Combinaison de l’analyse SDS-PAGE non réductrice et de la réticulation chimique pour détecter les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures dans les cellules de mammifères dans la culture

Résumé

Les liaisons disulfures ont longtemps été connues pour stabiliser la structure de nombreuses protéines. Une méthode simple pour analyser les complexes multimères stabilisés par ces liaisons est une analyse SDS-PAGE non réductrice. Ici, cette méthode est illustrée par l’analyse de l’isoforme nucléaire de dUTPase de la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS.

Résumé

Les structures de nombreuses protéines sont stabilisées par des liaisons disulfures covalentes. Dans les travaux récents, ce lien a également été classé comme une modification post-traductionnelle. Ainsi, il est important de pouvoir étudier cette modification dans les cellules vivantes. Une méthode simple pour analyser ces complexes multimères stabilisés par la cystéine est par une méthode en deux étapes d’analyse SDS-PAGE non réductrice et de réticulation du formaldéhyde. Cette méthode en deux étapes est avantageuse comme première étape pour découvrir les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures en raison de sa facilité technique et de son faible coût de fonctionnement. Ici, la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS est utilisée pour illustrer cette méthode en analysant spécifiquement l’isoforme nucléaire de dUTPase.

Introduction

Les liaisons disulfures ont longtemps été connues pour stabiliser la structure de nombreuses protéines. Dans les travaux récents, ce lien a également été classé comme une modification post-translationnelle réversible, agissant comme un "commutateur redox" à base de cystéine permettant la modulation de la fonction de protéine, de l’emplacement et de l’interaction^{1,2, 3,4}. Il est donc important de pouvoir étudier cette modification. Une méthode simple pour analyser ces complexes multimères stabilisés par la cystéine est de ne pas réduire l’an....

Protocole

1. blocage des résidus de cystéine libres à l’aide d’iodoacétamide

1. Cultiver des cellules OS U-2 dans un plat de 6 cm² à 50% – 60% de Confluences dans un milieu essentiel minimum avec un taux élevé de glucose contenant 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pyruvate de sodium à 37 ° c dans 5% co₂.
2. Faire un nouveau stock de 10 mM d’iodoacétamide juste avant l’utilisation, puis jeter tout réactif inutilisé.
3. Ajouter l’iodoacétamide de concentration finale de 0,1 mM directement dans les milieux de culture cellulaire. Faire basculer doucement le plat à température ambiante pendant 2 min.

2. récol....

Résultats

La dUTPase nucléaire forme une liaison disulfure intermoléculaire formant une configuration dimère stable grâce à l’interaction de deux résidus de cystéine positionnés au troisième acide aminé de chaque protéine monomère¹¹. Ceci est démontré dans la figure 1a, B. Pour s’assurer que cette liaison disulfure n’était pas une interaction non spécifique en raison d’anomalies de la migration dans l’environnement non réduit, t.......

Discussion

La méthode décrite ici donne un protocole direct pour l’analyse des complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures. Ce protocole peut facilement être adapté à d’autres lignées de culture cellulaire, des tissus et des organismes permettant une large gamme d’applications.

Une étape importante dans cette procédure est de s’assurer que les liaisons disulfure ne sont pas une conséquence de la procédure d’extraction. Tous les résidus de cystéine libre peuvent être bloqués en utilisant l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
16 % préfabriqué TGX	gels ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Flacon	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 parabole	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL kit de détection	GE
Appareil de transfert de transfert de transfert	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Réactif protéique Bradford	Biorad	5000006
			bromophénol
BSA	Signalisation cellulaire	99985
Tampon de lyse cellulaire	Signalisation cellulaire	9803
Centrifugeuse	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Perceuse
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Appareil d’électrophorèse	Invitrogen	A25977
Papier western blot extra épais	ThermoFisher	88610
Fetal sérum bovin	Gibco	1932693
Formaldéhyde	ThermoFisher	28908
Homogénéisateur
Glycérol	Sigma Aldrich	65516
Glycine	RPI	636050
Bloc chauffant	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Acide chlorhydrique	VWR	2018010431
Iodoacétamide	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Méthanol	Pharmco	339000000
Lait écrémé en poudre	Signalisation cellulaire	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
Alimentation	Biorad	200120
Marqueur précoloré	ThermoFisher	26619
Membrane PVDF	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Anticorps secondaire	Signalisation cellulaire	70748
Grattoir à petites cellules	Tygon	S-50HL classe VI
Chlorure de sodium	RPI	S23020
Pyruvate de sodium	Gibco
Sonicator	Branson	450
Tampon éponge pour buvard	Invitrogen	E19051
Plaque d’agitation	Corning	PC353
Saccharose	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Saline tamponnée, avec Tween 20, pH 7,5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine Tampon courant	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
Film radiographique	ThermoFisher	34090

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