Application de perturbations de massage cohérentes sur les veaux de souris et surveillance des changements de pression intramusculaire qui en résultent

Résumé

Nous décrivons ici les protocoles pour appliquer des charges mécaniques définies aux veaux de souris et pour surveiller les changements concomitants de pression intramusculaire. Les systèmes expérimentaux que nous avons développés peuvent être utiles pour étudier le mécanisme derrière les effets bénéfiques de l'exercice physique et le massage.

Résumé

Le massage est généralement reconnu comme bénéfique pour soulager la douleur et l'inflammation. Bien que des études antérieures aient rapporté des effets anti-inflammatoires du massage sur les muscles squelettiques, les mécanismes moléculaires derrière sont mal compris. Nous avons récemment développé un dispositif simple pour appliquer la compression cyclique locale (LCC), qui peut générer des ondes de pression intramusculaire avec des amplitudes variables. Utilisant ce dispositif, nous avons démontré que LCC module des réponses inflammatoires des macrophages in situ et soulage l'atrophie musculaire induite par l'immobilisation. Ici, nous décrivons des protocoles pour l'optimisation et l'application de LCC comme intervention mass-like contre l'inflammation induite par l'immobilisation et l'atrophie des muscles squelettiques des membres postérieurs de souris. Le protocole que nous avons développé peut être utile pour étudier le mécanisme sous-jacent aux effets bénéfiques de l'exercice physique et le massage. Notre système expérimental fournit un prototype de l'approche analytique pour élucider la régulation mécanique de l'homéostasie musculaire, bien que d'autres développements doivent être faits pour des études plus complètes.

Introduction

Le massage est généralement reconnu comme bénéfique à la fois pour soulager la douleur et l'amélioration de la performance physique chez les athlètes de compétition et les non-athlètes^1,2. En fait, des études antérieures ont montré que le massage supprime l'inflammation locale³ et incite à la récupération des dommages musculaires post-exercice^4,5. Les mécanismes moléculaires sous-jacents aux effets bénéfiques du massage restent largement inconnus.

L'une des difficultés avec l'enquête mécaniste sur le massage est liée à la reproductibilité des techniques expérimentales par lesquelles des interventions de massage sont testées. Dans des études antérieures, les procédures expérimentales qui imitent le massage impliquent principalement l'application d'interventions physiques utilisant les parties du corps des praticiens, telles que les paumes et les doigts^6,7^,8. Il est donc difficile de reproduire avec précision leur ampleur, leur fréquence, leur durée et leur mode.

De nombreux dispositifs ont été développés pour appliquer des charges mécaniques définies sur les tissus cibles. Par exemple, Zeng et coll. ont mis au point un système pneumatique pour la charge mécanique de longueur des membres postérieurs des rats⁹ et Wang et coll. ont mis au point un dispositif méchatronique qui peut appliquer des charges mécaniques semblables à des massages aux membres postérieurs des rats et des lapins avec contrôle de rétroaction en temps réel¹⁰. Par rapport à eux, notre système local de compression cyclique (LCC) est beaucoup plus simple, exigeant beaucoup moins de coûts pour la construction. Néanmoins, nous pouvons reproduire les changements de pression intramusculaire qui sont générés pendant la légère contraction musculaire. À l'aide de ce dispositif, nous avons démontré avec succès que les interventions mécaniques semblables à des massages modulent la dynamique des fluides interstitiels locaux et atténuent l'atrophie musculaire induite par l'immobilisation¹¹.

Ici, nous décrivons les détails de notre dispositif et le protocole, qui peut aider à explorer les mécanismes moléculaires derrière les effets positifs des exercices et des massages. Les schémas du protocole sont présentés sous la forme d'une figure supplémentaire 1.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées sous l'approbation du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Centre national de réadaptation pour les personnes handicapées.

1. Immobilisation des membres postérieurs bilatéraux de souris

REMARQUE : Des souris mâles c57BL/6 ont été utilisées pour des expériences à l'âge de 11 - 12 semaines après l'acclimatation pendant au moins 7 jours.

1. Anesthésiez adéquatement une souris à l'aide du pentobarbital de sodium (50 mg/kg i.p.). Assurez-vous que les souris ne répondent pas à une pincée d'orteil postérieur.
   REMARQUE : Effectuez la procédure d'immobilisation entre 10 h et 19 h afin de minimiser les effets possibles sur l'activité alimentaire des souris.
2. Appliquer des rubans chirurgicaux sur les membres postérieurs bilatéraux de la souris posés en position de supine avec les articulations du genou prolongées et les articulations de la cheville plantaire.
3. Placez un fil d'aluminium (voir Tableau des matériaux) sur le tronc au niveau de la colonne vertébrale L4-5 et enroulez le fil dans une configuration spirale autour des membres postérieurs avec des écarts de 5 mm entre chaque tour de la couche spirale (Figure 1A). Assurez-vous de ne pas enfiler le fil trop étroitement et éviter de perturber le flux sanguin local.
4. Pour réduire au minimum la possibilité d'échapper au câblage, immobiliser les articulations de la hanche à la position de l'enlèvement de 90 degrés en ajustant manuellement la configuration du fil d'aluminium.
5. Remettez les souris dans leurs cages d'origine. 3 h plus tard, assurez-vous qu'ils récupèrent de l'anesthésie et l'accès à la nourriture et à l'eau comme d'habitude.
6. Maison 3 - 6 souris immobilisées par cage comme avant l'immobilisation.

2. Mesure de la pression intramusculaire des muscles gastrocnemius de souris

REMARQUE : Plusieurs poids différents des unités cylindriques (36 g, 66 g, et 200 g) ont été examinés dans les expériences de surveillance de pression combinées avec LCC. Cette mesure a été effectuée séparément des expériences pour analyser l'inflammation et l'atrophie musculaires (voir l'étape 3 - 5 pour plus de détails), c'est-à-dire que les souris soumises à la mesure de la pression n'ont pas été utilisées pour des analyses histologiques.

1. Étant donné que la mesure de la pression implique des procédures plus invasives (p. ex., incision de la peau et insertion d'aiguilles) par rapport au câblage des membres postérieurs et au LCC, utilisez un mélange de trois agents anesthésiques (médetomidine 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg, butorphanol 5,0 mg/kg, i.p.). Assurez-vous que les souris ne répondent pas à la pince de l'orteil du membre postérieur.
2. Placez la souris en position couchée, faites une incision de 2 mm avec un scalpel sur le mollet postérieur après avoir dépilée avec un rasage électrique et semi-stérilisé la surface de la peau avec 70% d'éthanol et de chlorhexidine imbibé de coton absorbant.
3. Insérer une aiguille de 20 G dans le muscle gastrocnemius à un angle obtus (150 degrés et 170 degrés) à la surface de la peau.
4. En utilisant la gaine en plastique de l'aiguille comme guide, placez un capteur du télémètre de pression artérielle (voir Tableau des matériaux) dans le ventre moyen du muscle gastrocnemius, puis retirez la gaine du muscle.
5. Après avoir sutocisé la peau avec 4-0 suture en nylon, appliquer LCC avec plusieurs poids différents d'unités cylindriques au veau chez les souris (voir l'étape 3 pour plus de détails), et surveiller la pression intramusculaire à l'aide d'un logiciel pour l'analyse du signal biologique (voir tableau de Matériaux).
6. Remettez les souris dans leurs cages d'origine. 3 h plus tard, assurez-vous qu'ils se remettent de l'anesthésie/analgésie et ont accès à la nourriture et à l'eau comme d'habitude.

3. Compression cyclique locale (LCC) sur les veaux de souris

1. À l'exception de la mesure de la pression intramusculaire et de l'euthanasie (c.-à-d. la luxation cervicale), utilisez le pentobarbital de sodium (50 mg/kg i.p.) pour l'anesthésie.
2. Désengagez la souris du câblage postérieur et placez-la en position couchée avec les articulations du genou prolongées et les articulations de la cheville plantaires de sorte que les mollets face vers le haut. Ne réparez pas les membres postérieurs de la souris sur la scène.
3. Appliquer l'ALCC sur le veau en déplaçant verticalement une unité de poids cylindrique (figure 1B) recouverte d'un coussin(figure 1C)à 1 Hz pendant 30 min par jour, 7 jours.
4. Après chaque accès de LCC quotidien, re-filer les membres postérieurs de la souris.

4. Analyse immunohistochimique du gastrocnemius

1. Euthanasier la souris par luxation cervicale sous anesthésie adéquate/analgésie par injection intrapéritonéale d'un mélange de trois agents anesthésiques (médetomidine 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg, butorphanol 5,0 mg/kg).
2. Après avoir dépilé la surface postérieure du mollet, faire une incision de la peau, et disséquer les muscles gastrocnemius en se séparant de l'os tibio-fibulaire à l'aide d'un ciseaux chirurgicaux et les congeler rapidement dans une solution optimale de température de coupe composé.
3. À l'aide d'un cryostat, préparer des échantillons de cryosection des muscles gastrocnemius sur des lames de verre. Conserver les échantillons dans un congélateur de -80 oC jusqu'à l'analyse.
4. Sortez les échantillons de cryosection gastrocnemius à analyser du congélateur et déshydratez-les par séchage à l'air à température ambiante.
5. Utilisez un stylo bloqueur liquide pour dessiner une zone qui comprend toutes les cryo-sections sur la diapositive. Le cercle empêchera les solutions de s'écouler de la diapositive.
6. Évitez de sécher les échantillons en plaçant les glissières dans un plateau dans lequel un environnement humide est créé avec du papier imbibé d'eau.
7. Appliquer 100 l de tampon de blocage (saline tamponnée de phosphate (PBS) contenant 0,25 % de caséine, de protéine porteuse et 0,015 M d'azide de sodium) pendant 30 min à température ambiante.
8. Rincer les diapositives deux fois en couvant avec PBS-T (PBS contenant 0,1% de polyoxyéthylène sorbitan monolaurate (voir Tableau des matériaux) pendant 5 min.
9. Appliquer 100 l d'anticorps primaires dilués avec du PBS sur chaque échantillon, couvrir le plateau d'un couvercle et couver toute la nuit à température ambiante.
10. Laver 3 fois avec PBS-T (5 min pour chaque lavage).
11. Appliquer 100 l d'anticorps secondaire dilué avec du PBS sur chaque échantillon et couver pendant 1 h à température ambiante.
    REMARQUE : Pour la coloration anti-laminin, utilisez l'anticorps secondaire Alexa Fluor 568-conjugué. Pour les anti-F4/80, les anti-MCP-1 et les anti-TNF-MD, utilisez un anticorps secondaire Alexa Fluor 568 ou 488 conjugués.
12. Laver 3 fois avec PBS-T (5 min pour chaque lavage).
13. Appliquer 100 l l de solution DAPI diluée avec PBS-T sur chaque échantillon et couver pendant 3 min à température ambiante.
14. Laver 3 fois avec PBS-T (5 min pour chacun).
15. Monter les échantillons avec le milieu de montage et les recouvrir de couvertures.

5. Analyse histo-morphométrique du gastrocnemius

1. Placez les diapositives de l'échantillon sur un microscope à fluorescence (voir tableau des matériaux)et affichez les échantillons à l'aide d'un objectif de 20 degrés à l'aide de filtres appropriés (DAPI-B, 360/40 nm pour l'excitation et 460/50 nm pour l'émission; GFP-B, 470/40 nm pour l'excitation et 535/50 nm pour l'émission; FRITC, 540/25 nm pour l'excitation et 605/55 nm pour l'émission.
2. À l'aide du logiciel d'analyse d'images (voir tableau des matériaux),mesurez la zone transversale (CSA) de chaque myofibre, et comptez le nombre de cellules F4/80-, MCP-1-, et TNF---positifs.
   REMARQUE : Déterminez l'ASC de chaque myofibre en traçant la marge interne de la membrane de sous-sol visualisée avec l'immunostaining anti-laminin-2.

Résultats

Conformément à nos observations précédentes¹², l'ASC des myofibres gastrocnemius a été considérablement diminuée par immobilisation postérieure(figure 2A,B). En outre, notre analyse de coloration d'immunofluorescence a indiqué que les cellules exprimant MCP-1 et TNF-, qui jouent tous les deux des rôles clés en réglant des processus inflammatoires^13,14, sensiblement augmenté dans le muscle gast...

Discussion

Nous avons décrit une méthode pour appliquer un stimulus mécanique massage-like, qui a des effets anti-inflammatoires. Notre système a des avantages suivants, même par rapport à ceux signalés précédemment. Tout d'abord, les études précédentes n'ont pas défini quantitativement les forces mécaniques appliquées² ou défini leurs magnitudes en fonction de la mesure à la surface du corps, mais pas à l'intérieur des tissus¹⁰. En revanche, nous avons mesuré la pression intramuscula...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fil d’aluminium	DAISO JAPON	B028	Un fil d’aluminium est utilisé pour éviter d’échapper à la restriction par le fil
Télémètre de pression artérielle	Millar	SPR-671	Un télémètre de pression artérielle est utilisé pour mesurer la pression intramusculaire.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI est une sonde fluorescente qui est couramment utilisée pour colorer l’ADN pour la microscopie fluorescente.
Chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488 (Rapport de dilution, 1:500)	Invitrogen	A11034	Anticorps pour la coloration immunohistochimique.
Chèvre anti-rat Alexa Fluor 568 (Rapport de dilution, 1:500))	Invitrogen	A11077	Anticorps pour la coloration immunohistochimique.
ImageJ	NIH	N/A	Logiciel d’analyse pour image
LabChart8	ADInstrumens	;	Logiciel d’analyse pour l’acquisition de signaux biologiques.
Prolong gold	Thermo Fisher Scientific	P36930	Prolong gold est destiné au montage d’échantillons colorés.
Protein Block Serum-Free	Dako	X090930-2	Pour bloquer la coloration de fond non spécifique dans les procédures immunohistochimiques.
Anticorps monoclonal anti-laminine-2 de rat (rapport de dilution, 1:1000)	Anticorps Sigma Aldrich	L0663	pour la coloration immunohistochimique.
Anticorps monoclonal anti-F4/80 de rat (rapport de dilution, 1:500)	Abcam	ab6640	Anticorps pour coloration immunohistochimique.
Anticorps polyclonal anti-MCP-1 de lapin (rapport de dilution, 1:1000)	Abcam	ab25124	Anticorps pour coloration immunohistochimique.
Anticorps polyclonal anti-TNF-&alpha ; de lapin (Rapport de dilution, 1:1000)	Abcam	ab66579	Anticorps pour coloration immunohistochimique.
Ruban chirurgical	3M Japan	1530EP-0	Le ruban chirurgical est utilisé pour restreindre les mouvements articulaires.