Arn artificiel Polymerase II Elongation Complexes pour disséquer les événements de traitement de l'ARN cotranscriptionnel

Résumé

Ici, nous décrivons l'assemblage des complexes d'allongement de polymérase II d'ARN II (Pol II) exigeant seulement l'ADN synthétique court et les oligonucléotides synthétiques et pol II purifié. Ces complexes sont utiles pour étudier les mécanismes sous-jacents au traitement co-transcriptionnel des transcriptions associées au complexe d'allongement de Pol II.

Résumé

La synthèse eucaryote d'ARNm est un processus biochimique complexe exigeant la transcription d'un modèle d'ADN dans un ARN précurseur par la polymérase D'ARN II d'enzyme multi-subunit et le plafonnement et l'épissage co-transcriptionnels de l'ARN précurseur pour former l'ARNm mûr. Pendant la synthèse de l'ARNm, le complexe d'allongement de la polymérase DE l'ARN II est une cible de régulation par une vaste collection de facteurs de transcription qui contrôlent son activité catalytique, ainsi que les enzymes de plafonnement, d'épissage et de traitement de 3' qui créent l'ARNm mature. En raison de la complexité inhérente de la synthèse de l'ARNm, des systèmes expérimentaux plus simples permettant l'isolement et l'étude de ses différentes étapes de cotranscription ont une grande utilité.

Dans cet article, nous décrivons un tel système expérimental simple approprié pour étudier le plafonnement co-transcriptionnel d'ARN. Ce système repose sur des complexes d'allongement de la polymérase II à ARN défini assemblés à partir de polymérase purifiée et de bulles de transcription artificielles. Lorsqu'ils sont immobilisés par l'ADN biotinylated, ces complexes d'allongement de polymérase II d'ARN fournissent un outil facilement manipulable pour disséquer le plafonnement et les mécanismes co-transcriptionnels d'ARN par lesquels le complexe d'élongation recrute et régule l'enzyme de plafonnement pendant co-transcriptionnel RNA plafonnement. Nous prévoyons que ce système pourrait être adapté pour étudier le recrutement et/ou l'assemblage de protéines ou de complexes protéiques avec des rôles à d'autres étapes de maturation de l'ARNm couplés au complexe d'allongement de la polymérase DE l'ARN II.

Introduction

La synthèse de l'ARN de messager eucaryotique (ARNm) est un processus biochimique élaboré qui implique la synthèse d'un ARN précurseur non traité par la polymérase II d'ARN et le traitement de l'ARN précurseur pour produire l'ARNm mûr. Les étapes de traitement de l'ARN du plafonnement, de l'épissage et de la polyadenylation sont effectuées en grande partie de façon cotranscription. Le complexe d'allongement Pol II sert d'échafaudage qui recrute et orchestre les activités de nombreuses enzymes de traitement de l'ARN. Par conséquent, notre compréhension ultime de la façon dont les ARNm eucaryotes matures sont générées dépendra fortement du développement de systèmes expé....

Protocole

1. Assemblage de complexes d'allongement artificiel et de marche Pol II

1. Immobiliser 1 nmol d'oligo d'ADN non-modèle contenant une molécule de biotine de 3' sur des perles magnétiques.
   REMARQUE : Les étapes suivantes peuvent être effectuées à l'avance pour préparer de futures expériences. Toutes les séquences d'oligo utilisées dans ce protocole sont fournies dans le tableau 1. Les oligos d'ARN sont synthétisés avec des modifications de 5'-triphosphate.
   1. Ajouter 200 l de perles magnétiques (10 mg/ml) dans un tube de 1,5 ml de liaison à faible teneur en protéines, puis placer sur un support magnétique pendant 2 min.

Résultats

Les figures 2 et 3 montrent des réactions représentatives des résultats utilisées pour générer des complexes d'allongement artificielcontenant contenant des transcriptions de différentes longueurs en étendant ou Pol II de différentes sources. La figure 4 montre comment ces complexes d'allongement peuvent être utilisés pour déterminer le plafonnement de l'ARN dépendant de la phosphorylation CTLation cotranscription.

Discussion

Les études qui cherchent à disséquer les événements couplés au complexe d'allongement de Pol II tels que le traitement de l'ARN et la régulation de l'allongement de transcription lui-même peuvent être grandement facilitées par l'utilisation d'un système enzymatique fortement purifié. La mise en place de tels systèmes enzymatiques peut être difficile. La transcription dépendante du promoteur par Pol II nécessite au moins cinq facteurs de transcription généraux. La préparation et le stockage de ces facteurs peuvent prendre.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
[&alpha ;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi	Perkin Elmer	NEG007H001MC	Pour le radiomarquage de l’ARN
2x Colorant de chargement d’ARN	New England Biolabs	B0363S	Fortement recommandé. Pour la préparation de l’ARN pendant le chargement du gel
40 % Bis :Solution d’acrylamide	Biorad	1610144
Albumine sérique bovine (20 mg/mL)	New England Biolabs	B9000S
Cdk7/Cyclin H/MAT1 (complexe CAK) Protéine, active, 10 & micro ; g	Millipore Sigma	14-476	Utilisé pour phosphoryler Pol II CTD
DNA oligonucléotides	IDT		Voir le tableau 8 pour les spécifications de pureté
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Life Technologies Invitrogen	65001	Nous avons également utilisé Dynabeads M-280 streptavidine sans problème, mais préférons les billes MyOne Streptavidin car elles sédimentent plus lentement
GlycoBlue Coprecipitant (15&thinsp ; mg/mL)	Life Technologies Invitrogen	AM9516	Fortement recommandé. Colorants pastilles d’acide nucléique bleu rendant les réactions beaucoup plus faciles à manipuler
Système d’électrophorèse verticale à double refroidissement standard Hoefer SE600 avec entretoises de 1 mm et peigne à 15 puits	Hoefer	SE600-15-1.5
MaXtract tubes haute densité (1,5 mL)	Qiagen	129046	Fortement recommandé. Contient un gel haute densité qui forme une barrière stable entre les phases aqueuse et organique ; améliore les rendements en ARN lors des extractions Solution de
protéinase K (20&thinsp ; mg/mL)	Life Technologies Invitrogen	25530049
ARN oligonucléotides	Trilink		Voir le tableau 8 pour plus de détails
Pyrophosphatase inorganique de levure (100 unités/mL)	New England Biolabs	NEBM2403S	Requis uniquement pendant les réactions de coiffage