Électrorétinogramme enregistrement chez le poisson zèbre larvaire, à l’aide d’électrode de pointe éponge en forme de cône de roman A

Résumé

Nous présentons ici un protocole qui simplifie la mesure de lumière électrorétinogramme évoqués réponses des larve zebrafish. Une électrode roman éponge-pointe conique peut aider à rendre l’étude du développement visuel chez le poisson zèbre larvaire, à l’aide de l’électrorétinogramme ERG plus facile à réaliser avec des résultats fiables et à moindre coût.

Résumé

Le poisson zèbre (Danio rerio) est couramment utilisé comme un modèle de vertébrés dans les études sur le développement et est particulièrement adapté pour la neuroscience visuelle. Pour les mesures fonctionnelles de performance visuelle, électrorétinographie (ERG) est une méthode non invasive idéale, qui a été bien établie dans les espèces de vertébrés supérieurs. Cette approche est plus en plus utilisée pour l’examen de la fonction visuelle chez le poisson zèbre, y compris pendant les premiers stades du développement larvaires. Toutefois, l’électrode d’enregistrement plus couramment utilisés pour les larve zebrafish ERG à ce jour est l’électrode de verre micropipette, qui nécessite un équipement spécialisé pour sa fabrication, présentent un défi pour les laboratoires disposant de ressources limitées. Nous présentons ici un protocole ERG de larves de poisson zèbre à l’aide d’une électrode embout éponge en forme de cône. La nouvelle électrode est plus facile de fabriquer poignée, plus économique et moins susceptible d’endommager l’oeil larvaire que la micropipette de verre. Comme méthodes ERG publiées antérieurement, le protocole actuel peut évaluer la fonction rétinienne externe par le biais de photorécepteur et réponses des cellules bipolaires, l’a - et b-vague, respectivement. Le protocole peut illustrent clairement le raffinement de la fonction visuelle au cours du développement précoce des larves de poisson zèbre, soutenant l’utilitaire, sensibilité et fiabilité de l’électrode de roman. L’électrode simplifiée est particulièrement utile lorsque établissant un nouveau système ERG ou modifier l’existant appareils d’ERG de petits animaux pour mesure de poisson-zèbre, aider des chercheurs en neurosciences visuels à utiliser le poisson-zèbre modèle organisme.

Introduction

Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un modèle génétique de vertébrés largement utilisé, y compris des études de neurosciences visuels. La popularité croissante de cette espèce peut être attribuée aux avantages dont la facilité de manipulation génétique, hautement conservée vertébré système visuel (types de neurones, la morphologie anatomique et organisation et génétique sous-jacente), forte fécondité et pour un coût de gestion des ressources par rapport aux modèles mammifères¹. La non invasif électrorétinogramme (ERG) a longtemps été utilisé sur le plan clinique pour évaluer la fonction visuelle humaine et en laboratoire afin de quantifier la vision dans un éventail d’espèces grandes et petites, y compris les rongeurs et les larves de poisson zèbre^{2,3 , 4 , 5}. les composants ERG plus couramment analysés sont l’une onde et ondes b, originaires de la détection de lumière les photorécepteurs et les interneurones bipolaires, respectivement. Chez le poisson zèbre larvaire, couches distinctes dans la rétine sont établis par la fertilisation après 3 jours (dpf) et la morphologie du cône terminal photorécepteur synapses matures avant 4 dpf^6,7. La fonction rétinienne externe du poisson-zèbre larvaire est donc établie avant dpf 4, ce qui signifie que l’ERG est mesurable à partir de cet âge précoce à partir. En raison du cycle court expérimental et les propriétés haut débit du modèle, l’ERG a été appliqué aux larve zebrafish pour évaluation fonctionnelle des modèles de maladies, analyse de vision et la rétine de coloration, l’étude des rythmes circadiens visuels et essai de drogue^8,9,10,11,12.

Toutefois, les approches actuelles pour le poisson-zèbre larvaire ERG a certaines complexités qui peuvent rendre plus difficile à adopter. Publié zebrafish larvaire ERG protocoles utilisent généralement une micropipette de verre remplie de liquide conducteur sous l’enregistrement électrode^3,4,5,13, qui exige une micropipette de haute qualité Astuce³. Équipement spécialisé, comme un de micropipettes et dans certains cas, une microforge, sont nécessaires à leur fabrication. Cela peut être un défi pour les laboratoires disposant de ressources limitées et entraîne des coûts supplémentaires même lors de l’adaptation des systèmes ERG animaux petits disponibles pour la mesure de la fonction visuelle de larves de poisson zèbre. Même lorsque le lissé, le bout pointu micropipette pouvant endommager la surface de le œil larvaire. En outre, titulaires d’une micropipette commerciale pour l’électrophysiologie sont construits avec un fil d’argent fixe. Ces fixes fils devient passivés après utilisation répétitive, nécessitant l’achat des nouveaux titulaires, entraînant des coûts de maintenance accrus.

Nous décrivons ici une méthode ERG à l’aide d’une électrode d’enregistrement pointe éponge en forme de cône, qui est particulièrement utile pour l’adaptation des configurations d’ERG petits animaux établies pour les larves de poisson zèbre ERG mesures. L’électrode est facilement fait à l’aide de la commune éponge d’acétate de polyvinyle (PVA) et fil d’argent fin sans n’importe quel autre équipement spécialisé. Nos données montrent que cette nouvelle électrode est sensible et assez fiable pour démontrer le développement fonctionnel des circuits neuraux rétiniennes en larve zebrafish entre 4 et 7 dpf. Cette électrode embout éponge économique et pratique peut être utile pour les chercheurs en établissant de nouveaux systèmes ERG ou de modifier les systèmes existants de petits animaux, d’études de poisson-zèbre.

Protocole

Toutes les procédures de l’électrorétinogramme (ERG) ont été réalisés selon les dispositions du code de pratique pour les soins Australian National Health and Medical Research Council et l’utilisation des animaux et ont été approuvés par le Comité institutionnel d’éthique animale à la Université de Melbourne.

1. préparation de la mémoire tampon

1. Préparer le mémoire tampon poisson rouge Ringer 10 x (1,25 M NaCl, KCl 26 mM, 25 mm CaCl₂, 10 mM MgCl₂, glucose 100 mM, 100 mM HEPES) à l’aide de l’eau par osmose inverse (RO). Ajuster la mémoire tampon à pH 7,8 et stériliser le tampon à l’aide de 0,22 μm filtre. Stocker le tampon de 10 x à 4 ° C comme la solution stock³.
   Remarque : La mémoire tampon solution de Ringer 10 x doit être utilisé dans les 3 mois.
2. Le jour de l’expérience, faire 1 x tampon de goldfish Ringer en diluant le mémoire tampon Cyprin doré Ringer 10 x à l’aide de l’eau osmosée.
   Remarque : Le 1 x tampon de goldfish Ringer est utilisé pour saturer l’éponge PVA, y compris l’éponge utilisée pour le positionnement du poisson-zèbre larvaire et l’éponge sur la pointe de l’électrode d’enregistrement.

2. préparation de l’électrode

1. Préparer l’électrode d’enregistrement éponge en forme de cône.
   1. Couper l’extrémité mâle de l’extension de plomb d’électrode de platine et retirer de l’extrémité de 10 mm de l’enduit d’isolation polytétrafluoroéthylène externe à l’aide d’une lame de bistouri. Prendre soin de ne pas pour endommager le câble intérieur de la tête de l’électrode.
   2. Couper une longueur de 40 mm de fil d’argent (0,3 mm de diamètre) et fixez-la solidement à la tête de l’électrode par ville le fil d’argent avec le câble intérieur exposé. Envelopper l’articulation à l’aide d’un ruban isolant, laissant une longueur d’environ 15 mm de fil d’argent exposé (Figure 1 a).
   3. Plaquer le fil d’argent exposé chlorurées utilisant une source de V DC 9 pendant 60 s pour améliorer la conduction du signal. Plonger la pointe d’argent exposée dans une solution saline normale et branchez l’autre extrémité à la borne positive de la batterie. Connecter un autre fil sur la borne négative de la batterie et plonger l’autre extrémité du fil dans la saline².
      Remarque : Alternativement, la chloration du fil d’argent par trempage pendant 1 heure dans une solution d’eau de Javel (hypochlorite de sodium de l’ingrédient actif 42 g/L).
   4. Couper un carré de PVA de ~ 20 x 20 mm à l’éponge avec des ciseaux pour faire un cône (Figure 1 a). Saturer l’éponge à l’aide de 1 x tampon de Ringer. Sous un microscope avec une barre d’échelle sur l’oculaire, utiliser une lame de bistouri pour façonner l’apex du cône ~ 40 µm de diamètre. Sécher à l’air l’éponge en forme de cône sur du papier absorbant jusqu'à ce qu’elle est solide.
      Remarque : L’éponge PVA élargit considérablement lorsque saturé, il est donc important que l’éponge est tout d’abord saturé avec du sérum physiologique avant le sommet du cône de mise en forme.
   5. Après chloration, sécher à l’air le fil d’argent sur un tissu absorbant pendant 5 min. insérer le fil d’argent dans l’éponge PVA séchée, solide, en forme de cône dans la base du cône. Isolez tout excès métal exposé à l’aide de ruban masque pour réduire les artefacts photovoltaïques (Figure 1 b-C).
      Remarque : Après chaque session expérimentale, retirer le fil d’argent sur l’éponge. Laver l’éponge avec de l’eau osmosée et sécher à l’air pour la réutilisation. Pour assurer la perception de signal optimal, usage unique du fil d’argent est recommandé. PVA éponges ne devraient pas être réutilisés plus de 5 fois.
   6. Le jour de l’expérience, plonger le bout de l’électrode d’enregistrement éponge dans 1 x tampon de Ringer au moins 15 min saturer complètement l’éponge.
2. Préparer les électrodes de référence tel que décrit ci-dessus, mais sans y attacher la pointe éponge.
3. Obtenir l’électrode de masse sur le marché.

3. préparation de poisson-zèbre

1. Obscurité adapter des larves de poisson zèbre du jour au lendemain (> 8 h) avant les enregistrements en plaçant le poisson-zèbre dans un tube de 15 mL (< 20 larves par tube) enveloppé dans du papier d’aluminium dans un incubateur à foncé. Enlever le couvercle afin d’assurer un approvisionnement suffisant d’oxygène.
2. Le jour de l’enregistrement, serrer le couvercle au tube falcon papillote contenant des larves, puis assurez-vous que le tube est opaque. Larves de transport vers le laboratoire de l’ERG.
3. Verser le poisson dans des boîtes de pétri dans l’obscurité, avec l’aide de dim éclairage rouge par une diode électroluminescente (LED ; 17,4 cd.m^-2, λ_max 600 nm). Couvrir des boîtes de pétri à l’aide de serviettes opaque afin de minimiser l’exposition à la lumière.

4. préparation de la plate-forme de l’éponge

1. Couper un rectangle d’éponge sèche de PVA pour s’adapter confortablement dans une boîte de pétri de 35 mm. Veiller à ce que l’épaisseur de l’éponge doit être à peu près égale à la profondeur de la boîte de pétri.
2. Faire une petite incision verticale grâce à une extrémité de l’éponge pour accueillir le fil d’argent de l’électrode de référence.
3. Faire tremper l’éponge PVA dans 1 x tampon de goldfish Ringer jusqu'à saturation. Ensuite, placez l’éponge dans une boîte de Petri propre 35 mm. Utilisez une serviette en papier pour absorber le liquide supplémentaire jusqu'à ce qu’aucune solution ne s’échappe de l’éponge en réponse à une pression de doigt léger.

5. animal et le positionnement des électrodes

1. Anesthésier les larves à l’aide de tricaïne 0,02 % dilué dans 1 x tampon de goldfish Ringer.
2. Utiliser une pipette Pasteur de 3 mL pour transférer une larve anesthésiée sur un carré de papier essuie-tout (~ 3 cm²).
3. Placez la serviette en papier contenant la larve sur la plate-forme d’une éponge humide avec une pincette. Utilisez un pinceau trempé dans un tampon de Ringer pour ajuster la position de la larve. Veiller à ce qu’un œil fait face vers le haut, isolé de tout liquide à proximité sur la place du papier essuie-tout sous la larve.
4. Nappez le corps larvaire, à l’exception de la tête, avec hydratation gel ophtalmique pour garder la larve humide tout au long de l’enregistrement de l’ERG.
5. Placez la boîte de pétri avec la plate-forme de l’éponge sur une petite plate-forme, eau-chaude, devant le stimulus lumineux de Ganzfeld bol, situé à l’intérieur d’une cage de Faraday (Figure 1).
   Remarque : Maintien de la température de l’éponge et de l’organe larvaire assure des signaux ERG stables.
6. Insérer l’électrode de référence dans la coupe faite dans l’éponge de la plate-forme (Figure 1).
7. Connecter l’électrode de terre commercialement obtenus à la cage de Faraday.
8. Fixer l’électrode d’enregistrement sur un porte-électrode et fixer le support sur le bras stéréotaxique d’un micromanipulateur (Figure 1). Utiliser une pipette Pasteur de 3 mL à s’écouler une goutte de solution de Ringer sur la pointe de l’éponge de l’électrode pour la re-saturation 1 x.
9. Positionner le microscope dans la cage de Faraday sur la plate-forme de l’ERG pour le placement de l’électrode.
   Remarque : Illumination prévoir par une diode rouge terne (17,4 cd.m^-2, λ_max 600 nm) pour permettre l’observation de la larve et le placement de l’électrode active, tout en maintenant dark-adaptation.
10. Ajustez la position de la plate-forme de l’éponge pour permettre l’observation de la larve sous le microscope. Ensuite, utilisez le papier absorbant pour enlever le liquide en excès de la pointe de l’électrode éponge.
11. Positionnez l’électrode active de sorte qu’il touche doucement la surface centrale de la cornée de le œil de larves de poisson zèbre (Figure 1E).
12. Déplacer le bol Ganzfeld vers la plate-forme de l’éponge et faire en sorte que la larve est couvert par le bol.
13. Fermer la cage de Faraday pour réduire les bruits électromagnétiques.

6. enregistrement de l’électrorétinogramme

1. Utiliser le logiciel informatique du système ERG particulière (voir Table des matières pour plus de détails) pour déclencher le stimulus et d’acquisition de données basé sur les paramètres recommandés ci-dessous².
   1. Définissez la fréquence d’échantillonnage du système à 4 KHz sur une ms 650 enregistrement fenêtre (2 560 points) dans le logiciel d’acquisition.
   2. Réglez le gain du système à 1 000 ×.
   3. La valeur de filtrage passe-bande du système à 1 – 300 Hz.
   4. Utiliser un filtre pour réduire 60 Hz (ou 50 Hz, en fonction de la fréquence des services publics locaux) bruit.
      Remarque : Le niveau de bruit idéal ne doit être aucuns plus de ±10 µV.
2. Commencer la collecte de données à l’aide de la procédure décrite ci-dessous.
   1. Un seul essai-flash (0.06 log cd.s/m²) permet de mesurer une auscultation de le œil pour évaluer le positionnement des électrodes.
      Remarque : Cette intensité du flash test devrait se traduire par une amplitude d’onde b supérieure à 25 µV en larves 4-dpf. Si une réponse fiable ne peut être mesurée, puis repositionner les électrodes et faire un autre test flash pour confirmer que les électrodes sont bien placés.
   2. Après le test-éclair, laisser l’animal à l’obscurité s’adapter pendant 3 min dans l’obscurité complète avant d’enregistrements.
   3. Présenter des flashes de gradateur à des intensités lumineuses plus lumineuses.
   4. Moyenne des signaux à travers se répète selon le niveau de signal-bruit.
      Remarque : En général, moyenne des signaux plus le variateur intensité lumineuse (pas moins de 3 répétitions) et moins des luminosités plus lumineuses (habituellement 1 motif). Allonger progressivement l’intervalle de inter-relance entre 10 et 60 s depuis le niveau de luminosité plus faible à la plus brillante. Un protocole d’échantillonnage est indiqué dans le tableau 1.
   5. Après les enregistrements, humainement tuer les larves à l’aide de tricaïne 0,1 %.

7. analyse

1. Mesurer l’amplitude d’une onde de base à l’auge a ondes négative et l’amplitude de l’onde b le creux d’une onde négative jusqu’au sommet de l’onde b positif.
2. Mesurer les temps implicites d’ondes a et b entre l’apparition du stimulus pour le creux de la vague a et le pic de la vague b, respectivement.

Résultats

Cette section fournit des résultats représentatifs pour ERG mesures prises tous les jours de 4 à 7 dpf. 4 dpf, ERG réponses montrent robustes composants ondes a et b, qui résultent des photorécepteurs et les cellules bipolaires, respectivement. À chaque âge testé, l’amplitude de l’onde b augmente avec l’intensité de la lumière (Figure 2; Figure 3). En particulier, la sensibilité de la rétine de larves de poisson zèbre à variateur flashs augme...

Discussion

Affichages fonctionnels tels que l’ERG ont pris une important croissante à la suite d’outils utilisés pour l’étude des larves de poisson zèbre^8,9,12,14. En raison de l’exiguïté de le œil de larves de poisson zèbre, micropipettes de verre ont été adaptées comme l’enregistrement des électrodes en plus publiées protocoles^3,4,

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,22 et micro ; Filtre Millex	GP	SLGP033RS	Filtre le tampon de sonnerie de poisson rouge 10× pour la stérilisation
Seringue de 1 mL	Terumo	DVR-5175	Avec un 30G × ; ½ ; " aiguille pour ajouter des gouttes de solution saline à la pointe de l’éponge de l’électrode pour éviter le dessèchement et l’augmentation du bruit dans les signaux ERG.
30 G & fois ; ½ ; " aiguille	Terumo	NN*3013R	Pour l’ajout d’électrode de pointe toteh sopnge saline.
Bioamplificateur	ADInstruments	ML135	Pour l’amplification des signaux ERG.
Solution d’eau de Javel	King White	9333441000973	Pour une méthode alternative de chloration par électrode de ruban. Matière active : 42 g/L d’hypochlorite de sodium.
Bain d’eau à circulation	Lauda-Ko ?nigshoffen	MGW Lauda	Utilisé pour fabriquer le plateau chauffé à l’eau.
Câble d’électrode	Grass Telefactor	F-E2-30	Câbles Platinum pour connecter les électrodes en fil d’argent à l’amplificateur.
Faraday Cage	Photometric Solution International  ;		Pour maintenir l’adaptation à l’obscurité et entourer la configuration Ganzfeld afin d’améliorer le rapport signal/bruit.
Ganzfeld Bowl	Photometric Solution International  ;		Stimulateur de lumière conçu sur mesure : 36 mm de diamètre, taille d’ouverture de 13 cm.
Luxeon LEDs	Phillips Light Co.		Pour la stimulation lumineuse, vingt LED de 5W et une LED de 1W.
Micromanipulateur	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	Maintient l’électrode d’enregistrement pendant les expériences.
Microsoft Office Excel	Microsoft	version 2010	Tableur pour l’analyse de données.
Gel hydratant pour les yeux	GenTeal Gel	9319099315560	Utilisé pour couvrir les larves de poisson-zèbre pendant les enregistrements afin d’éviter la déshydratation. Principe actif : 0,3 % d’hypromellose et 0,22 % de carbomère 980.
Pipette Pasteur	Copan	200C	Utilisée pour le transfert soigneux des larves de poisson-zèbre.
Système d’acquisition de données Powerlab	ADInstruments	ML785	Contrôle les LED pour générer des stimuli.
Éponge PVA	MeiCheLe	R-1675	Pour le placement des larves de poisson-zèbre et la fabrication de l’électrode en forme de cône ti
Solution saline	Aaxis Pacific	13317002	Pour la galvanoplastie de l’électrode de fil d’argent.
Scope Software	ADInstruments	version 3.7.6	Déclenche simultanément le stimulus via le système Powerlab et collecte des données
Silver (fil rond fin)	A& E métal	0,3 mm	Utilisé pour faire des électrodes ERG d’enregistrement et de référence.
Stéréomicroscope  ;	Leica	M80	Utilisé pour façonner et mesurer le sommet de l’éponge en forme de cône (avec barre d’échelle sur l’oculaire). Positionné dans la cage de Faraday pour le placement des électrodes.
Tricaïne  ;	Sigma-aldrich	E10521-50G	Pour l’anesthétisation des larves de poisson-zèbre.
Plate-forme chauffée à l’eau	sur		Pour maintenir la température de la plate-forme éponge et du corps larvaire lors des enregistrements ERG