitaires du tissu adipeux de souris et du foie dans un modèle de NASH. L’analyse de la cytométrie en flux permet la détection simultanée de plusieurs paramètres de cellules individuelles, contrairement aux approches RT-PCR ou immunohistochimie.
En résumé, notre étude offre un modèle de souris de HFD à court terme pour étudier le développement de la résistance à l’insuline et de la NASH et les mécanismes sous-jacents qui présente également la fidélité à la condition humaine.
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Protocole
Cette étude a été réalisée conformément au guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des instituts nationaux de la santé et de la Loi sur le bien-être des animaux, sous la supervision de notre Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Les protocoles sur les animaux ont été conduits conformément aux directives éthiques institutionnelles de la charité Berlin, en Allemagne, et ont été approuvés par le Landesamt für Gesundheit und Soziales et sont conformes aux directives d’arrivée.
1. modèle animal de stéatohépatite induite par le régime alimentaire
- Transférer les souris (C57Bl/6J, mâle) à un logement non-SPF à l’âge de 4 semaines et les exposer continuellement à un large éventail de pathogènes/antigènes environnementaux. Garantir l’exposition par la manipulation quotidienne des animaux de laboratoire que les antigènes sont distribués par le passage de l’air de cette façon.
- Maintenir les souris (C57Bl/6J, mâle, 12 semaines) dans des systèmes de cage ouverts avec des filtres conventionnels sur un cycle de 12 h:12 h lumière/obscurité à une température de 22 ° c. Ne pas irradier ou autoclave régime expérimental et la literie. Accès à l’installation de logement des animaux sans masque ni filet de cheveux. Portes ouvertes entre les chambres d’animaux. N’utilisez pas de douche à air.
- Garantir la manutention quotidienne des animaux de laboratoire et des salles de commutation sur une base régulière afin que les antigènes soient distribués par passage d’air. Compléter le logement sale avec une exposition microbienne quotidienne non spécifique aux antigènes de la litière des animaux de laboratoire de mammifères logés dans des chambres à côté des souris de laboratoire.
- Mesurez les proportions de la mémoire CD44-CD62L- effecteur CD4+ et des cellules T+ + T dans le sang et la rate en utilisant la cytométrie en flux (comme décrit dans refefence13).
Remarque: À cet égard, nous avons défini une augmentation de 20% de la mémoire effectrice de cellules t+ t à partir de cellules de t+ t comme preuve d’une exposition microbienne suffisante. - Commencer HFD (60 kJ% de lipides, 19 kJ% de protéines et 21 kJ% de glucides et la consommation d’eau ad libitum avec 6% de saccharose avec des souris mâles C57Bl/6J âgées de cinq semaines pendant 7-15 jours. Le HFD devrait contenir 60% kJ de graisse (comme décrit ci-dessus) afin d’induire le développement de la résistance à l’insuline tout au long de l’expérience.
Remarque: La coloration de l’hématoxyline doit être effectuée et les caractéristiques histologiques comme le ballonnement des hépatocytes, les corps de Mallory Denk, l’infiltration des cellules immunitaires et la stéatose macrovésiculaire doivent être trouvés pour démontrer la pathologie hépatique de la NASH (comme indiqué dans la référence 13).
2. préparation des réactifs et des solutions
- Préparer 70% d’éthanol, une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, sans calcium et magnésium) additionnée de 0,5% de BSA et de tampon de lyse (chlorure d’ammonium et de potassium).
-
Tampon de coloration
- Dissoudre 10 mL de sérum de veau fœtal (FCS) dans 500 mL de PBS pour obtenir 2% de PBS de FCS. Placez le tampon de coloration sur la glace avant utilisation.
- Stocker la solution dans une bouteille en plastique à 4 ° c.
-
Solution de collagénase pour la digestion des tissus adipeux
- Dissoudre 2,5 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans 500 mL de PBS pour obtenir un 0,5% de BSA/PBS.
- Dissoudre 74,5 g de CaCl2 dans 10 mL de 0,5% BSA/PBS pour obtenir une solution CaCl2 de 10 mm.
- Ajouter 1 mg de collagénase de type II (voir tableau des matériaux) à chaque mL de 0,5% de BSA avec 10 mm de CaCl2 PBS.
- Préparer 3 mL de solution de synthèse de collagénase par g d’échantillon de tissu adipeux. Préparez une solution de collagénase fraîche pour chaque isolement.
-
Collagenase solution pour la digestion des tissus hépatiques
- Dissoudre 2,5 g de BSA dans 500 mL de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) pour obtenir 0,5% de BSA HBSS.
- Ajouter 10 mL de FCS dans 500 mL de 0,5% de BSA/HBSS pour obtenir 2% de FCS 0,5% de BSA/HBSS.
- Ajouter 0,5 mg de collagénase de type IV (voir tableau des matériaux) à chaque ml de 2% de FCS 0,5% de BSA/HBSS.
- Ajouter 0,02 mg de DNase par mL de solution de collagénase de 2% FCS 0,5% de BSA/HBSS.
- Préparer 13 mL de solution de digestion par collagénase par échantillon de tissu hépatique.
- Préparez une solution de collagénase fraîche pour chaque isolement.
3. génération de suspensions à cellule unique
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Digestion tissulaire adipeuse
- Euthanasier les souris par anesthésie isoflurane suivie d’une dislocation cervicale. Vaporisez la poitrine avec 70% d’éthanol. Faites soigneusement une incision centrale de 5-6 cm à travers le tégument et la paroi abdominale sur toute la longueur de la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale et le cœur.
Remarque: Ne pas endommager les organes sous-jacents et garder les pointes de ciseaux vers le haut. - Injecter au moins 10 mL de solution saline à 0,9% dans l’apex du ventricule gauche à l’aide d’une aiguille de 26 G.
Remarque: La perfusion réussie est notée par blanchiment du foie. - Ouvrez la cavité péritonéale avec des ciseaux et découpez les tampons de graisse perigonadal de chaque côté avec de fines ciseaux incurvés. Disséquer les tissus gonadiques avec de fines ciseaux incurvés et peser le tissu adipeux.
- Effectuer la dissociation mécanique à l’aide de ciseaux et couper le tissu adipeux en morceaux fins dans une boîte de Petri à 4 ° c. Transférer le tissu adipeux à 50 mL de tubes à centrifuger coniques et rincer la boîte de Petri avec 1 mL de 0,5% de BSA/PBS.
- Ajouter 3 mL de solution de synthèse tissulaire adipeuse (préparée à l’étape 2,3) par gramme de tissu adipeux. Incuber la solution de tissu adipeux à 37 ° c pendant 20 min sous agitation douce (200 tr/min).
- Ajouter 5 mL de 0,5% de BSA/PBS par gramme de tissu adipeux et placer sur la glace. Triturer la solution de nombreuses fois avec une pipette sérologique de 10 mL et la passer à travers un tamis (100 μM) à l’aide d’un piston.
- Centrifuger à 500 x g pendant 10 min à 4 ° c.
- Retirer la fraction adipocytaire flottante par pipetage. Resuspendre le culot cellulaire (fraction vasculaire stromale) dans 1 mL de tampon de lyse ACK (voir tableau des matériaux). Ajouter 10 mL de 2% FCS PBS.
- Centrifuger à 500 x g pendant 10 min à 4 ° c.
- Décanter le surnageant et Resuspendre le culot cellulaire en 250 μL de 2% FCS PBS.
- Comptez le nombre de cellules viables sur un hémocytomètre à l’aide de l’exclusion bleue de trypan.
- Euthanasier les souris par anesthésie isoflurane suivie d’une dislocation cervicale. Vaporisez la poitrine avec 70% d’éthanol. Faites soigneusement une incision centrale de 5-6 cm à travers le tégument et la paroi abdominale sur toute la longueur de la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale et le cœur.
-
Digestion tissulaire du foie
- Stocker le foie dans un tube de centrifugation conique rempli de PBS et transporter sur la glace.
- Effectuer la dissociation mécanique à l’aide de tampons de seringues dans une boîte de Petri à 4 ° c. Mettre le tissu hépatique disséqué dans un tube de centrifugation conique de 50 mL contenant 10 mL de solution tiède de digestion du foie. Rincer la boîte de Petri avec 3 mL de solution de digestion du foie.
- Incuber la solution de tissu hépatique à 37 ° c pendant 20 min sous agitation douce (200 tr/min).
- Ajouter 20 mL de HBSS. Triturer la solution de nombreuses fois avec une pipette sérologique de 10 mL et la passer à travers un tamis (100 μM) à l’aide d’un piston.
- Centrifuger à 500 x g pendant 10 min à 4 ° c. Décanter le surnageant et Resuspendre le culot cellulaire dans 20 mL de HBSS.
- Centrifuger à 30 x g pendant 1 min à température ambiante pour éliminer la matrice des hépatocytes. Jetez le culot de la cellule.
- Centrifuger le surnageant à 500 x g pendant 10 min à 4 ° c. Résuspendez le culot dans 10 mL de solution moyenne de gradient de densité à faible viscosité de 33% (voir tableau des matériaux) dans HBSS suivie d’une centrifugation (800 x g; 30 min; température ambiante; pas de frein).
- Résuspendez le culot dans 1 mL de tampon de lyse ACK et incubez pendant 4 min à température ambiante. Ajouter ensuite 10 mL de HBSS.
Remarque: Pour jeter le surnageant aspirer le surnageant avec interphase (hépatocytes) très soigneusement avec une pipette de transfert (autant que possible sans prendre le culot avec les cellules immunitaires et les érythrocytes). - Passer les cellules à travers une passoire de 30 μm dans un tube de centrifugation conique de 15 mL et centrifuger à 500 x g pendant 10 min à 4 ° c. Décanter le surnageant et Resuspendre le culot cellulaire en 250 μL de 2% FCS PBS.
- Comptez le nombre de cellules viables sur un hémocytomètre à l’aide de l’exclusion bleue de trypan.
4. coloration de surface
- Préparer le mélange d’anticorps pour les sous-ensembles de lymphocytes T (Panel 1) et les cellules immunitaires innées (Panel 2), comme décrit dans le tableau 1 et le tableau 2. Les volumes sont optimisés pour un échantillon (100 μL) en ce qui concerne les concentrations d’anticorps.
Remarque: Les lymphocytes et les cellules immunitaires innées présentent des différences d’autofluorescence et doivent être analysés séparément. - Utiliser jusqu’à 3 x 106 cellules dans 100 μl dans un tube en polystyrène FACS pour la coloration de surface. Pour bloquer les récepteurs FC, ajouter 10 μL d’anticorps anti-CD16/CD32 (dilué 1:100) et incuber pendant 10 min sur la glace. Utilisez un échantillon de contrôle négatif non teinté pour ajuster la dispersion latérale (SSC) et la dispersion vers l’avant (FSC) pour déterminer l’emplacement de la population de cellules négatives.
- Vortex et ajouter le volume approprié de mélange d’anticorps pour le Panel 1 et le Panel 2. Ajouter 1 μL de colorant de viabilité à chaque échantillon pour permettre la discrimination des cellules vivantes et mortes. Incuber pendant 20 min à 4 ° c et à l’abri de la lumière.
- Laver deux fois avec 2 mL de 2% FCS PBS et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 ° c.
- Resuspendre le culot cellulaire en 300 μL de 2% FCS PBS et conserver à 4 ° c jusqu’à l’analyse FACS.
Remarque: Avant de commencer les cellules de passage de mesure à travers un tamis de 30 μm dans le tube FACS de polystyrène et le vortex. La cytométrie en flux a été réalisée avec des cellules étiquetées stockées dans 2% FCS PBS à 4 ° c pendant 1-3 h. les cellules doivent être analysées dès que possible pour optimiser les résultats.
5. compensation de cytométrie en flux, acquisition et gating
- Exécuter un échantillon de contrôle négatif non teinté pour définir le FSC et le SSC et ajuster les tensions du cytomètre de flux pour détecter les populations de leucocytes et pour distinguer entre les débris et les cellules viables. Exclure les débris et les cellules mortes.
Remarque: La viabilité des suspensions cellulaires du foie pourrait être inférieure à la viabilité des suspensions cellulaires du tissu adipeux perigonadal en raison d’une étape supplémentaire de séparation de la densité. - Exécuter des échantillons de contrôle teinté unique pour la compensation multi-couleurs.
Remarque: Des billes de capture d’anticorps pourraient également être employées pour ajuster pour le chevauchement spectral si le nombre de cellules d’une population d’intérêt de cellule est trop faible pour compenser utilisant des cellules. Pour détecter les signaux d’autofluorescence possibles des cellules fluorescence moins un (FMO) des contrôles pour chaque anticorps sont recommandées mais n’ont pas été appliquées dans ce protocole. - Commencez la mesure, collectez le nombre approprié d’événements (au moins 50 000 événements) et enregistrez des données expérimentales.
- Exportez les fichiers de données FCS pour l’analyse et définissez la stratégie de blocage. Porte sur CD45+ leucocytes pour identifier les populations cellulaires ultérieures.
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Résultats
Le protocole décrit permet de caractériser les marqueurs de surface des cellules immunitaires innées et adaptatives isolées du tissu adipeux périigonadique murin et du foie dans un modèle de NASH induite par le régime alimentaire. Dans ce modèle, la NASH a été induite par l’administration de HFD plus de saccharose (6%) dans l’eau potable pendant 7 à 15 semaines chez les souris C57Bl/6J, comme indiqué précédemment13. Il est important de noter que les souris ont été logées dans des conditions semi s...
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Discussion
La stéatohépatite a une forte association avec des anomalies métaboliques telles que l’obésité, la résistance à l’insuline et la dyslipidémie15. Plusieurs études indiquent que l’inflammation tissulaire adipeuse peut conduire la pathogenèse du diabète de type 2, y compris les niveaux altérés des cellules du système immunitaire inné et adaptatif4,5,16,17 . En outre, il a é...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte et Cornelia Heckmann pour leur aide aux procédures expérimentales et Benjamin tiburzy de biolegend pour des commentaires utiles sur la stratégie de blocage. J.S. a été soutenue par la bourse Helmholtz (ICEMED). Cette étude a été soutenue par des subventions de l’unité de recherche clinique de l’Institut de santé de Berlin (BIH), le «BCRT-Grant» par le ministère fédéral allemand de l’éducation et de la recherche et la Fondation Einstein. KS-B. et H.-D.V. sont financés par FOR2165.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 100 et micro ; crépines à cellules M ; | Falcon | 352340 | |
| Seringue de 1 mL | BD ; ; | ||
| aiguilles 26 G x 5/8 | BD ; | ||
| boîtes de Pétri de 35 mm ; | Faucon | 353001 | |
| 40 & micro ; crépines à cellules M ; | Falcon | 352340 | |
| Tampon de lyse ACK ; | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-souris CD45 | Biolegend ; | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. N° 103127) |
| Logiciel d’analyse ; | FlowJo 10.0.8 | ||
| APC anti-souris CD11c Anticorps | Biolegend ; | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. N° 117309) |
| Biolegend de l’anticorps anti-souris APC KLRG1 (MAFA) | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. N° 138411) | |
| BV421 anti-souris CD127 | Biolegend ; | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. N° 135023) |
| BV421 anti-souris F4/80 Anticorps | Biolegend ; | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. N° 123131) |
| BV605 anti-souris CD279 (-1) | Biolegend ; | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. N° 135219) |
| BV605 anti-souris NK-1.1 | Biolegend ; | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. N° 108739) |
| BV650 anti-souris/anticorps CD11b humain | Biolegend ; | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. N° 101239) |
| BV711 anti-souris/humain B220 | Biolegend ; | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. N° 103255) |
| BV785 anti-souris CD8a | Biolegend ; | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. N° 100749) |
| C57Bl/6J souris, mâles, 5 semaines ; | Forschungseinrichtungen fü ; r experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 ; | Charité ; - Universitä ; tsmedizin Berlin | A119.1 ; | |
| Collagénase NB 4G Grade prouvé ; | SERVA ; | ||
| Collagénase Typ | Worthington ; | ||
| Tube à centrifuger conique 15mL ; | Falcon | 352096 | |
| Tube à centrifuger conique 50 mL ; | Falcon | 352070 | |
| DNAse ; ; | Sigma-Aldrich ; | ||
| sérum fœtal bovin ; | Biochrom | S0115 | |
| Filtre 30µ ; m ; | Celltrique ; | ||
| FITC anti-anticorps CD3 de souris | Biolegend ; | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. N° 100203) |
| Cytométrie en flux ; | BD-LSR Fortessa ; | ||
| Forceps ; | Sigma-Aldrich ; | F4142-1EA | |
| HBSS ; | GmBH bioanalytique ; | 085021-0500 ; | |
| Régime riche en graisses ; | SSNIF | E15741&ndash ; 34 ; | 60 kJ % de matières grasses, 19&thinsp ; kJ % de protéines, et 21&thinsp ; kJ % de glucides |
| micro ciseaux de dissection ; | Sigma-Aldrich ; | S3146 | utilisé à des fins de dissection ; |
| Biographie de l’anticorps CD25 anti-souris PE | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. N° 101903) | |
| Anticorps anti-souris CD62L PE/Cy7 | Biolegend ; | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. N° 104417) |
| Anticorps anti-souris I-A/I-E (MHCII) | Biolegend ; | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. N° 107629) |
| PE/Dazzle 594 Anti-souris CD4 | Biolegend ; | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. N° 100565) |
| Solution Percoll ; | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anticorps anti-souris CD44 | Biolegend ; | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. N° 103031) |
| Anticorps anti-souris Gr-1 PerCP/Cy5.5 | Biolegend ; | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. N° 108427) |
| Saline tamponnée au phosphate | Gibco | 12559069 | |
| Tubes à fond rond avec capuchon de crépine de cellules | STEMCELL Technologies ; | 38030 | |
| TruStain fcX anti-souris CD16/32 | Biolegend ; | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. N° 101301) |
| Trypan Blue ; | Sigma-Aldrich ; | T6146 | |
| Zombie NIR Kit de viabilité fixable | Biolegend ; | 423105 | tache de viabilité ; |
Références
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