Capture de petites molécules Communication entre les tissus et les cellules à l’aide d’imagerie de la spectrométrie de masse

Résumé

Une nouvelle méthode de préparation de l’échantillon a été développée pour accueillir la co-culture de cellules et de tissus pour détecter l’échange de petites molécules à l’aide de la spectrométrie de masse d’imagerie.

Résumé

Imagerie de spectrométrie de masse (IMS) a été systématiquement appliquée à trois types d’échantillons : coupes tissulaires, sphéroïdes et colonies microbiennes. Ces types d’échantillons ont été analysés à l’aide de spectrométrie de désorption-ionisation laser assistée par matrice time-of-flight masse (MALDI-TOF MS) de visualiser la répartition des protéines, des lipides et métabolites dans l’ensemble de l’échantillon biologique d’intérêt. Nous avons développé une méthode de préparation d’échantillon roman qui combine les forces des trois demandes précédentes pour déterminer une démarche sous-explorée pour identifier la communication chimique dans le cancer, par ensemencement des cultures de cellules de mammifères en gel d’agarose dans coculture avec des tissus sains, suivies par la dessiccation de l’échantillon. Cellules et tissus de mammifères sont cultivées à proximité permettant la communication chimique par diffusion entre les tissus et les cellules. À des moments spécifiques, l’échantillon d’agarose est séché de la même manière que des colonies microbiennes préparé pour l’analyse de l’IMS. Notre méthode a été développée afin de modéliser la communication entre le cancer des ovaires séreuse haut grade dérivé de la trompe de Fallope comme il interagit avec l’ovaire au cours de la métastase. Optimisation de la préparation de l’échantillon a permis l’identification de la noradrénaline comme composante chimique clé dans le microenvironnement ovarienne. Cette méthode nouvellement mis au point peut être appliquée à d’autres systèmes biologiques qui nécessitent une compréhension de la communication chimique entre les cellules adjacentes ou de tissus.

Introduction

Imagerie de la spectrométrie de masse (IMS) a été optimisé afin de caractériser la distribution spatiale des caractéristiques moléculaires en trois applications utilisées : tranches de tissus, sphéroïdes et colonies microbiennes^1,2,3. Tranches de tissus peuvent servir à évaluer la localisation des métabolites dans le contexte des conditions biologiques dans une foule, ciblées ou non ciblées dans une plage de masse déterminée. Toutefois, les différences entre les caractéristiques moléculaires sont la plus importante et la plus évidente lorsqu’un tissu sain est comparé à une condition de malade, par exemple, une tumeur. Cette approche de l’IMS est particulièrement adaptée à la détection des biomarqueurs de la maladie, cependant, acquisition d’échantillons de tissus à des stades distincts dans la progression de la maladie (par exemple les grades de la tumeur) s’oppose à l’identification des signaux qui pourraient être importantes pour l’initiation de la maladie. L’échange d’informations par le biais de l’espace est un élément omniprésent de nombreux systèmes biologiques, et tranches de tissus ne peuvent pas capturer ce relais dynamique chimique. Une technique qui peut être capable de visualiser la diffusion et l’échange chimique est IMS des colonies microbiennes cultivées sur gélose ; petites molécules peuvent se diffuser à travers et l’agar et peuvent être capturés par l’intermédiaire de spectrométrie de masse (MALDI-TOF) de désorption-ionisation laser assistée par matrice⁴. Cette configuration de croissance peut être utilisée pour identifier des molécules échangées entre des entités biologiques discrets (colonies) et peut aussi déterminer la directionnalité de la production de métabolites. La plate-forme conçue initialement pour la croissance des colonies microbiennes a été adaptée pour explorer le métabolisme primaire des tissus explants cultivés avec des cellules de mammifères, et IMS a été utilisée pour évaluer l’échange chimique dynamique dans un système in vitro chez les mammifères.

Dans les dernières années, il est devenu clair que le cancer ovarien séreux de haut grade (HGSOC) est souvent originaire de l’épithélium de la trompe de Fallope (ETP) et puis métastase dans l’ovaire au cours de la maladie début développement^{5,6, 7 , 8}. la raison que les ETP tumorigène cellules propagation à l’ovaire, où les grosses tumeurs finissent par forment et métastases plus loin, est actuellement incertaine. Des recherches antérieures a mis l’accent sur le rôle des protéines ovariens à la métastase primaire à l’ovaire ; Toutefois, il a récemment été démontré que la transition entre un milieu sain et un tissu tumorigène entraîne une perturbation massive du métabolisme cellulaire et modifie la production de petites molécules^9,10,11. C’est pourquoi, nous avons supposé que les petites molécules échangées entre l’ETP et de l’ovaire peuvent être en partie responsables de la métastase primaire de HGSOC.

En suivant notre procédure IMS nouvellement mis au point, nous avons déterminé que co-culture d’ETP tumorigène et tissu ovarien sain induit la production de noradrénaline par l’ovaire. Toutefois, autres types de cellules ou les cellules normales d’ETP ne pas permis d’obtenir cet effet. Un extraordinaire avantage de cette méthode est que la production moléculaire et l’échange de signaux qui représentent de véritables molécules peuvent être visualisées, ainsi, même dans une co-culture, il est possible de déterminer la source d’un signal. Il s’agit d’un avantage par rapport à l’analyse des échantillons homogénéisés, où toutes les informations spatiales sont perdues. Dans notre système de modèle, nous avons pu clairement affecter la production de noradrénaline à l’ovaire. La noradrénaline a été liée à la chimiorésistance des cancers de l’ovaire et des métastases, et notre détection de cette molécule a validé que la nouvelle méthode IMS peut découvrir des molécules biologiquement pertinente^{12,13, 14}. cette validation nous permet de proposer que cette nouvelle application d’IMS peut être particulièrement utile pour les groupes qui sont efforcent d’identifier des petites molécules dans des environnements de co-culture et pour comprendre les événements précoces qui influent sur la transformation des cellules de recherche et la métastase. L’objectif général de cette méthode est d’élucider l’identité et la distribution spatiale des petites molécules au cours de l’échange entre les tissus et organes, représentées par cultures de cellules 3D de in vitro ou ex vivo des tissus.

Protocole

Toutes les procédures d’animaux étaient conformes à la National Institutes of Health Guidelines pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvé par le Comité institutionnel Animal Use et soin (IACUC) à l’Université de l’Illinois à Chicago.

1. préparation des réactifs

1. Maintenir l’épithélium tubaire murin (MOE) cellules à 37° C, avec 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié dans alpha médias milieu essentiel Minimum (αMEM) additionné de sérum de veau fœtal 10 % sélénium (FBS), 2 mM de L-glutamine, 10 mg/mL d’insuline, transferrine, (STI) , 1,8 facteur de croissance épidermique (EGF), ng/mL 100 U/mL de pénicilline-streptomycine, 1 mg/mL de gentamycine et 18,2 ng/mL d’estradiol-17β. Les cellules du col tous les 3-4 jours, assurant que le même jour, il y a suffisamment de cellules les souris seront sacrifiés.
2. Préparer 2 % d’agarose en mélangeant 1 g d’agarose low-melting avec 50 mL d’eau distillée. Autoclave l’agarose, laisser refroidir et puis aliquote (1 mL) dans 2 mL tubes (voir Table des matières) avant de l’agarose se solidifie. Agarose peut être stockée indéfiniment à-20 ° C.
3. Préparer au moins 2 mL de média de Medium (DMEM) de l’aigle de la modification de 1 x Dulbecco.
4. Pour la matrice MALDI-TOF MS, préparer 10 mL de 5 mg/mL d’acide alpha-cyano-4-hyroxycinnamic 1:1 (ACSSD) : acide dihydroxybenzoïque (DHB) (voir la Table des matières) dans les 90/10 ACN:H₂O + 0,1 % d’acide trifluoroacétique (TFA). Laisser agir la solution jusqu'à ce que la matrice est dissoute.

2. la souris colonie et retrait de l’ovaire

1. Maintenir les couples reproducteurs de souris CD-1 à l’aide de procédures standard de logement. Près le jour de l’accouchement, vérifier les souris tous les jours pour que l’âge des petits est connue.
2. Euthanasier les chiots 16 – 18 jours après la naissance de CO₂ par inhalation selon les directives des NIH. Livrer de CO₂ (100 %) à un débit taux de 10 % – 20 % volume par minute de chambre et continuer pendant deux minutes après que la respiration s’était arrêté. Confirmer l’euthanasie par dislocation cervicale.
3. Désinfecter tout le matériel chirurgical en immergeant dans l’éthanol à 70 %. Réchauffer des médias L-15 de Leibovitz avec 1 x pénicilline-streptomycine à 37 ° C.
4. Mouiller la surface abdominale avec de l’éthanol 70 % pour désinfecter la zone et pour minimiser la contamination avec des cheveux. Saisissez la peau recouvrant la paroi abdominale utilisant émoussé forceps et l’utilisation des ciseaux chirurgicaux pour faire une grande forme en V coupe à travers la peau et la paroi abdominale, exposant les organes internes.
5. Déplacer les organes internes sur le côté avec une pincette. Individuellement, saisir chaque corne utérine avec une pince fine et soulevez légèrement.
6. Localiser l’ovaire, qui aura lieu à la fin de la corne utérine, immédiatement en dessous du rein. Utiliser des ciseaux chirurgicaux à disséquer l’ovaire libre du tissu conjonctif. Ensuite, couper la corne ovarienne en deux.
7. Déplacer l’ovaire, l’oviducte et environ une moitié de chaque corne utérine aux médias L-15 de Leibovitz préchauffé.
8. Sous un microscope à dissection déplacer délicatement chaque ovaire de la bursa environnante, libérant de l’oviducte, bursa et tout le tissu adipeux. Passer chaque ovaire à un nouveau plat des médias L-15 de Leibovitz.
9. Couper chaque ovaire en deux axialement. Garder les morceaux ovariennes (maintenant appelés explants) maintenues à 37 ° C jusqu’au bordé d’agarose.

3. mise en place et en Incubant la diapositive imprégnées d’ITO pour Cocultures

1. Indivis cocultures
   1. Liquéfier l’agarose à 70 ° C sur une plaque chauffante.
   2. Placer le diviseur de 8 puits sur le dessus de la tinoxide d’indium (ITO)-lame traitée (Figure 1 a). Le fond en caoutchouc sur le diviseur du sida dans l’adhésion à la diapositive, mais assurez-vous d’appliquer continue légère pression à la baisse au cours de l’électrodéposition d’agarose pour garantir aucune fuite ou mélange entre puits.
   3. Prélever des cellules dans un tube conique de 15 mL, centrifugeuse (5 min à 800 tr/min) et remettre en suspension les cellules par 150 µL dans 1 x DMEM médias à 50k. Si une densité cellulaire différente est optimale, veillez à ce que, à cette étape, la suspension cellulaire est 2 x la densité finale souhaitée (par exemple, pour une concentration finale de 50 000 cellules dans 300 µL, densité cellulaire à cette étape est de 50 000 cellules dans 150 µL).
   4. Avant l’ensemencement de la culture cellulaire, ajouter explant ovarienne au centre du puits (Figure 1 b).
   5. Ajouter agarose à chaque culture de cellules dans des tubes individuels 2 mL juste avant l’ensemencement. Pour chaque puits, mélanger 200 µL de suspension cellulaire et 200 µL d’agarose liquéfié dans un tube de 2 mL. Par exemple, pour quatre puits, mélanger 800 µL de suspension cellulaire et 800 µL d’agarose à 2 %. Un mélange sera laissé, mais ce qui rend un peu plus nécessaire évite les bulles d’air pendant le pipetage.
      1. Ajouter agarose aux cultures de cellules individuelles, immédiatement avant cette culture cellulaire de placage. L’agarose va refroidir en moins d’une minute, alors soyez prêt à plaque rapidement.
   6. Immédiatement ajouter 300 µL du mélange cellulaire / d’agarose dans chaque puits (Figure 1). Figure 1 montre les trois conditions de la cellule et l’état d’un média, que chacun plaqué avec et sans un ovaire.
   7. Incuber à lame à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié.
2. Cocultures divisées.
   1. Couper des séparateurs de plastique mince et lisse (Figure 2 a).
      Remarque : Cette expérience utilise les côtés d’un bassin de stériles jetables médias parce qu’ils sont plat et mince. Coupez-les juste assez large pour s’adapter parfaitement à l’hypoténuse du puits (~ 13 mm).
   2. Liquéfier l’agarose à 70 ° C sur une plaque chauffante.
   3. Placer le diviseur de 8 puits sur le dessus de la diapositive imprégnées d’ITO (Figure 2 b). Le fond en caoutchouc sur le diviseur du sida dans l’adhésion à la diapositive, mais assurez-vous d’appliquer continue légère pression à la baisse au cours de l’électrodéposition d’agarose pour garantir aucune fuite ou mélange entre puits.
   4. Prélever des cellules dans un tube conique de 15 mL, centrifugeuse (5 min à 800 tr/min) et remettre en suspension les cellules par 150 µL dans 1 x DMEM médias à 50k. Si une densité cellulaire différente est optimale, assurez-vous que, à cette étape, la suspension cellulaire est 2 x la densité finale souhaitée (par exemple pour une concentration finale de 50 000 cellules dans 300 µL, densité cellulaire à cette étape est 50 000 cellules dans 150 µL).
   5. Insérer des intercalaires en plastique en diagonale dans les puits (Figure 2).
   6. Ajouter agarose à chaque suspension de cellules, un à la fois juste avant l’ensemencement. Pour chaque puits, mélanger 100 µL de suspension cellulaire et 100 µL d’agarose liquéfié dans un tube de 2 mL. Par exemple, pour quatre puits, mélanger 400 µL de culture cellulaire et 400 µL d’agarose à 2 %. Un mélange de cellules/agarose restera-t-il mais ce qui rend un peu plus nécessaire évite les bulles d’air pendant le pipetage.
      1. Ajouter agarose aux cultures de cellules individuelles, immédiatement avant cette culture cellulaire de placage. L’agarose va refroidir en moins d’une minute, alors soyez prêt à plaque rapidement.
   7. D’un côté de la cloison, plaque 150 µL du mélange de cellule/gel d’agarose. Permettre d’agarose refroidir et se solidifier (environ un min) et ensuite enlever le séparateur (Figure 2D).
   8. Placer au centre de la moitié vide du puits ovaire explant. 150 place mélange de médias/agarose µL au-dessus de l’ovaire et seulement dans le bon côté du puits (Figure 2E).
   9. Incuber à lame à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié.

4. glisser de séchage et préparation de MALDI-TOF MS

1. Après quatre jours (ou n’importe quel point du temps préféré), enlever la cloison de la chambre des prises d’agarose et du toboggan (Figure 1). Détacher délicatement les côtés de l’agarose de la chambre avec une spatule plate et tirer doucement la chambre vers le haut, en veillant à ne pas déplacer les fiches d’agarose. Si elles ne se déplacent pas, doucement repositionnez-les afin qu’ils ne touchent pas un de l’autre.
2. Placez la lame dans un four à 37 ° C pendant environ 4 h, rotation 90° toutes les heures.
   Remarque : La rotation de la lame est importante pour assurer la distribution de chaleur uniforme dans l’ensemble de l’échantillon.
3. Une fois sec, retirez la lame du four (Figure 1E).
4. Appliquer la solution de matrice à l’aide du pulvérisateur (Figure 1F), avec les paramètres suivants : température = 30 ° C, débit = 0,2 mL/min, nombre de passes = 8, direction = CC et la distance de buse = 40 mm.
   Remarque : Au lieu d’un pulvérisateur de matrice, un aérographe artistique peut être utilisé pour appliquer la matrice liquide. La même solution de matrice peut être utilisée pour vaporiser, mais il faut environ deux fois plus de solution. Avec le toboggan serré de sorte qu’il est suspendu verticalement, pulvériser la diapositive sous un angle de 90° d’environ un pied de distance (adapté de Hoffmann¹⁵) jusqu'à ce que la matrice de calque est visible.
5. Ajouter 1 µL de degré (phosphore rouge pour cibles < 500 Da, un mélange de peptides (voir Table des matières) pour les cibles < 5 000 Da) à la tache claire sur la diapositive. Phosphore rouge ne nécessite aucun mélange avec la matrice, mais le mélange de peptide requiert mélange 1:1 avec la matrice à l’aide d’ionisation. Attendez calibrant à sécher.
6. Dessiner un X à l’aide d’un marqueur permanent dans chaque coin de la diapositive et de prendre une image optique à l’aide d’un appareil photo ou un scanner à 1200 dpi.

5. Acquisition de données de spectrométrie de masse imagerie

1. Ouvrez une nouvelle séquence sur le logiciel d’analyse de données IMS (voir Table des matières). Définissez la largeur de trame à résolution spatiale désirée, au moins 50 µm.
2. Télécharger l’image optique du glissement vers le logiciel d’analyse et trois set enseignent en utilisant les intersections dans le x dans chaque coin.
3. Désigner des zones d’intérêt pour l’imagerie dans le logiciel d’acquisition et leur nom en conséquence.
4. Calibrer l’instrument en utilisant le logiciel d’acquisition de données (voir la Table des matières) au sein de l’erreur de 5 ppm.
5. Enregistrez la méthode optimisée et commencer la course. Cette expérience optimisé les paramètres suivants : polarité = positif, détecteur = Réflectron, taille Laser = 2, puissance Laser = 50 %, réflecteur mode détecteur gain = x 3.

6. traitement des données IMS

1. Importer un fichier .mis dans un logiciel de statistique (voir Table des matières) pour l’analyse de l’importance.

Résultats

Une diapositive ITO parfaitement sec se traduira par un échantillon desséché plat avec peu ou pas de rides sur la surface du gel d’agarose et morceaux d’agarose qui maintiennent la séparation spatiale sur la lame (Figure 3). Figure 3 a montre un séchage optimal, tandis que la Figure 3 b montre les rides qui sont à proscrire. Cette optimisation nécessite attention comme heures exactes peuvent varier l...

Discussion

Il y a un nombre croissant d’une preuve qui implique le rôle de la noradrénaline en HGSOC^12,17,18, et cette technique a fourni de l’information plus mécaniste. Au moins huit conditions biologiques présentes sur la même lame, la méthode peut expliquer les contrôles biologiques telles que gène et spécificité cellulaire ainsi que des contrôles de médias dans un seul IMS run. Alors que la méthode a été optimisée pour évaluer échangé...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
15 mL Falcon tubes	Denville	C1017-O	Pour collecter des cellules
Chambre à 8 puits (chambre Millipore EZ-slide)	Millipore	PEZGS0816	Réutilisé à partir de Millipore Millicell EZ-slide chamber
slide Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998-4L	Solvant pour matrice pulvérisée
Alpha Minimum Essential Medium (&alpha ; MEM)	Fisher	10-022-CV	Milieux de culture cellulaire
Vitesse Autoflex MALDI-TOF LRF	Bruker		Pour l’analyse des données IMS
Centrifugeuse	Eppendorf	5810 R	Pour collecter des cellules et éliminer le surnageant
CHCA Matrix	Bruker Daltonic	8201344	Matrix pulvérisé sur lame séchée
DHB Matrix	Bruker Daltonic	8201346	Matrix pulvérisé sur lame séchée
Scalpels jetables	Fisher	22-079-707	Pour l’ablation des ovaires
Ciseaux de dissection	Fisher	13-804-6	Pour l’ablation des ovaires
DMEM Media	Gibco	11995-065	Média mélangé à l’agarose
croissance épidermique	Peprotech Inc.	100-15	Complément de milieux de culture cellulaire
Tubes Eppendorf	Genesee Scientific	22-282	Pour aliquotes d’agarose
Estradiol-17&beta ;	Simga-Aldrich	E2758	Complément de milieux de culture cellulaire
Sérum de veau fœtal	Denville	fb5001	Supplément de milieux de culture cellulaire
FlexControl 3.4	Bruker Daltonic		Logiciel d’acquisition de données IMS
FlexImaging 4.1	Bruker Daltonic		Logiciel d’analyse de données IMS
Forceps (fine)	Fsiher	22-327379	Pour l’élimination de la ovaires
Gentamycin	Cellgro	30-005-CR	Complément de milieux de culture cellulaire
Insuline, Transferrin, Selenium (ITS)	Sigma-Aldrich	11074547001	Supplément de milieux de culture cellulaire
Lame enduite d’ITO	Bruker	8237001	Plateforme pour l’incubation en co-culture
Leibovitz’s L-15 Medium	Gibco	11415064	Milieu utilisé pendant la production tissulaire dissection
L-glutamine	Gibco	25030-081	Complément de milieux de culture cellulaire
Agarose à bas point de fusion	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Mélangé avec des milieux pour le placage
Bassin de milieux	Corning	4870	Utilisé pour découper des séparateurs en plastique pour chambres divisées
Pénicilline-streptomycine	Gibco	15140-122	Supplément
de milieux de culture cellulaireÉtalon d’étalonnage peptidique	Bruker Daltonic	8206195	Calibrant pour la gamme de masse moyenne
Phophorus rouge	Sigma-Aldrich	343-242-5G	Calibrant pour la plage de faible masse
SCiLS Lab 2015	Bruker Daltonic		Analyse statistique des données IMS
Pince chirurgicale (émoussée)	Fisher	08-875-8B	Pour l’ablation des ovaires
TFA	Fisher Technologies	A116-50	Ajouté à la solution matricielle
TM Pulvérisateur	HTX Technologies		Pour l’application de la matrice