Article de méthode

Génération d'hydrogels à base de collagène 3D pour analyser la croissance et le comportement axonal pendant le développement du système nerveux

DOI :

10.3791/59481

⸱

25 juin 2019

 , 
1Molecular and Cellular Neurobiotechnology, Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), Parc Científic de Barcelona, 2Department of Cell Biology, Physiology, and Immunology, Universitat de Barcelona, 3Center for Networked Biomedical Research on Neurodegenerative Diseases (CIBERNED), 4Institute of Neuroscience, University of Barcelona

Dans cet article

Résumé

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Ici, nous fournissons une méthode pour analyser le comportement des axones en croissance dans les matrices 3D, imitant leur développement naturel.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole utilise du collagène naturel de type I pour générer de l'hydrogel tridimensionnel (3-D) pour la surveillance et l'analyse de la croissance axonale. Le protocole est centré sur la culture de petits morceaux de cerveaux embryonnaires ou postnatals de rongeurs à l'intérieur d'un hydrogel 3D formé par le collagène de type I dérivé du tendon de queue de rat avec la porosité spécifique. Les morceaux de tissu sont cultivés à l'intérieur de l'hydrogel et confrontés à des fragments de cerveau spécifiques ou des agrégats de cellules génétiquement modifiés pour produire et sécrére des molécules appropriées pour créer un gradient à l'intérieur de la matrice poreuse. Les étapes de ce protocole sont simples et reproductibles, mais comprennent des étapes critiques à examiner attentivement au cours de son développement. En outre, le comportement des axones croissants peut être surveillé et analysé directement à l'aide d'un microscope de contraste de phase ou d'un microscope à fluorescence mono/multiphoton après fixation par des méthodes immunocytochimiques.

Introduction

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Les axones neuronaux, se terminant par des cônes de croissance axonale, migrent sur de longues distances à travers la matrice extracellulaire (ECM) de l'embryon sur des voies spécifiques pour atteindre leurs cibles appropriées. Le cône de croissance est la partie distale de l'axone et il est spécialisé pour détecter l'environnement physique et moléculaire de la cellule1,2. D'un point de vue moléculaire, les cônes de croissance sont guidés par au moins quatre mécanismes moléculaires différents : attraction de contact, chimioattraction, répulsion de contact, et chemorepulsion déclenchée par différents indices de guidage axonal3,4 , 5 Annonces , 6. Les processus négociés par contact peuvent être partiellement surveillés dans des cultures bidimensionnelles (2D) sur des substrats micro-modèles (p. ex., avec des rayures7,8 ou des taches9 contenant les molécules). Cependant, les axones peuvent naviguer vers leur cible d'une manière non-diffusive en sentant plusieurs molécules attrayantes et répulsives des cellules de guidage dans l'environnement4,5,10. Ici, nous décrivons une méthode facile de culture 3-D pour vérifier si une molécule sécrétée induit des effets chémorepulsifs ou chimioattractive sur le développement des axones.

Les premières études visaient à déterminer les effets des indices de guidage d'axone utilisés explant cultures dans des matrices tridimensionnelles (3-D) pour générer des gradients simulant des conditions in vivo11,12. Cette approche, ainsi que des expériences in vivo, a permis d'identifier quatre grandes familles de repères d'orientation: Netrins, Slits, Semaphorins, et Ephrins4,5,6. Ces indices moléculaires et d'autres facteurs13 sont intégrés par les axones en croissance, déclenchant la dynamique des complexes d'adhérence et transduisant les forces mécaniques via le cytosquelette14,15,16. Pour générer des gradients moléculaires dans les cultures 3D pour la navigation axonale, les chercheurs pionniers ont utilisé des substrats de caillots plasmatiques17, qui a également été utilisé pour les préparations de tranches organotypiques18. Cependant, en 1958, un nouveau protocole pour générer des hydrogels de collagène 3D a été rapporté pour l'étude avec les dispositifs de Maximow19, une plate-forme de culture, utilisée dans plusieurs études appropriées pour les observations microscopiques20. Une autre étude pionnière a rapporté le gel de collagène comme outil pour intégrer des fibroblastes humains pour étudier la différenciation des fibroblastes dans les myofibroblastes dans les processus de guérison des plaies21. En parallèle, Lumsden et Davies ont appliqué du collagène du derme bovin pour analyser l'effet putatif du facteur de croissance nerveuse (NGF) sur le guidage des fibres nerveuses sensorielles22. Avec le développement de nouvelles plateformes culturelles (p. ex., plaques multi-puits) par différentes entreprises et laboratoires, les cultures de collagène ont été adaptées à ces nouveaux dispositifs6,23,24,25 ,26. En parallèle, un extrait de matériel d'ECM dérivé de la lignée cellulaire de tumeur d'Engelbreth-Holm-Swarm a été rendu disponible commercialement pour étendre ces études27.

Récemment, plusieurs protocoles ont été développés pour générer des gradients moléculaires avec des rôles putatifs dans le guidage des axones à l'aide d'hydrogels 3D (p. ex. collagène, fibrine, etc.) 28. Alternativement, la molécule candidate peut être immobilisée à une concentration différente dans une matrice poreuse (p. ex., NGF29) ou générée par la culture dans une petite région des agrégats de cellules hydrogel 3D sécrétant la molécule pour générer un rayonnement gradient4,23,24,25,26. La dernière possibilité sera expliquée dans ce protocole.

La procédure présentée ici est une méthode facile, rapide et hautement reproductible basée sur l'analyse de la croissance axonale dans les cultures d'hydrogel 3D du cerveau embryonnaire de souris. En comparaison avec d'autres méthodes, le protocole est bien adapté aux chercheurs non formés et peut être entièrement développé après une courte formation (1-2 semaines). Dans ce protocole, nous isolons d'abord le collagène des queues de rat adultes pour produire davantage de matrices 3D dans lesquelles les agrégats de cellules génétiquement modifiés sont cultivés devant le tissu neuronal embryonnaire. Ces agrégats cellulaires forment des gradients chimiques radiaux d'une molécule candidate qui provoque une réponse pour les axones en croissance. Enfin, l'évaluation des effets de la molécule sur les axones en croissance peut facilement être effectuée à l'aide d'une microscopie de contraste de phase ou, alternativement, de méthodes immunocytochimiques.

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Protocole

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Toutes les expériences animales ont été réalisées dans le cadre des lignes directrices et protocoles du Comité éthique pour l'expérimentation animale (CEEA) de l'Université de Barcelone, et le protocole pour l'utilisation des rongeurs dans cette étude a été examiné et approuvé par le CEEA de la l'Université de Barcelone (approbation de la CEEA #276/16 et 141/15).

1. Purification du collagène de queue de rat

  1. Recueillir les queues de rat Sprague-Dawley adultes (8-9 semaines) après avoir sacrifié l'animal en suivant des directives éthiques et rincer à 95% d'éthanol. Placer 2 à 4 queues sur la glace (4 oC) et les garder couvertes de glace pendant le processus.
  2. Pour obtenir des tendons de queue, fixer la queue aux vertèbres les plus caudales de la queue à l'aide d'un hemostat et comprimer la queue avec un deuxième hemostat positionné autour de 5-7 mm de la première. Cassez la queue en la tordant brusquement avec les deux hemostats. Pour ce faire, plier / déplier les vertèbres plusieurs fois jusqu'à ce qu'il se brise.
  3. Tirez lentement les vertèbres avec l'hémostat pour détacher les tendons de leur gaine au fur et à mesure qu'elle sort. En ce moment, couper les tendons avec de petits ciseaux. Gardez ces morceaux de tendon dans un plat stérile de 100 mm Petri sur la glace.
  4. Répétez le serrage et le glissement pour le reste de la queue jusqu'à ce que les tendons soient totalement extraits.
  5. Répétez les étapes 1.2-1.4 pour toutes les queues obtenues.
  6. Observez les tendons au microscope. Jeter les vaisseaux sanguins en coupant avec de petits ciseaux et en tenant avec des forceps fins droites pour améliorer la pureté du tendon et rincer les tendons 3 fois avec de l'eau ultrapure.
  7. Recueillir 3-4 g de tendons humides. Dissoudre les tendons dans 150 ml d'acide acétique glaciaire à 3 oC dans un flacon conique en verre de 200 à 250 ml pendant 24 à 36 h, sous un léger remuant.
  8. Centrifugeuse à 20 000 x g pour 1 h. En parallèle, préparer la membrane de tuyauterie de dialyse en coupant un morceau d'environ 10-15 cm de longueur et le faire bouillir dans de l'eau ultrapure contenant 1 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) pendant 15 min. Par la suite, rincer délicatement la membrane de dialyse à l'eau ultrapure.
  9. Après centrifugation, recueillir le supernatant dans la membrane de tuyauterie de dialyse par décantation. La pastille contient du matériel insoluble acide (protéines non collagènes) et le supernatant contient des protéines solubles de collagène.
  10. Dialyser le supernatant contre 2 L de stérile 0.1x Minimum Essential Medium Eagle (MEM), pH 4.0 dans un bécher en verre de 2-5 L. Dialyser pendant 3 jours. Modifier la solution 0.1x MEM au moins deux fois par jour en vérifiant le pH à chaque changement avant d'utiliser. Si le pH est devenu basique, modifiez-le avec quelques gouttes d'acide acétique de 0,1 M jusqu'à ce que le pH soit de 4,0.
  11. Après la dialyse, ajouter les antibiotiques (1,5 ml de pénicilline/streptomycine (Pen-Strep)) à la solution de collagène dialysé. Faire 5 mL d'aliquots de la solution de stock de collagène et conserver à 4 oC.
    REMARQUE: À partir de ce moment, toutes les procédures de manipulation doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte à débit laminaire.
  12. Procéder à l'essai de gélation de la solution préparée de stock de collagène suivant les étapes suivantes.
    1. Comme le collagène de stock est généralement trop concentré, préparer 3 dilutions de travail (75%, 50%, et 25% solution de collagène) en diluant le stock en 0.1x MEM, pH 4.0. Le volume final recommandé pour chaque dilution de travail est de 5 ml. Dans chaque condition, vérifiez la concentration de protéines à l'aide d'un jeu colorimétrique protéique.
    2. Placez plusieurs tubes de centrifugeure conique vides de 1,5 ml (un pour chaque dilution en fonctionnement), des tubes MEM 10x, une solution de bicarbonate de sodium de 7,5 % et différentes dilutions de collagène sur glace. Attendez que ceux-ci soient refroidis.
    3. Ajouter 40-50 'L de 10x MEM à un tube froid (4 oC) de centrifugeuse. Ensuite, mélangez-le délicatement avec une solution de bicarbonate de sodium de 7 à 8 l l.
    4. Ajouter 310-330 L de l'une des différentes dilutions de collagène à ce tube et mélanger délicatement avec la pipette en évitant toute formation de bulles. Conserver le mélange de bicarbonate de collagène-MEM-sodium sur la glace (4 oC) pendant au moins 5 min.
    5. Pipette 10-25 l du mélange dans un plat Petri de 35 mm.
    6. Placer le plat Petri dans l'incubateur CO2 fixé à 37 oC jusqu'à ce que la gelation de l'hydrogel (de 15 à 20 min) soit observée.
    7. Répétez les étapes 1.12.3-1.12.6 pour les dilutions restantes de collagène dans différents plats de Petri.
    8. Sélectionnez la dilution de travail de collagène qui donne les meilleurs résultats.
      REMARQUE: Le meilleur hydrogel gélifié doit avoir une texture translucide uniforme, couleur grise et ne doit pas être grumeleux ou filandreuse. D'après notre expérience, une dilution de 3:1 (Collagen: 0.1x MEM) génère les meilleurs résultats expérimentaux.

2. Préparation des agrégats cellulaires (COS1) génétiquement modifiés pour sécrétiser une molécule candidate dans des hydrogels de collagène 3D

  1. Plaque 2 x 106 cellules COS1 dans un plat Petri de 35 mm et incuber avec un milieu de culture complet composé de 100 ml de D-MEM contenant 10 % (vol/vol) sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur, 0,5 % (wt/vol) glutamine et 1 % (wt/vol) Pen/Strep dans une culture cellulaire incubateur, afin d'atteindre 70-80% de confluence du jour au lendemain. Préparer un plat Petri pour chaque procédure de transfection.
  2. Le jour suivant, transfect COS1 cellules avec l'ADN codant la molécule candidate (Netrin-1 ou Sema3E) en utilisant la méthode de transfection à base de liposome suivant les instructions du fabricant.
    1. Pour ce faire, mélanger 250 l de milieu sans sérum et de l'ADN (1-2 g par condition) à un tube de centrifugeuse de 1,5 ml (tube d'ADN) et mélanger. Incuber à température ambiante (RT) pendant 5 min. Préparer un deuxième tube (tube liposomique) en ajoutant 240 ll du milieu sans sérum et 10 l du réactif de transfection liposomique. Incuber à RT pendant 5 min.
    2. Après l'incubation, ajouter le contenu du tube d'ADN au tube liposomique et mélanger délicatement. Maintenant, incuber à RT pendant 15 min. Remplacer le milieu sur les cellules cultivées avec 1,5 ml du milieu sans sérum et ajouter le mélange ADN-liposomes au plat Petri lentement goutte à goutte. Incuber pendant 3 h dans l'incubateur de culture cellulaire CO 2.
  3. Après 3 h d'incubation de transfection, remplacer le milieu par le milieu de culture complet et incuber toute la nuit dans l'incubateur.
  4. Le lendemain, rincez les cellules avec la saline tamponnée de phosphate de 0,1 M du dulbecco (D-PBS), traitez les cultures avec de la trypsine-EDTA (800 l par plat pendant 5 à 15 min dans l'incubateur CO 2) et collectez les cellules détachées avec 15 ml de milieu de culture complet.
  5. Centrifuger les cellules à 4 oC à 130 x g pendant 5 min. Après la centrifugation, retirer les supports et préserver les granulés contenant des cellules COS1 sur la glace.
  6. Répétez les étapes 1.12.3-1.12.6 pour préparer le mélange de travail de collagène.
  7. Ajouter 100-150 l du mélange de collagène à la pastille des cellules transfectées et mélanger délicatement en pipetting de haut en bas et étendre 45-50 l de ce mélange sur un plat Petri (35 mm de diamètre) pour former une bande uniforme de collagène-cellules d'environ 1-1,5 cm de longueur. Placer le plat dans l'incubateur à 37 oC (5 % de CO2)jusqu'à ce que la gélation (de 15 à 20 min) soit observée.
  8. Préparer une deuxième bande contenant des cellules témoins (transfection fictive) dans un deuxième plat de culture et l'attacher dans l'incubateur (15-20 min) et lorsque la gélation est terminée ajouter 3-4 ml de chaud (37 oC) COS1 milieu de culture complète à chaque plat contenant le gélifié les bandes de collagène-cellules et les maintiennent dans l'incubateur de culture cellulaire de CO 2. Par la suite, couper les bandes de collagène-cellules pour générer de petites pièces carrées (400 à 500 m de longueur) à l'aide d'un scalpel fin ou d'un hachoir à tissu.
  9. Transférer toutes les sections de la même condition de transfection à un plat Petri contenant 3-3,5 ml de médias de culture neuronale (NCM) et vérifier sous un microscope de dissection la qualité des morceaux. Encore une fois, gardez-les dans l'incubateur de culture cellulaire CO 2.
    REMARQUE: Le milieu de culture neuronale se compose du milieu neurobasal contenant 1-5% (vol/vol) sérum de cheval inactivé par la chaleur, 2 mM de glutamine, 0,5% (wt/vol) glucose, 1% (wt/vol) solution Pen-Strep et 0.044% (wt/vol) NaHCO3. Assurez-vous que le pH se situe entre 7,2 et 7,3.

3. Génération d'Explantation embryonnaire pour la culture

  1. Stériliser les outils chirurgicaux (ciseaux, poignée de lame de scalpel, forceps droits et courbés) en autoclant en suivant les directives de stérilisation de routine. En parallèle, préparez 500 ml de tampon équilibré de sain-glucose et 4-5 plats Petri (100 mm de diamètre) contenant 10 ml de HBSS-G. Placer ces assiettes sur la glace (4 oC).
  2. Sacrifiez le rat femelle enceinte (jour embryonnaire 16.5) en dehors de la zone stérile, suivant les procédures éthiques approuvées. Couper les cornes d'embryon avec des ciseaux de la cavité abdominale et les placer dans un grand plat Petri contenant du HBSS-G froid.
  3. Placer le plat dans le capuchon à écoulement laminaire et extraire les embryons avec des forceps droites. Placez-les dans un nouveau plat contenant du HBSS-G froid. Ensuite, retirez la peau de l'embryon à l'aide de petits forceps et disséquez soigneusement le cerveau à l'aide des forceps incurvés et droits. Placez-les dans un plat contenant du HBSS-G froid.
  4. Sous un microscope à disséquer, couper le cerveau en deux le long de la ligne médiane pour séparer les deux hémisphères avec le scalpel ou les ciseaux fins et enlever le diencephalon, les méninges et les vaisseaux sanguins des morceaux du cerveau avec des forceps fins.
  5. Répétez les étapes 3.3-3.4 avec le reste des embryons. Ne pas retarder la dissection de plus de 2 h pour préserver la qualité des tissus.
  6. Nettoyez toutes les parties de l'hélico tissulaire avec 100 % d'éthanol (en particulier la plaque de coupe en polytétrafluoroéthylène (PTFE) et la lame de rasoir). Gardez l'hélico de tissu dans le capot de flux laminaire sous l'éclairage UV pendant 15 min.
  7. Transférer chaque morceau de tissu (p. ex., cortex avec hippocampe) à la plaque de coupe de l'hélico tissulaire. Pour l'hippocampe, placez-le perpendiculairement à la lame de rasoir et obtenez des sections de tissu de 450-500 m d'épaisseur.
  8. Préparer plusieurs plats Petri de 35 mm avec 3-4 ml de MR complet et transférer les morceaux de tissu de l'assiette d'hélico de tissu aux plats De Petri. De nombreux plats peuvent être nécessaires au fur et à mesure que les régions d'intérêt sont disséquées.
  9. Terminer la dissection tissulaire dans le MR complet à l'aide d'aiguilles de tungstène fines. Vérifiez la qualité des tranches obtenues sous le microscope disséquant. Assurez-vous que les couches sont clairement identifiables dans l'optique du champ foncé et disséquez la région d'intérêt (p. ex., région CA de l'hippocampe) avec des aiguilles de tungstène. Jeter les tranches endommagées. Maintenir les explantations hippocampales dans le milieu MR complet dans l'incubateur co 2.

4. Préparation des co-cultures 3D à Collagen Hydrogels

  1. Placez plusieurs plaques stériles de culture à 4 puits dans le capuchon à flux laminaire et préparez un mélange de travail au collagène comme indiqué précédemment dans les étapes 1.12.2-1.12.6.
  2. Placer 15-20 l du mélange d'hydrogel dans le fond d'un puits pour produire une base circulaire de collagène. Répétez cette étape pour le reste des puits. Ne préparez pas plus de cinq plaques en même temps pour éviter l'évaporation liquide excessive de la base d'hydrogel.
  3. Gardez les plats dans l'incubateur jusqu'à ce que la gélation complète (15-20 min) soit observée et ne sortez les assiettes de l'incubateur que lorsque la gélation est terminée. Vérifiez la qualité du collagène gélifié.
  4. Transférer un petit morceau d'agrégat de cellules COS1 à l'' eau. Placez-le sur la base d'hydrogel et placez un morceau de tissu sur la même base avec une pipette près du morceau de cellules agrégées à une explante-taille.
  5. Préparer un nouveau mélange de collagène de travail sur la glace comme dans les étapes 1.12.2-1.12.6.
  6. Doucement pipette 15-20 L de ce nouveau mélange et couvrir l'explantation et l'agrégat cellulaire. Une culture d'hydrogel en sandwich sera observée. En ce moment, réorienter l'explantation avec une aiguille de tungstène fine (ne touchez pas l'agrégat cellulaire COS1!), de sorte qu'il fait face à l'agrégat cellulaire à 500-600 m.
  7. Remettre la plaque à l'incubateur jusqu'à ce que la gélation soit observée (de 10 à 15 min) et 0,5 ml de MR complet complété par un supplément de 2 % de B27 et conserver les cultures pendant 36 à 48 h dans l'incubateur (37 oC, 5 % DE CO2).

5. Fixation des co-cultures d'agrégats d'explantation-cellule et procédure immunocytochimique

  1. Après 36-48 h d'incubation, retirer le milieu et rincer avec 0,1 M de phosphate tamponné salin (PBS), pH 7.3. Par la suite, fixer les cultures pour 1 h avec 4% de paraformaldéhyde dans 0,1 M tampon de phosphate (PB), pH 7,3, à 4 oC.
  2. Retirez le fixatif et rincez doucement les cultures 3-4 fois (10-15 min chacune) dans 0.1 M PB, pH 7.3.
  3. Détachez le sandwich à l'hydrogel du fond du puits à l'adresse spatule ou aux forceps. Transférer le bloc de collagène à l'aide d'un pinceau fin sur une plaque de culture de 6 puits contenant 0,1 M de PBS avec 0,5 % de détergent non ionique.
  4. Incuber les hydrogels flottants dans la solution de blocage (10% de sérum, 0,5% de surfactant non ionique, et 0,2% de gélatine dans 0,1 M PBS) pendant 2-3 h à RT avec une agitation douce.
  5. Rincer 3 fois (10-15 min chacun) avec 0,1 M PBS contenant 0,5% de surfactant non ionique.
  6. Incuber avec un anticorps primaire dilué dans le PBS contenant 5 % de sérum, 0,5 % de surfactant non ionique, 0,2 % de gélatine et 0,02 % d'azide de sodium. Incuber avec l'anticorps primaire de 36 à 48 h à 4 oC sur un shaker.
    REMARQUE: Habituellement, un anticorps contre la classe III - tubulin (-TUJ-1) (dilué 1:2,000) est utilisé pour définir la croissance axonale dans les cultures d'hydrogel 3D.
  7. Après l'incubation, rincer comme à l'étape 5.5.
  8. Incuber avec un anticorps secondaire pendant 4 h à RT (ou 6-7 h à 4 oC) sur un shaker dilué dans 5 % de sérum, 0,5 % de surfactant non ionique et 0,2 % de gélatine. Un anticorps biotinylated anti-souris (dilué 1:200) est utilisé dans cette expérience.
  9. Rincer les cultures comme dans 5.5.
  10. Incuber les cultures pendant 2 jours à 4 oC avec une solution de complexe avidin-biotine (ABC) 1:100 diluée en PBS contenant 5 % de sérum, 0,5 % de surfactant non ionique et 0,2 % de gélatine. Vous pouvez également utiliser de la streptavidtine étiquetée au raifort peroxidase (1:300-400) dans le même tampon.
  11. Rincer les cultures telles que décrites dans 5.5.
  12. Rincer les cultures plusieurs fois avec 0,1 M Tris-HCl tampon, pH 7,6 pour 1 h.
  13. Incuber les cultures avec 0,03% de 3,3-Diaminobenzidine tetrahydrochlorure (DAB) solution dans 0.1 M Tris-HCl, pH 7.6.
  14. Ajouter 5-8 'L de 1% H2O2 et attendre 10-15 min. Surveiller le développement de DAB sous un microscope en utilisant un objectif 4-10x.
  15. Arrêtez la réaction en supprimant la solution DAB avec 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 7.6.
  16. Rincer les cultures en PBS pendant 30 min (plusieurs changements).
  17. Montez les hydrogels sur des lames de verre à l'aide de supports de montage à base d'aqueuse.
  18. Analyser la longueur et la distribution des axones à l'intérieur de l'hydrogel à l'aide de l'analyse Sholl plug-in ou avec NeuriteJ plug-in pour le logiciel ImageJ30.

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Résultats

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Ici, nous présentons une méthodologie largement accessible pour étudier la croissance axonale dans les cultures 3-D de collagène d'hydrogel du système nerveux embryonnaire de souris. À cette fin, nous avons isolé le collagène des queues de rat adultes pour produire des matrices 3D dans lesquelles nous avons cultivé des agrégats de cellules génétiquement modifiés exprimant Netrin-1 ou Sema3E confrontés au tissu neuronal embryonnaire (par exemple, région CA de l'hippocampe). Ces agrégats cellulaires ont formé un gradient r...

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Discussion

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La croissance des axones en développement est principalement invasive et comprend la dégradation et le remodelage de l'ECM. En utilisant la procédure présentée ici, les chercheurs peuvent obtenir une matrice 3D homogène formée par le collagène naturel de type I dans lequel les axones (ou cellules) peuvent répondre à un gradient chimique sécrété par des cellules génétiquement modifiées comme ils le font in vivo. Différentes réponses axonales aux gradients de repères attrayants ou inhibiteurs (protéines, lipides, etc.) peu...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient Tom Yohannan pour les conseils éditoriaux et M. Segura-Feliu pour l'assistance technique. Ces travaux ont été financés par le programme CERCA et par la Commission des universités et de la recherche du Département de l'innovation, des universités et de l'entreprise de la Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Ces travaux ont été financés par le Ministère espagnol de la recherche, de l'innovation et de l'université (MEICO) par l'intermédiaire de BFU2015-67777-R et RTI2018-099773-B-100, le Réseau Prion espagnol (Prionet Espagne AGL2017-90665-REDT), et l'Institut Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Material
3,3&prime ;-Diaminobenzidine tétrachlorhydrate 10 mg comprimés (DAB)SigmaD5905
Rats Sprague-Dawley adultes (âgés de 8 à 9 semaines)  ;Criffa-Credo, Lyon, France
Complexe avidine-biotine-peroxydase (ABC)Vector LabsPK-4000
B27 supplément sans sérum 50x  ;Invitrogen17504-044
Kit de dosage des protéines de l’acide bicchoninique (BCA)Pierce23225
Vecteurs plasmidiques d’ADNc Lignées cellulaires
COS1ATTCCRL-1570
D-(+)-GlucoseSigma16325
D-(+)-glucose (solution à 45 % dans l’eau) pour milieu neurobasal completSigmaG8769
D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1x ) pour milieu de culture COS1Invitrogen41966-029
Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate 10x (sans Ca2+ et Mg2++) (D-PBS) pour les culturesInvitrogen14200
Ethanol  ;merckd’acide
éthylènediaminetétraacétique (EDTA)SigmaE5134
Supports de montage par fluorescence (par exemple, Fluoromount-G ou similaire)Electron Microscopy Sciences (EMS)17984-25
Poudre de gélatine  ;SigmaG1890
Acide acétique glacial (Panreac, réf. 211008)Panreac211008
Hank' solution saline équilibréeInvitrogen24020083
Sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur  ;Invitrogen10108-165
Sérum de cheval inactivé par la chaleur  ;Invitrogen26050-088
Peroxyde d’hydrogène (H2O2, 32 à 33 % dans l’eau)Sigma316989
L-glutamine 200 mM solution (100x) pour milieu neurobasal complet et COS1Invitrogen25030-024
Lipofectamine 2000 RéactifInvitrogen11668-019
Souris femelles enceintes (jour embryonnaire 12,5 à 16,5 ; E12.5-16.5)  ;Criffa-Credo, Lyon, France
Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM)Invitrogen11012-044
Anticorps monoclonal contre la &bêta ;-tubuline de classe III (clone TUJ-1)Biolegend801201
N-2 supplément 100x  ;Invitrogen17502-048
Milieu neurobasal  ;Invitrogen21103049
ParaformaldéhydeMerck1 040 051 000
Solution de pénicilline/streptomycine 100x  ;Invitrogen15140-22
Solution saline tamponnée au phosphate 10x (PBS) pour l’immunocytochimieInvitrogenAM9624
Anticorps secondaire : anti-souris de cheval biotinylée  ;Vector LabsBA-2000
Milieu sans sérum (Opti-MEM)Invitrogen11058-021
Azoture de sodium  ;Panreac162712
solution de bicarbonate de sodium à 7,5 %²Invitrogen25080-094
Qualité de culture stérile H2O  ;SigmaW3500
TritonTM X-100  ;SigmaX100
Trizma base  ;SigmaT1503
Trypsine-EDTA (Trypsine (0,05 % (poids/vol) avec EDTA (1x)Invitrogen25300-054
Equipment
1 grands et 1 petit ciseaux incurvés pour la dissection  ;Outils fins Instruments ou similaires
1,5 mLEppendorf ou similaires
de 15 mLCorning ou similaire
2 hémostatiques  ;   ;Outils fins Instruments ou similaires
2 petits ciseaux de dissection droitsOutils fins Instruments ou similaires
Tubes à centrifuger de 200 mL pour la centrifugationNalgene ou similaires
coniques en verre stérile de 200 mL
Bécher
de 2 L Plaques de culture à 4 et 6 puits  ;Nunc176740 et 140675
Pompes à pipettes automatiques et pipettes en plastique stériles jetables contenant un filtre de 10 mL et 25 mL.Gilson, Brand, Eppendorf ou similaire  ;
Pipettes automatiques, pointes filtrantes stériles et pointes stériles actuelles  ;de paillasse Gilson, Eppendorf ou similaire
avec rotor fixe à anglede paillasse Eppendorf, Beckman Coulter ou similaire
avec rotor à godets oscillants (avec adaptateurs de tube de 1,5, 15 et 50 ml)Eppendorf, Beckman Coulter ou similaire
Incubateur de culture cellulaire à 37 ° ; C, 5 % de CO2 et 95 % d’air
Bouchons de tubulure de dialyse Membrane cellulosiqueSigmaD9402
SigmaZ37101-7
Pipettes jetables
Microscope de dissection avec optique à fond noir  ;Olympus SZ51 ou similaire  ;
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse Beckman Sulter ou similaire avec rotor
Hotte
Grande 100 mm, 60 mm et petite 35 mm & Oslash ; boîtes de culture cellulaire  ;Nunc  ; 150679 , 150288 et 150318, respectivement
Agitateur magnétique et barres de spin magnétiquesIKA ou similaire
Hachoir à tissus McIlwainMickle Laboratory Engineering
Une paire de pinces droites fines et une paire de pinces courbes  ;Outils fins Instruments ou similaires
Lames de rasoir pour le hachoir
Scalpels (numéros 15 et 11)
Deux paires de spatules fines pour le transfert de morceaux de collagène et de tissusOutils fins Instruments ou similaires
108543 Sel disodique dihydraté Tubes à centrifuger coniques de Tubes à centrifuger coniques Fioles en verreMicrocentrifugeuse Centrifugeuse réfrigérée en verrefixe à angleà flux laminaireà tissus

Références

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Mots-clés

Hydrogel de collag nemigration neuronaleguidage axonalculture cellulaire 3Dd coupage tissulaireanalyse immunocytochimiquemicroscopie contraste de phasemicroscopie fluorescence

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