D’imagerie intégrine Tension et Force cellulaire à résolution submicronique avec un capteur de Tension intégrative

Résumé

Intégrine tension joue un rôle important dans diverses fonctions cellulaires. Avec un capteur de tension intégrative, tension intégrine est calibrée avec une sensibilité de picoNewton (pN) et image à résolution submicronique.

Résumé

Moléculaire tension transmise par obligations intégrine-ligand est le signal mécanique fondamental dans la voie de l’intégrine qui joue un rôle important dans de nombreuses fonctions cellulaires et les comportements. Pour calibrer et image intégrine tension avec force haute sensibilité et une résolution spatiale, nous avons développé un capteur de tension intégrative (STI), un capteur de tension fluorescent basées sur l’ADN. L’EVI est activé pour une fluorescence si maintient une tension moléculaire, convertissant ainsi la force de signal fluorescent au niveau moléculaire. Le seuil de tension pour l’activation de la STI est accordable dans la fourchette de 10 à 60 pN qui couvre bien la plage dynamique de l’intégrine tension dans les cellules. Sur un substrat greffé avec une ITS, la tension de l’intégrine des cellules adhérentes est visualisée par fluorescence et image à résolution submicronique. L’EVI est également compatible avec l’imagerie structurale cellulaire dans les cellules vivantes et les cellules fixes. La STI a été appliquée avec succès à l’étude de la contraction de plaquettes et la migration cellulaire. Cet article détaille la procédure pour la synthèse et l’application de la STI dans l’étude de force cellulaire intégrine-transmis.

Introduction

Cellules s’appuient sur les intégrines adhérer et d’exercer des forces cellulaires à la matrice extracellulaire. Transmission de force et adhérence cellulaire intégrine sont cruciales pour cellule diffusion^1,2, migration^3,4et survie^5,6,7. À long terme, signalisation biomécaniques intégrine influe également sur cellule prolifération^8,9,10 et différenciation

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité de l’utilisation (IACUC, 8-16-8333-I) de l’Iowa State University et d’institutionnels animalier.

1. synthèse de la sonde de tension intégrative

1. Personnalisez et commandez ssDNAs (voir la Table des matières).
   Remarque : Les séquences d’ADN simple brin sont comme suit. Le brin supérieur est /5ThioMC6-D/GGG AGG NOC CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. Les brins inférieurs sont comme suit.
   12 pN ITS : GGC GCC CTG CGT TDC CCC /3Bio//5Cy3 /
   pN 23 ITS : GGC GCC CTG CGT CC /iBiodT/ / 5Cy3/CCC
   33 AP ITS : / 5Cy3/GGC GCC CTG CG/iBiodT/CCC du tarif douanier commun....

Résultats

Avec le SCI, le plan de tension intégrine des keratocytes de poisson a été capturé. Il montre qu’un keratocyte migre et génère l’intégrine tension à deux pistes de force (Figure 2 a). La résolution de la carte de force a été calibrée pour être 0,4 µm (Figure 2 b). Intégrine haute tension se concentre sur la marge arrière (Figure 3 a). L’ITS montre également différents modes spécifiques de différentes.......

Discussion

L’EVI est un très accessible et pourtant une technique puissante pour cellulaire forcer en termes de synthèse et application. Avec tout le matériel prêt, le STI peuvent être synthétisé dans 1 jour. Au cours d’expériences, seulement trois étapes de revêtement de surface sont nécessaires avant la culture cellulaire. Récemment, nous avons simplifié davantage la procédure de revêtement à une seule étape en reliant directement l’ITS à l’albumine sérique bovine, qui permet l’adsorption physique directe de l’ITS au verre ou pol.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BSA-biotine	Sigma-Aldrich	A8549
Neutravidin	Thermo Fisher Scientific	31000
Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	434301
brin supérieur DNA	Technologies Integrated DNA Technologies	N/A	Conçu par le client. La séquence d’ADN est illustrée dans la section PROTOCOLE
brin inférieur DNA	Technologies intégrées	/A	Conçu par le client. Les séquences d’ADN sont montrées dans la section PROTOCOLE.
sulfo-SMCC	Thermo Fisher Scientific	A39268
Peptide cyclique RGD avec un groupe amine	Peptides International	PCI-3696-PI
IMDM	ATCC	&lrm ;
FBS	ATCC	302020
Pénicilline	gibco	15140122
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706
200 uL boîte de Pétri	Cellvis	D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	N/A	spectromètre
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit	Hoefer	SE410-15-1.5	Dispositif pour l’électroporèse
Lignée cellulaire CHO-K1	ATCC	CCL-61
NIH/3T3 Lignée cellulaire	ATCC	CRL-1658
Anticorps anti-vinculine	EMD Millipore	90227	Anticorps primaire pour l’immunocoloration à la vinculine
Anticorps secondaire superclonal anti-IgG de souris (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A28175	Anticorps secondaire pour l’immunocoloration à la vinculine
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen	A22287
Eclipse Ti	Nikon	N/A	microscope