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Article de méthode

Combinaison de l’analyse SDS-PAGE non réductrice et de la réticulation chimique pour détecter les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures dans les cellules de mammifères dans la culture

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DOI :

10.3791/59483

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2 mai 2019

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1Department of Molecular Biology, Rowan University, School of Osteopathic Medicine and Graduate School of Biomedical Sciences

Dans cet article

Résumé

Les liaisons disulfures ont longtemps été connues pour stabiliser la structure de nombreuses protéines. Une méthode simple pour analyser les complexes multimères stabilisés par ces liaisons est une analyse SDS-PAGE non réductrice. Ici, cette méthode est illustrée par l’analyse de l’isoforme nucléaire de dUTPase de la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS.

Résumé

Les structures de nombreuses protéines sont stabilisées par des liaisons disulfures covalentes. Dans les travaux récents, ce lien a également été classé comme une modification post-traductionnelle. Ainsi, il est important de pouvoir étudier cette modification dans les cellules vivantes. Une méthode simple pour analyser ces complexes multimères stabilisés par la cystéine est par une méthode en deux étapes d’analyse SDS-PAGE non réductrice et de réticulation du formaldéhyde. Cette méthode en deux étapes est avantageuse comme première étape pour découvrir les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures en raison de sa facilité technique et de son faible coût de fonctionnement. Ici, la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS est utilisée pour illustrer cette méthode en analysant spécifiquement l’isoforme nucléaire de dUTPase.

Introduction

Les liaisons disulfures ont longtemps été connues pour stabiliser la structure de nombreuses protéines. Dans les travaux récents, ce lien a également été classé comme une modification post-translationnelle réversible, agissant comme un "commutateur redox" à base de cystéine permettant la modulation de la fonction de protéine, de l’emplacement et de l’interaction1,2, 3,4. Il est donc important de pouvoir étudier cette modification. Une méthode simple pour analyser ces complexes multimères stabilisés par la cystéine est de ne pas réduire l’analyse SDS-PAGE5. L’analyse SDS-PAGE est une technique utilisée dans de nombreux laboratoires, où les résultats peuvent être obtenus et interprétés rapidement, facilement et avec des coûts minimes, et est avantageux par rapport aux autres techniques utilisées pour identifier les liaisons disulfure telles que la spectrométrie de masse6 ,7 et dichroïsme circulaire8.

Une étape importante pour déterminer si cette méthode est une technique appropriée pour aider dans une étude est d’examiner attentivement la séquence primaire de la protéine d’intérêt pour s’assurer qu’il y a des résidus de cystéine (s) présents. Une autre étape utile est de rechercher toutes les structures cristallines précédentes publiées ou d’utiliser une application de bioinformatique pour explorer la structure tridimensionnelle de la protéine d’intérêt pour visualiser où le résidu de cystéine (s) peut être localisé. Si le ou les résidus sont présents sur la surface extérieure, il peut être préférable de former un lien disulfure plutôt qu’un résidu de cystéine enterré à l’intérieur de la structure. Cependant, il est important de noter que les protéines peuvent subir des changements structurels sur des interactions de substrat ou des interactions protéine-protéine permettant à ces résidus d’être alors exposés à l’environnement aussi bien.

Les complexes multimères identifiés peuvent ensuite être vérifiés avec un réticulation chimique à l’aide de formaldéhyde. Le formaldéhyde est un lien de croisement idéal pour cette technique de vérification en raison de la perméabilité cellulaire élevée et de la courte portée croisée de ~ 2-3 Å, assurant la détection d’interactions protéine-protéine spécifiques9,10. Ici, cette méthode est illustrée par l’analyse de l’isoforme nucléaire de dUTPase de la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS11. Cependant, ce protocole peut être adapté pour d’autres lignées cellulaires, tissus et organismes.

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Protocole

1. blocage des résidus de cystéine libres à l’aide d’iodoacétamide

  1. Cultiver des cellules OS U-2 dans un plat de 6 cm2 à 50% – 60% de Confluences dans un milieu essentiel minimum avec un taux élevé de glucose contenant 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pyruvate de sodium à 37 ° c dans 5% co2.
  2. Faire un nouveau stock de 10 mM d’iodoacétamide juste avant l’utilisation, puis jeter tout réactif inutilisé.
  3. Ajouter l’iodoacétamide de concentration finale de 0,1 mM directement dans les milieux de culture cellulaire. Faire basculer doucement le plat à température ambiante pendant 2 min.

2. récolter les cellules

  1. Aspirer les médias des cellules.
  2. Laver les cellules avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS) trois fois. Aspirer la solution finale de lavage de PBS puis ajouter 1 mL de PBS froid.
  3. Grattez les cellules du fond du plat à l’aide d’un grattoir cellulaire. À l’aide d’une pipette de 1 mL, prélever le PBS et la suspension cellulaire et distribuer tout le liquide dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
  4. Tourner les cellules à 7 500 x g pendant 3 min à 4 ° c. Aspirer le PBS, laissant le culot de la cellule derrière. Le culot de la cellule peut être stocké à-80 ° c jusqu’à

3. extraction de protéines

  1. Préparer 100 μL de tampon de lyse dilué dans le FD2O (voir tableau des matériaux). Ajouter le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) immédiatement avant utilisation à une concentration finale de 1 mM.
  2. Ajouter 50 μL du tampon de lyse 1x directement sur le culot de la cellule et suspendre. Incuber ce sur la glace pendant 5 min.
  3. Sonicate pour 8 s en utilisant le mode d’impulsion constante à 40% (voir tableau des matériaux pour Sonicator; ajuster si nécessaire pour différents sonicateurs), en gardant l’extrait sur la glace.
  4. Faire tourner l’extrait à 4 ° c pendant 5 min à 16 000 x g. Le surnageant est la fraction protéique soluble. L’analyse de Bradford peut être effectuée pour déterminer la concentration de protéines si désiré.

4. préparation de l’échantillon

  1. Prélever 10 μL d’extrait de protéine soluble et ajouter 10 μL de tampon de SDS-échantillon de Laemmli 1x (4% de SDS, 20% de glycérol, 0,004% de bleu de bromophénol et 0,125 M de Tris-HCl, pH 6,8). Ne pas ajouter de réactifs réducteurs.
  2. Conservez les échantillons sur la glace si l’analyse de la SDS PAGE sera effectuée ce jour-là; pour le stockage à long terme,-20 ° c est approprié. Juste avant d’exécuter le gel, chauffer l’échantillon pendant 5 min à 85 ° c.

5. in vivo formaldéhyde réticulation des protéines endogènes dans les cellules U-2 OS

  1. Cultivez des cellules OS U-2 dans un flacon de 175 cm2 à 70% – 80% de Confluences (voir rubrique 1).
  2. Effectuer la réaction de réticulation du formaldéhyde
    1. Dans une hotte, aliquote une solution de formaldéhyde à 37% achetée à partir de sources commerciales. Ajouter le fixatif de formaldéhyde directement au milieu à une concentration finale de 1% et incuber à température ambiante avec une agitation douce pendant 15 min.
    2. Pour étancher la réaction, ajouter 1,25 M glycine à une concentration finale de 0,125 M et incuber à température ambiante avec une agitation douce sur un rocker pendant 5 min.
  3. Laver les cellules avec 5 mL de PBS froid trois fois. Aspirer la solution finale de lavage de PBS et ajouter 10 mL de PBS. Gratter les cellules du fond de la fiole à l’aide d’un grattoir cellulaire.
  4. À l’aide d’une pipette de 10 mL, prélever le PBS et la suspension cellulaire et distribuer tout le liquide dans un tube de centrifugation conique de 15 mL. Faire tourner les cellules à 500 x g pendant 2 min à 4 ° c. Aspirer le PBS, laissant le culot de la cellule derrière.

6. fractionnement des noyaux

  1. Préparer 10 mL de tampon d’homogénéisation: 0,25 M de saccharose, 1 mM d’EDTA, 10 mM d’HEPES et 0,5% de BSA à pH 7,4. Ajouter le PMSF immédiatement avant utilisation à une concentration finale de 1 mM et 3mL de tampon de suspension de noyaux (0,1% de Triton X-100 dans le PBS).
  2. Ajouter 5 mL de tampon d’homogénéisation directement sur le culot de la cellule et suspendre complètement. Centrifuger la suspension à 500 x g pendant 2 min à 4 ° c puis jeter le surnageant.
  3. Suspendre le culot dans 5 mL de tampon d’homogénéisation. Utiliser un homogénéisateur de verre-Teflon serré, dounce homogénéiser les cellules à 10 coups/500 RPM.
  4. Centrifuger la suspension à 1 500 x g pendant 10 min à 4 ° c, puis jeter le surnageant.
    Remarque: Utiliser le surnageant pour isoler les mitochondrias en centrifugeant à 10 000 x g pendant 10 min.
  5. Suspendre le culot dans un tampon de suspension de noyaux de 1 mL et incuber sur la glace pendant 10 min.
  6. Centrifuger à 600 x g pendant 10 min. jeter le surnageant.
  7. Suspendre le culot dans 1 mL de tampon de suspension de noyaux et centrifuger à nouveau. Jetez le surnageant. Le culot final sera des noyaux isolés.

7. extraction de protéines

  1. Répéter la section 4, sauf en ajoutant 25 μL du tampon de lyse 1x directement au culot de la cellule puis en suspendant.

8. préparation de l’échantillon

  1. Préparer deux échantillons pour la SDS-PAGE en prenant 10 μL chacun de l’extrait de protéine soluble et ajouter 10 μL de 2x tampon de SDS-échantillon de Laemmli et 1 μL de 2-mercaptoéthanol (BME).
  2. Chauffer un échantillon pendant 5 min à 37 ° c et le deuxième échantillon pendant 15 min à 98 ° c pour inverser la liaison croisée formaldéhyde.

9. analyse SDS-PAGE

  1. Préparer 1 L de tampon de course de Tris-Glycine 1x (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% (p/v) SDS).
  2. Configurez l’appareil de fonctionnement SDS-PAGE.
    Remarque:     ce protocole utilise une page SDS TGX de 16% préfabriqué. De note, n’importe quel pourcentage de gel peut être utilisé.
    1. Par le protocole du fabricant, ouvrez le paquet dans lequel le gel est stocké et retirez la cassette.
    2. Retirez le peigne qui est en alignant les puits et la bande du bas de la cassette.
    3. Placez le gel dans l’appareil de roulement.
    4. Remplissez la chambre avec le tampon de fonctionnement 1x jusqu’à ce que les puits soient immergés dans le liquide. À l’aide d’un pipetage en plastique, rincer les puits avec le tampon de roulement.
  3. Chargez les échantillons sur le gel ainsi que 10 μL de marqueur standard préteinté.
  4. Faire fonctionner le gel à 200 V jusqu’à ce que le front de teinture soit à environ 1 cm du fond du gel.

10. Western Blot

  1. Préparer 1 L de tampon de transfert 1x (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% méthanol) et conserver à 4 ° c jusqu’à l’utilisation.
  2. Retirez délicatement le gel et ouvrez la cassette. À l’aide d’un rasoir, coupez soigneusement et jetez le gel d’empilage. Ramasser le gel en utilisant un coin et le placer dans un plateau avec tampon de transfert, ce qui lui permet de roche doucement pendant 5 min.
  3. Pendant que le gel bascule, placez un bloc de glace (stocké dans-20 ° c) dans le réservoir de transfert et ajoutez le tampon de transfert à 3/4 plein.
  4. Mouiller la membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) en la trempant dans 100% de méthanol pendant 30 s.
  5. Une fois que les 5 min ont passé, préparez-vous à mettre en place le transfert dans un plateau avec tampon de transfert. Le tampon de transfert doit être suffisant pour submerger complètement la tache. Réglez le transfert de la tache comme suit: en bas, le fond du support de cassette (noir); puis une éponge épaisse, du papier buvard extra épais, du gel de polyacrylamide, une membrane PVDF, du papier buvard extra épais et une éponge épaisse; puis enfin le haut du support de cassette (blanc) en haut.
  6. Verrouiller la cassette et placer l’appareil dans le réservoir de transfert avec la membrane PVDF vers l’anode positive et le gel vers le négatif. En haut de l’unité avec tampon de transfert jusqu’à ce que votre transfert est complètement submergé.
  7. Placez l’appareil au-dessus d’une plaque d’agitation. Ajouter une barre de brassage à l’unité et commencer à remuer à 125 tr/min.
  8. Courir à 100 V pour 60 min.
  9. Pendant que le transfert est en cours, préparez une solution de 5% de lait en poudre dissous dans la solution saline tamponnée au tris, avec Tween-20, pH 7,5 (TBST).
  10. Démonter l’unité et enlever la membrane, en notant quel côté était en contact avec le gel; Assurez-vous que ce côté reste dans le tiroir pour les étapes restantes.
  11. Faire tremper la membrane pendant 2 min dans une solution saline tamponnée (TBS) suivie d’un blocage de la membrane en incubant dans 5 mL de 5% de lait-TBST pendant 30 min à température ambiante.
  12. Remplacez le lait par une solution fraîche de 4 mL de lait-TBST de 5% et ajoutez l’anticorps primaire à la dilution appropriée (dans ce cas, notre dilution est de 1:2000 pour l’anticorps dUTPase) et incubez pendant la nuit avec un léger balancement à 4 ° c.
  13. Le jour suivant, retirez la tache du rocker de 4 ° c à une bascule de température ambiante, en rejetant la solution d’anticorps primaire.
  14. Faire trois lavages rapides avec TBST, en utilisant assez de liquide pour submerger complètement la tache, suivie de 3 lavages, 5 min chacun, bascule lentement.
  15. Après le dernier lavage, ajouter 5 mL de la solution 5% Milk-TBST et faire basculer la tache pendant 15 min puis la jeter.
  16. Ajouter l’anticorps secondaire dilué dans 5% de lait-TBST à la concentration désirée. (Dans ce cas, dilution 1:5000 de chèvre anti-lapin dilué dans 5 mL de 5% de lait-TBST solution)
  17. Incuber à température ambiante, à bascule pendant 1 h, puis jeter la solution.
  18. Faites trois lavages rapides avec le TBST suivi de 3 lavages, 5 min chacun, bascule lentement, puis jetez le lavage final et ajoutez 5 mL de TBS.
  19. Préparer un mélange 1:1 de solutions de détection chimiluminescente ECL (1 mL de chaque réactif pour un volume final de 2 mL) et l’ajouter directement à la tache incubant pendant 1 min.
  20. Retirez la membrane à l’aide de pinces et tamponnez le coin avec une lingette de laboratoire, en éliminant toute solution excédentaire. Placez la membrane dans un enveloppement rétractable et placez le côté protéique dans une cassette à rayons x.
  21. Exposer la membrane au film radiographique. Le temps d’exposition variera.

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Résultats

La dUTPase nucléaire forme une liaison disulfure intermoléculaire formant une configuration dimère stable grâce à l’interaction de deux résidus de cystéine positionnés au troisième acide aminé de chaque protéine monomère11. Ceci est démontré dans la figure 1a, B. Pour s’assurer que cette liaison disulfure n’était pas une interaction non spécifique en raison d’anomalies de la migration dans l’environnement non réduit, t...

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Discussion

La méthode décrite ici donne un protocole direct pour l’analyse des complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures. Ce protocole peut facilement être adapté à d’autres lignées de culture cellulaire, des tissus et des organismes permettant une large gamme d’applications.

Une étape importante dans cette procédure est de s’assurer que les liaisons disulfure ne sont pas une conséquence de la procédure d’extraction. Tous les résidus de cystéine libre peuvent être bloqués en utilisant l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts avec le contenu de ce manuscrit.

Remerciements

Nous apprécions avec gratitude les efforts déployés par le Dr Jennifer Fischer pour la purification de l’anticorps polyclonaux dUTPase et Kerri Ciccaglione pour tous ses efforts pour aider à éditer ce manuscrit. Cette recherche a été partiellement appuyée par une subvention de la New Jersey Health Foundation (Grant #PC 11-18).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
16 % préfabriqué TGXgels ThermoFisherXp00160
175 cm2 FlaconCell star658175
18COATCCCRL-1459
6 cm2 paraboleVWR10861-588
A549ATCCCCL-185
Amersham ECL kit de détectionGE
Appareil de transfert de transfert de transfertBiorad153BR76789
BMESigma AldrichM3148
Réactif protéique BradfordBiorad5000006
bromophénol
BSASignalisation cellulaire99985
Tampon de lyse cellulaireSignalisation cellulaire9803
CentrifugeuseEppendor5415D
DMEMGibco11330-032
Perceuse
EDTASigma AldrichM101
Appareil d’électrophorèseInvitrogenA25977
Papier western blot extra épaisThermoFisher88610
Fetal sérum bovinGibco1932693
FormaldéhydeThermoFisher28908
Homogénéisateur
GlycérolSigma Aldrich65516
GlycineRPI636050
Bloc chauffantDenville10285-D
HepesSigma AldrichH0527
Acide chlorhydriqueVWR2018010431
IodoacétamideThermoFisher90034
KimwipeKimtech34155
MéthanolPharmco339000000
Lait écrémé en poudreSignalisation cellulaire99995
PBSSigma AldrichP3813
PMSFSigma Aldrich329-98-6
Posi-click tubeDenvilleC2170
AlimentationBiorad200120
Marqueur précoloréThermoFisher26619
Membrane PVDFBiorad162-0177
RockerReliable Scientific55
Saos2ATCCHTB-85
SDSBiorad161-0302
Anticorps secondaireSignalisation cellulaire70748
Grattoir à petites cellulesTygonS-50HL classe VI
Chlorure de sodiumRPIS23020
Pyruvate de sodiumGibco
SonicatorBranson450
Tampon éponge pour buvardInvitrogenE19051
Plaque d’agitationCorningPC353
SaccharoseSigma AldrichS-1888
Tris BaseRPIT60040
Tris Saline tamponnée, avec Tween 20, pH 7,5Sigma AldrichSRE0031
Tris-Glycine Tampon courantVWRJ61006
Triton X-100Sigma AldrichT8787
Tween 20Sigma AldrichP9416
U-2 OSATCCHTB-96
Film radiographiqueThermoFisher34090
16817200Bleu deverre-téflon

Références

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Réimpressions et autorisations

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