Ce travail décrit la synthèse et la caractérisation d'un homo-PROTAC bifonctionnel à base de pomalidomide comme une nouvelle approche pour induire l'ubiquitination et la dégradation du cereblon de ligase d'ubiquitine E3 (CRBN), la cible des analogues de la thalidomide.
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Article de méthode
Inactivation chimique de l'E3 Ubiquitin Ligase Cereblon par des Homo-PROTAC à base de Pomalidomide
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les médicaments immunomodulatoires (IMiDs) thalidomide et ses analogues, lénalidomide et pomalidomide, tous les médicaments approuvés par la FDA pour le traitement du myélome multiple, induire l'ubiquitination et la dégradation des facteurs de transcription lymphoïde Ikaros (IKZF1) et Aiolos (IKZF3) via le cereblon (CRBN) E3 ubiquitin ligase pour la dégradation protéasomal. IMiDs ont récemment été utilisés pour la génération de chiolyse bifonctionnelle ciblant les chimères (PROTACs) pour cibler d'autres protéines pour l'ubiquitination et la dégradation protéasomal par la ligase CRBN E3. Nous avons conçu et synthétisé des PROTAC homobifonctionnels à base de pomalidomide et analysé leur capacité à induire l'ubiquitination autodirigée et la dégradation de CRBN. Ici, CRBN sert à la fois, la ligase d'ubiquitine E3 et la cible en même temps. Le composé homo-PROTAC 8 dégrade CRBN avec une puissance élevée avec seulement des effets restants minimes sur IKZF1 et IKZF3. L'inactivation de CRBN par le composé 8 n'a eu aucun effet sur la viabilité et la prolifération de cellules multiples différentes. Cet homo-PROTAC abroge les effets des IMiD dans plusieurs cellules de myélome. Par conséquent, nos composés homodimériuns à base de pomalidomide peuvent aider à identifier les substrats endogènes et les fonctions physiologiques de CRBN et à étudier le mécanisme moléculaire des MiD.
Introduction
Les médicaments immunomodulateurs (IMiDs) thalidomide et ses analogues, lénalidomide et pomalidomide, tous approuvés pour le traitement du myélome multiple, se lient à l'E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN), un adaptateur de substrat pour cullin4A-RING E3 ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. La liaison des IMiD améliore l'affinité du CRL4CRBN aux facteurs de transcription lymphoïde Ikaros (IKZF1) et Aiolos (IKZF3), conduisant à leur ubiquitination et dégradation (Figure 1)4,
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Protocole
1. Préparation des molécules PROTAC
CAUTION : Veuillez consulter toutes les fiches de données pertinentes sur la sécurité des matériaux (MSDS) avant d'être utilisées. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ces synthèses sont toxiques et cancérigènes. Veuillez utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées et l'équipement de protection individuelle.
- Préparation de tert-butyl N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)carbamate (composé 1)
- Ajouter 1,1'-carbonyldiimidazole (1.95 g, 12 mmol) et une quantité catalytique de 4-(dimethylamino)pyridine (5 mg) à un mélange de Boc-Gln-OH (2.46 g, 10 ....
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Résultats
Ici nous avons décrit la conception, la synthèse et l'évaluation biologique d'un PROTAC à base de pomalidomide homodimérique pour la dégradation de CRBN. Notre PROTAC interagit simultanément avec deux molécules CRBN et forme des complexes ternaires qui induit l'auto-ubiquitination et la dégradation protéasomal de CRBN avec seulement des effets restants minimes sur les néo-substrats induits par le pomalidomide IKZF1 ou IKZF3.
Sur.......
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Discussion
La conception de ces homo-PROTAC tel que décrit ici pour CRBN repose sur l'affinité spécifique de la pomalidomide à CRBN, qui a été utilisée avec succès dans de nombreux PROTAC hétérofunctional et a abouti au développement de PROTAC 8 comme un très crBN sélectif de grader. La spécificité de notre molécule a déjà été confirmée par des analyses protéomiques24. Pour les KO génétiquement médiatisés, l'exclusion et la validation des effets secondaires est difficile et prend beaucoup de.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent pas de conflit d'intérêts financier potentiel.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 et SFB-1074 à J.K.; FOR2372 à M.G.)
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI produits chimiques | C0119 | |
| 2,2&prime ;-(éthylènedioxy)-bis(éthylamine) | Composé 385506 Sigma-Aldrich | 6 | |
| 2-mercaptoéthanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-anhydride fluorophtalique, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-diméthylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | |
| Acrylamidstammlö ; sung/ Bisacrylamid (30 %/0,8 %) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Signalisation cellulaire | 15103S | |
| Anticorps anti-CRBN produit chez le lapin | Sigma | HPA045910 | |
| Anticorps anti-IgG HRP de lapin | Sigma | 7074S | |
| Persulfate d’ammonium | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI produits chimiques | B1649 | |
| Albumine sérique bovine | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Essai de viabilité cellulaire luminescente | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydre, 99,8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry sur tamis moléculaire |
| DMSO, anhydre, 99,7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry sur Tamis Moléculaire |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Chèvre anti-souris (HRP conjugué) | Santa Cruz biotechnologie | sc-2005 | |
| Halt Protéase & Inhibiteur de la phosphatase Cocktail à usage unique (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Signalisation cellulaire Mab | 14859S | ||
| ImmobilonP Membrane de transfert (0,45µ ; m) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Méthanol hautement toxique |
| Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | ||
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot Cellule de transfert électrophorétique | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cellule | d’électrophorèse verticaleBio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (caïman) | Cay15217-1 | |
| Anticorps monoclonal anti-&alpha ;-tubuline produit chez la souris (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Lait écrémé en poudre | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell Blanc Plaque de polystyrène | Thermo Scientific | 136101 | |
| Tampon d’échantillon NuPAGE LDS (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Kit de dosage des protéines | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Tampon de décapage Western Blot | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodécylsulfate | Roth | 183.1 | |
| Chlorure de sodium | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-butyle N-[2-[2-(2-(2-aminoéthoxy)éthoxy]éthyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Composé 5 |
| Tricine | Carl Roth | 6977.4 | |
| Base Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
Références
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferati....
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Réimpressions et autorisations
