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Article de méthode

Inactivation chimique de l'E3 Ubiquitin Ligase Cereblon par des Homo-PROTAC à base de Pomalidomide

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DOI :

10.3791/59472

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15 mai 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce travail décrit la synthèse et la caractérisation d'un homo-PROTAC bifonctionnel à base de pomalidomide comme une nouvelle approche pour induire l'ubiquitination et la dégradation du cereblon de ligase d'ubiquitine E3 (CRBN), la cible des analogues de la thalidomide.

Résumé

Les médicaments immunomodulatoires (IMiDs) thalidomide et ses analogues, lénalidomide et pomalidomide, tous les médicaments approuvés par la FDA pour le traitement du myélome multiple, induire l'ubiquitination et la dégradation des facteurs de transcription lymphoïde Ikaros (IKZF1) et Aiolos (IKZF3) via le cereblon (CRBN) E3 ubiquitin ligase pour la dégradation protéasomal. IMiDs ont récemment été utilisés pour la génération de chiolyse bifonctionnelle ciblant les chimères (PROTACs) pour cibler d'autres protéines pour l'ubiquitination et la dégradation protéasomal par la ligase CRBN E3. Nous avons conçu et synthétisé des PROTAC homobifonctionnels à base de pomalidomide et analysé leur capacité à induire l'ubiquitination autodirigée et la dégradation de CRBN. Ici, CRBN sert à la fois, la ligase d'ubiquitine E3 et la cible en même temps. Le composé homo-PROTAC 8 dégrade CRBN avec une puissance élevée avec seulement des effets restants minimes sur IKZF1 et IKZF3. L'inactivation de CRBN par le composé 8 n'a eu aucun effet sur la viabilité et la prolifération de cellules multiples différentes. Cet homo-PROTAC abroge les effets des IMiD dans plusieurs cellules de myélome. Par conséquent, nos composés homodimériuns à base de pomalidomide peuvent aider à identifier les substrats endogènes et les fonctions physiologiques de CRBN et à étudier le mécanisme moléculaire des MiD.

Introduction

Les médicaments immunomodulateurs (IMiDs) thalidomide et ses analogues, lénalidomide et pomalidomide, tous approuvés pour le traitement du myélome multiple, se lient à l'E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN), un adaptateur de substrat pour cullin4A-RING E3 ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. La liaison des IMiD améliore l'affinité du CRL4CRBN aux facteurs de transcription lymphoïde Ikaros (IKZF1) et Aiolos (IKZF3), conduisant à leur ubiquitination et dégradation (Figure 1)4,5, 6 Annonces , 7 Annonces , 8. Puisque IKZF1 et IKZF3 sont essentiels pour les cellules de myélome multiples, leur inactivation a comme conséquence l'inhibition de croissance. SALL4 a été récemment trouvé comme un néo-substrat iMiD-induit supplémentaire de CRBN qui est probablement responsable de la tératogénicité et la catastrophe dite Contergan dans les années 1950 causée par la thalidomide9,10. En revanche, la caséine 1 (CK1) est un substrat spécifique au lénalidomide de CRBN qui est impliqué dans l'effet thérapeutique dans le syndrome myélodydyplasique avec des suppressions de chromosome 5q11.

La capacité des petites molécules à cibler une protéine spécifique pour la dégradation est une implication passionnante pour le développement de médicaments modernes. Alors que le mécanisme de la thalidomide et de ses analogues a été découvert après leur première utilisation chez l'homme, ce qu'on appelle Proteolyse Targeting Chimeras (PROTACs) ont été conçus pour cibler spécifiquement une protéine d'intérêt (POI) (Figure 2)12,13,14,15,16,17,18. Les PROTAC sont des molécules hétérophobes qui se composent d'un ligand spécifique pour le POI connecté via un linker à un ligand d'une ligase d'ubiquitine E3 comme CRBN ou von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Les PROTAC induisent la formation d'un complexe ternaire transitoire, dirigeant le POI à la ligase d'ubiquitine d'E3, ayant pour résultat son ubiquitination et la dégradation protéasomal. Les principaux avantages des PROTAC par rapport aux inhibiteurs conventionnels sont que la liaison à un POI est suffisante plutôt que son inhibition et, par conséquent, les PROTAC peuvent potentiellement cibler un spectre beaucoup plus large de protéines, y compris celles qui ont été considérées comme non médicamentables comme facteurs de transcription15. En outre, les molécules chimériques agissent catalytiquement et ont donc une puissance élevée. Après le transfert d'ubiquitine au POI, le complexe ternaire se dissocie et est disponible pour la formation de nouveaux complexes. Ainsi, de très faibles concentrations PROTAC sont suffisantes pour la dégradation de la protéine cible23.

Ici nous décrivons la synthèse d'un homo-PROTAC conjugué pomalidomide-pomalidomide (composé 8) qui recrute CRBN pour la dégradation de lui-même24. L'E3 ubiquitine ligase CRBN sert à la fois de recruteur et de cible en même temps (figure 3). Pour valider nos données, nous avons également synthétisé un contrôle de liaison négatif (composé 9). Nos données confirment que l'homo-PROTAC nouvellement synthétisé est spécifique à la dégradation du CRBN et n'a que des effets minimes sur d'autres protéines.

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Protocole

1. Préparation des molécules PROTAC

CAUTION : Veuillez consulter toutes les fiches de données pertinentes sur la sécurité des matériaux (MSDS) avant d'être utilisées. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ces synthèses sont toxiques et cancérigènes. Veuillez utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées et l'équipement de protection individuelle.

  1. Préparation de tert-butyl N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)carbamate (composé 1)
    1. Ajouter 1,1'-carbonyldiimidazole (1.95 g, 12 mmol) et une quantité catalytique de 4-(dimethylamino)pyridine (5 mg) à un mélange de Boc-Gln-OH (2.46 g, 10 mmol) en THF (50 ml) en 100 ml de flacon rond de fond avec une barre d'agitation et équipé d'un reflux condenser. Chauffer au reflux pendant 10 h en remuant jusqu'à ce qu'une solution claire soit formée.
    2. Retirer le solvant sous pression réduite à l'frémisseur rotatif, ajouter EtOAc (200 ml) et le transférer dans un entonnoir séparatif. Laver la couche organique avec H2O (50 ml) et la saumure (50 ml) et la sécher sur Na2SO4.
    3. Filtrer la solution à l'intérieur d'un court bloc de gel de silice (5 cm de diamètre et 5 cm de hauteur) et échapper à un autre volume (200 ml) d'EtOAc.
    4. Évaporer le solvant et sécher le solide incolore obtenu dans le vacuo.
  2. Préparation de tert-butyl N-(1-méthyl-2,6-dioxo-3-piperidyl)carbamate (composé 2)
    1. Mélanger le composé 1 (2,28 g, 10 mmol) avec le carbonate de potassium moulu (2,76 g, 20 mmol) et le DMF (25 ml) dans un flacon rond de 100 ml. Ajouter de l'iodométhane (1,42 g, 0,62 ml, 10 mmol) à l'aide d'une seringue et équiper le flacon d'un septum en caoutchouc perforé. Placer le vaisseau de réaction dans un bain à ultrasonation pendant 2 h.
    2. Diluer le mélange de réaction avec EtOAc (100 ml) et le transférer dans un entonnoir séparatiste. Laver la couche organique avec 1 N NaOH (2x 25 ml), H2O (25 ml), et la saumure (25 ml), et la sécher sur Na2SO4.
    3. Filtrer et évaporer le solvant. Purififier le produit par chromatographie de colonne au-dessus du gel de silice (6 cm de diamètre de colonne et 20 cm de hauteur) en utilisant l'éther/EtOAc de pétrole (2:1).
  3. Préparation de 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-fluoroisoindoline-1,3-dione (composé 3)
    1. Mélanger l'anhydride 3-fluorophthalique (1,25 g, 7,5 mmol), le glutarimide 1 (1,14 g, 5 mmol) et une solution d'acétate de sodium (0,50 g, 6,0 mmol) en acide acétique glaciaire (20 ml) dans un flacon de fond rond de 50 ml avec une barre d'agitation et équipé d'un condenseur de reflux. Chauffer le mélange à 120 oC pendant 6 h.
    2. Après refroidissement, verser le mélange violet sur H2O (100 ml) et remuer pendant 10 min. Recueillir le solide formé par filtration, laver avec H2O (3 x 5 ml) et l'éther de pétrole (3 x 5 ml) et sécher dans le vacuo.
  4. Préparation de 4-fluoro-2-(1-methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline-1,3-dione (composé 4)
    1. Mélanger l'anhydride 3-fluorophthalique (1,25 g, 7,5 mmol), le glutarimide 2 (1,21 g, 5 mmol) et une solution d'acétate de sodium (0,50 g, 6,0 mmol) en acide acétique glaciaire (20 ml) dans un flacon de fond rond de 100 ml avec une barre d'agitation et équipé d'un condenseur de reflux. Chauffer le mélange à 120 oC pendant 6 h.
    2. Après refroidissement, verser le mélange violet sur H2O (100 ml) et remuer pendant 10 min. Recueillir le solide formé par filtration, laver avec H2O (3 x 5 ml) et l'éther de pétrole (3 x 5 ml) et sécher dans le vacuo.
  5. Préparation de tert-butyl N-[2-[2-[2-[2-[2,6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]carbamate (composé 7)
    1. Chargez un flacon de fond rond de 50 ml avec tert-butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate (5, 0,41 g, 1,65 mmol), composé 3 (0,41 g, 1,50 mmol), DMF sec (10 ml) et DIPEA (0,39 g, 0,51 ml, 3,0 mmol). Équiper d'une barre d'agitation et d'un condensateur de reflux. Chauffer sous l'atmosphère d'argon à 90 oC pendant 10 h.
    2. Après refroidissement à température ambiante, verser le mélange vert foncé sur H2O (100 ml) et extraire avec EtOAc (3x 50 ml) dans un entonnoir séparatif. Laver les couches organiques combinées avec H2O (50 ml) et saumure (50 ml), sécher sur Na2SO4, filtrer, et se concentrer dans le vacuo.
    3. Purifiez le produit brut par chromatographie de colonne au-dessus du gel de silice (3 cm de diamètre de colonne et 60 cm de hauteur) en utilisant un gradient d'éther/EtOAc de pétrole (1:1 à 1:2).
  6. Préparation de l'homodimère (composé 8)
    1. Combinez le lien 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), le DIPEA (1,05 ml, 6,00 mmol) et une solution de 3 (0,83 g, 3,00 mmol) dans un DMSO sec (20 ml) dans un flacon rond de 50 ml avec une barre d'agitation et équipé d'un condensateur de reflux. Chauffer sous l'atmosphère d'argon à 90 oC pendant 18 h.
    2. Après refroidissement à température ambiante, verser le mélange vert foncé sur H2O (100 ml) et extraire avec EtOAc (3x 50 ml) dans un entonnoir séparatif. Laver les couches organiques combinées avec H2O (50 ml) et saumure (50 ml), sécher sur Na2SO4, filtrer et se concentrer dans le vacuo.
    3. Purifiez le produit brut par chromatographie de colonne au-dessus du gel de silice (3 cm de diamètre de colonne et 50 cm de hauteur) en utilisant un gradient d'éther/EtOAc de pétrole (1:2) à EtOAc.
  7. Préparation de l'hétérodime (composé 9)
    1. Dissoudre le composé 7 (0,83 g, 1,65 mmol) dans le CHsec 2Cl2 (10 ml). Ajouter l'acide trifluratacétique (10 ml) et remuer le mélange jaune à 40 oC pendant 2 h dans un flacon rond fermé de 50 ml.
    2. Retirer les volatiles et coévaporer avec CH2Cl2 (4x 5 ml). Sécher les résidus dans le vacuo pendant 10 h.
    3. Redissoudre le matériau dans le DMF sec (20 ml). Ajouter le composé 4 (0,44 g, 1,50 mmol) et le DIPEA (0,78 g, 1,05 ml, 6,00 mmol) et équiper le flacon de reflux. Chauffer sous l'atmosphère d'argon à 90 oC pendant 10 h.
    4. Après refroidissement à température ambiante, verser le mélange vert foncé sur H2O (100 ml) et extraire avec EtOAc (3x 50 ml) dans un entonnoir séparatif. Laver les couches organiques combinées avec naHCOsaturé 3 (50 ml), H2O (50 ml), 10 % KHSO4 (50 mL), H2O (50 ml), et saumure (50 ml), sécher sur Na2SO4, filtrer et se concentrer en vacuo.
    5. Purifiez le produit brut par chromatographie de colonne au-dessus du gel de silice (3 cm de diamètre de colonne et 50 cm de hauteur) en utilisant un gradient d'éther/EtOAc de pétrole (1:2) à EtOAc.
    6. Élucider et vérifier la structure des molécules (figure 5A composé 8, 5B composé 9) par 1H NMR et 13Spectres RmN C dans DMSO-d6 sur une résonance magnétique nucléaire (RMN) Spectromètre. Vérifiez que la pureté des deux composés est supérieure à 97 % au moyen de la spectrométrie de masse de chromatographie liquide (LC-MS), appliquant une détection de tableau de diode (DAD) à 220 à 500 nm.

2. Validation fonctionnelle des molécules PROTAC

  1. Analyse de la tache occidentale de la dégradation du CRBN par les PROTAC
    REMARQUE: Les effets du composé8 Annonceset composé9 (en)sur le niveau de protéine de CRBN ont été examinés par l'analyse occidentale de tache. En outre, l'impact sur les niveaux IKZF1 et IKZF3 pourrait également être confirmé (Figure 6).
    1. Préparation de l'échantillon
      1. Dissoudre les composés 8 et 9, le lénalidomide (Len), le pomalidomide (Pom), le MG132 et le MLN-4924 en DMSO à une concentration de 10 mM, aliquot et stocker à -80 oC jusqu'à une utilisation ultérieure.
      2. Seed 1 x 106 MM1S cellules dans une plaque de 6 puits avec 2,5 ml de médias et traiter les cellules avec 100 nM ou 1 composé M 8 ou 9 pour 24 h.
      3. Récolter les cellules après le traitement et la centrifugeuse à 700 x g, 5 min, 4 oC. Laver les granulés de cellules à l'œil de 1x PBS froid pour enlever le support restant, la centrifugeuse à 700 x g, 5 min, 4 oC, et jeter le supernatant. Répétez cette étape une fois.
      4. Cellules lyse dans le tampon de lyse (25 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glycérol, 1x Protease et Phosphatase Inhibitor Cocktail) pendant 10 min sur glace, centrifugeuse à 320 x g pour 10 min, 4 oC. Récolte supernatant et déterminer la concentration de protéines par un test de protéines d'acide bicinchoninique (bcA test) selon le protocole du fabricant.
      5. Dénaturer les protéines (15 à 30 g/échantillon) avec 1 x tampon de chargement LDS (5 % de 2-mercaptoethanol) et faire bouillir 10 min, 75 oC.
    2. SDS-PAGE (en)
      1. Fixer le sandwich au gel avec un gel de séparation de 10 % [4 mL 3x gel tampon (3 M Tris/HCl, 0,3 % (w/v) sulfate de dodecyl de sodium (SDS), pH 8,45), 4 mL d'acrylamide 30 %, 2,52 mL de glycérol 50 %, 1 395 mL H2O, 75 O L 11 % de persulfate d'ammonium (APS) et 9,75 [1,992 mL 3x gel tampon, 0,792 mL 30% acrylamide, 3,168 mL H2O, 36 'L 11% APS, et 6 'L TEMED] dans une unité d'assemblage d'électrodes. Enlever les peignes, rincer les puits avec un tampon cathodique (100 mM Tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1 % (w/v) SDS) et charger des échantillons.
      2. Remplir le tampon d'anode (100 mM Tris/HCl, pH 8,9) dans le réservoir. Chargez l'échantillon de protéines de l'étape 2.1.1.4 et exécutez SDS-PAGE à 70 V, 20 min, suivi de 115 V, 150 min à tension constante.
    3. Immunoblotting et détection de CRBN, IKZF1 et IKZF3
      1. Activer la membrane PVDF (0,45 m) dans 100 % de méthanol pendant 1 min. Membrane equilibrate et gel de séparation dans un tampon de transfert 1x [192 mM de glycine, 25 mM Tris-base/HCl, 900 mL H2O), 20 % méthanol, 0,1 % SDS, pH 8,3].
      2. Assembler la cassette de ballonnement selon le protocole du fabricant. Transférer le gel à 180 mA pendant 90 min.
      3. Laver la membrane 3x en 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1 % Tween 20) pendant 5 à 10 min chacun à température ambiante. Bloquer la membrane dans 5 % de lait non séché aux graisses (NFDM), TBS-T pendant 1 h à température ambiante. Laver la membrane 3x en 1X TBS-T pendant 5 à 10 min chacune à température ambiante.
      4. Incuber la membrane avec l'anticorps primaire pour CRBN (1:500 dans 5% BSA, TBS-T) avec des secousses douces à 4 oC, pendant la nuit.
      5. Laver la membrane 3x en 1X TBS-T pendant 5 à 10 min chacune à température ambiante. Incubate membrane avec anti-souris (1:10.000 dans 5% NFDM, TBS-T) ou anti-lapin (1:5.000 dans 5% NFDM, TBS-T) anticorps secondaires couplés au raifort peroxidase HRP (1 h à température ambiante.)
      6. Laver la membrane 2x en 1X TBS-T pendant 5 à 10 min chacune à température ambiante. Répétez cette étape deux fois avec 1x TBS.
      7. Incuber la membrane pendant 2 min avec la solution de substrat HRP selon les protocoles du fabricant et détecter la chemiluminescence dans un dispositif de détection de chemiluminescence.
      8. Laver la membrane 1x en 1X TBS pendant 5 à 10 min chacune à température ambiante. Pour la libération d'anticorps, la membrane de bande dans le tampon de décapage disponible dans le commerce pendant 15 min. Laver la membrane 3x dans 1X TBS pendant 5-10 min chacun à la température ambiante.
      9. Reblasser la membrane dans 5 % de lait non séché aux graisses, TBS-T pendant 1 h à température ambiante. Laver la membrane 3x en 1x TBS-T pendant 5 à 10 min chacun e à température ambiante et reprobe avec IKZF1, IKZF3 ou tubulin selon l'étape 2.1.3.4.
  2. Expériences de compétition avec MG132, MLN4942 ou pomalidomide
    REMARQUE : Pour confirmer si le CRBN est dégradé par la voie ubiquitine-protéasome, nous avons effectué des expériences de compétition avec l'inhibiteur de protéasome MG132 et un inhibiteur d'enzyme activant de neddylation (NAE) MLN4942 (figure 7).
    1. Seed 1 x 106 MM1S cellules par puits dans une plaque de 6 puits. Cellules de pretreat avec 10 mg MG132, 10 MLN4942, ou lénalidomide (100x), et incuber 1 h à 37 oC, 5 % CO2.
    2. Ajouter 100 nM composé 8 pour 3 h à 37 oC, 5% CO2.
    3. Cellules de récolte pour la tache occidentale selon l'étape 2.1.1.
  3. Tests de viabilité cellulaire dans plusieurs lignées cellulaires de myélome
    REMARQUE : Cet essai est utilisé pour tester l'impact sur la viabilité des cellules et, en outre, contrarier l'effet des MiDI sur plusieurs cellules de myélome par prétraitement des cellules avec le composé 8 (Figure 8, Figure 9A, B).
    1. Seed 5 x 104 MM1S cells per well in a 96-well plate in biological triplicates for viability assay. Pour l'analyse de tache occidentale, graine 1 x 106 cellules MM1S par puits dans une plaque de 6 puits dans les triplicats biologiques.
    2. Traiter les cellules avec DMSO ou 100 nM, 1 M, ou 10 M composé 8, composé 9 ou pomalidomide et incuber pendant 24 h, 48 h, ou 96 h à 37 oC, 5 % CO2. Pour les expériences de sauvetage, traiter les cellules avec 100 nM composé 8 pour 3 h, avant ou après l'ajout de 1 pomalidomide M et couver pendant 96 h.
    3. Mesurer la luminescence de la plaque de 96 puits avec un analyse de viabilité de cellules luminescentes, selon le protocole du fabricant sur un lecteur de plaque ou des cellules de récolte de la plaque de 6 puits pour l'analyse occidentale de tache.

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Résultats

Ici nous avons décrit la conception, la synthèse et l'évaluation biologique d'un PROTAC à base de pomalidomide homodimérique pour la dégradation de CRBN. Notre PROTAC interagit simultanément avec deux molécules CRBN et forme des complexes ternaires qui induit l'auto-ubiquitination et la dégradation protéasomal de CRBN avec seulement des effets restants minimes sur les néo-substrats induits par le pomalidomide IKZF1 ou IKZF3.

Sur...

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Discussion

La conception de ces homo-PROTAC tel que décrit ici pour CRBN repose sur l'affinité spécifique de la pomalidomide à CRBN, qui a été utilisée avec succès dans de nombreux PROTAC hétérofunctional et a abouti au développement de PROTAC 8 comme un très crBN sélectif de grader. La spécificité de notre molécule a déjà été confirmée par des analyses protéomiques24. Pour les KO génétiquement médiatisés, l'exclusion et la validation des effets secondaires est difficile et prend beaucoup de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent pas de conflit d'intérêts financier potentiel.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 et SFB-1074 à J.K.; FOR2372 à M.G.)

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,1'-CarbonyldiimidazoleTCI produits chimiquesC0119
2,2&prime ;-(éthylènedioxy)-bis(éthylamine)Composé 385506 Sigma-Aldrich6
2-mercaptoéthanolSigma-AldrichM6250
3-anhydride fluorophtalique, 98 %Alfa AesarA12275
4-diméthylaminopyridine, 99 %Acros148270250
Acrylamidstammlö ; sung/ Bisacrylamid (30 %/0,8 %)Carl Roth3029.1
Aiolos (D1C1E) mABSignalisation cellulaire15103S
Anticorps anti-CRBN produit chez le lapinSigmaHPA045910
Anticorps anti-IgG HRP de lapinSigma7074S
Persulfate d’ammoniumRoth9592.2
Boc-Gln-OHTCI produits chimiquesB1649
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA7906-100G
CellTiter-Glo Essai de viabilité cellulaire luminescentePromegaG7571
ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
DMF, anhydre, 99,8 %Acros348435000Extra Dry sur tamis moléculaire
DMSO, anhydre, 99,7 %Acros348445000Extra Dry sur Tamis Moléculaire
GlycineSigma-Aldrich15523-1L-R
Chèvre anti-souris (HRP conjugué)Santa Cruz biotechnologiesc-2005
Halt Protéase & Inhibiteur de la phosphatase Cocktail à usage unique (100X)Thermo Scientific1861280
Ikaros (D6N9Y) Signalisation cellulaire Mab14859S
ImmobilonP Membrane de transfert (0,45µ ; m)MerckIPVH000010
Iodomethane, 99 %Sigma-AldrichI8507Méthanol hautement toxique
Sigma-Aldrich32213-2.5L
Mg132SelleckchemS2619
Mini Trans-Blot Cellule de transfert électrophorétiqueBio-Rad1703930
Mini-PROTEAN Tetra Celluled’électrophorèse verticaleBio-Rad1658004
MLN4942biomol (caïman)Cay15217-1
Anticorps monoclonal anti-&alpha ;-tubuline produit chez la souris (B512)SigmaT5168
N-Ethyldiisopropylamine, 99 %Alfa AesarA11801
Lait écrémé en poudrePanReac AppliChemA0830,0500
Nunc F96 MicroWell Blanc Plaque de polystyrèneThermo Scientific136101
Tampon d’échantillon NuPAGE LDS (4X)Thermo ScientificNP0008
Pierce BCA Kit de dosage des protéinesThermo Scientific23225
PomalidomideSelleckchemS1567
RestoreTM Tampon de décapage Western BlotThermo Scientific46430
sodium dodécylsulfateRoth183.1
Chlorure de sodiumSigma-AldrichA9539-500g
TEMEDCarl Roth2367.3
tert-butyle N-[2-[2-(2-(2-aminoéthoxy)éthoxy]éthyl]carbamateSigma-Aldrich89761Composé 5
TricineCarl Roth6977.4
Base TrizmaSigma-AldrichT1503-1kg
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ml
WesternBright ECL sprayAdvanstaK-12049-D50
Carl

Références

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Dégradation de la céréblonePROTACs à base de pomalidomidecomposé Homo-PROTAC 8inactivation de CRBNanalyse par Western blotessai de viabilité cellulairecellules de myélome multipledégradation d'IKZF1 et IKZF3inhibition du protéasomeconfirmation de la structure par RMN
Inactivation chimique de l'E3 Ubiquitin Ligase Cereblon par des Homo-PROTAC à base de Pomalidomide
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