Article de méthode

Utilisation d'un accélérateur linéaire pour la réalisation d'expériences de radiobiologie in vitro

DOI :

10.3791/59514

⸱

26 mai 2019

 ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, Cleveland Clinic, 2Department of Radiation Oncology, Cleveland Clinic

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des accélérateurs linéaires cliniques peuvent être utilisés pour déterminer les effets biologiques d'un large éventail de taux de dose sur les cellules cancéreuses. Nous discutons de la façon de mettre en place un accélérateur linéaire pour les essais cellulaires et les essais pour les cellules cancéreuses de la tige-comme cultivés comme tumorspheres dans la suspension et les lignées cellulaires cultivées comme cultures adhérentes.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La radiothérapie demeure l'une des pierres angulaires de la prise en charge du cancer. Pour la plupart des cancers, c'est la thérapie non chirurgicale la plus efficace aux tumeurs debulk. Ici, nous décrivons une méthode pour irradier des cellules cancéreuses avec un accélérateur linéaire. L'avancement de la technologie des accélérateurs linéaires a amélioré la précision et l'efficacité de la radiothérapie. Les effets biologiques d'un large éventail de doses de rayonnement et de taux de dose continuent d'être un domaine d'investigation intense. L'utilisation d'accélérateurs linéaires peut faciliter ces études en utilisant des doses et des taux de dose cliniquement pertinents.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La radiothérapie est un traitement efficace pour de nombreux types de cancer1,2,3,4. L'irradiation de taux de dose extra élevé est relativement nouvelle dans la radiothérapie et est rendue possible par les progrès technologiques récents dans les accélérateurs linéaires5. Les avantages cliniques du taux de dose extra élevé au-dessus de l'irradiation standard de taux de dose incluent le temps de traitement raccourci et l'expérience améliorée de patient. Les accélérateurs linéaires offrent également un cadre clinique pour les études de biologie de la radioradiation basées sur la culture cellulaire. Les implications biologiques et thérapeutiques des taux de dose de rayonnement et dedose ont été un foyer d'intérêt des oncologues et des biologistes de rayonnement pendant des décennies 6,7,8. Mais, la radiobiologie de l'irradiation de taux de dose extra élevé et de l'irradiation de flash - un taux extrêmement élevé de dose de rayonnement - n'a pas encore été soigneusement étudiée.

L'irradiation de rayon gamma est employée couramment dans la biologie basée de rayonnement basée sur la culture cellulaire9,10,11. Le rayonnement est obtenu par les rayons gamma émis par des sources d'isotopes radioactifs en décomposition, généralement du césium-137. L'utilisation de sources radioactives est très réglementée et souvent restreinte. Avec l'irradiation à base de source, il est difficile de tester un large éventail de taux de dose, limitant son utilité dans l'analyse des effets biologiques des taux de dose cliniqueréalisable s'ilest 12.

Il ya eu plusieurs études qui illustrent à la fois la dose et les effets du taux de dose12,13,14,15,16,17. Dans ces études, la gamma-irradiation générée à partir d'isotopes radioactifs ou les rayons X générés par des accélérateurs linéaires ont été utilisés. Une variété de lignées cellulaires représentant le cancer du poumon, le cancer du col de l'utérus, le glioblastome et le mélanome ont été utilisées. Les effets de rayonnement sur la survie cellulaire, l'arrêt de cycle cellulaire, l'apoptose et les dommages d'ADN ont été évalués en tant que readouts12,13,14,15,16,17 . Ici, nous décrivons une méthode pour définir les effets biologiques des taux de dose et de dose de rayonnement médicalement pertinents en fournissant le rayonnement basé sur la rayon X utilisant un accélérateur linéaire. Ces études devraient être réalisées en étroite collaboration entre le biologiste, le radio-oncologue et le physicien médical.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation cellulaire pour la culture cellulaire de suspension

  1. Cellules souches de gliome de culture dans les médias de culture de cellules souches à environ 5 x 10plaques de cellules/10 cm dans un incubateur de culture cellulaire avec 5% co2, 95% d'humidité relative à 37 oC.
    REMARQUE : La condition de culture cellulaire est la même tout au long de toutes les procédures. Les médias utilisés dans le protocole sont des médias complets.
  2. Deux jours avant l'irradiation prévue, recueillir des cellules de type souche de gliome de la plaque de culture avec une pipette stérile de 5 ml dans un tube de centrifugeuse de 15 ml dans une hotte de culture.
  3. Centrifuger les cellules collectées à 200 x g pendant 3 min dans une centrifugeuse du comptoir.
  4. Jeter le supernatant et digérer la pastille cellulaire (environ 1 x 107 cellules) avec 1 ml de trypsine-EDTA à température ambiante pendant 5 minutes pour faire une suspension de cellule unique dans trypsin-EDTA. Secouez doucement le fond du tube de centrifugeuse toutes les 2 minutes pendant la digestion pour vous assurer que les cellules sont bien digérées.
  5. Ajouter 3 ml de média de culture de cellules souches (voir le Tableau des matériaux) pour éteindre la trypsine. Centrifuger les cellules collectées à 200 x g pendant 3 min dans une centrifugeuse de contre-dessus. Jetez le supernatant et enregistrez la pastille cellulaire.
  6. Resuspendre les cellules avec 5 ml de culture cellulaire et compter les cellules avec un hémocytomètre.
  7. Plaque 5 x 106 cellules dans deux plaques de 10 cm contenant 10 ml de support de culture cellulaire.
  8. Juste avant l'irradiation prévue, recueillir les cellules et jeter le supernatant après centrifugation tel que décrit à l'étape 1.3. Re-suspendre le granule cellulaire avec 5 ml de support de culture cellulaire. Transférer 1 ml de suspension cellulaire dans une plaque de 35 mm contenant 2 ml de support de culture cellulaire.
    REMARQUE : Le volume total des supports est de 3 ml dans la plaque de 35 mm pour faire le liquide 1 cm de hauteur dans la plaque.
  9. Transférer les cellules plaquées dans un contenant secondaire, comme une boîte en plastique ou en mousse, afin de réduire le risque de contamination et d'amener les cellules dans le récipient à l'installation d'irradiation sur le chariot utilitaire.
  10. Irradier les cellules telles que décrites à l'étape 4.

2. Préparation cellulaire pour la culture cellulaire attachée

  1. Un jour avant l'irradiation, dans le capot de culture cellulaire, retirez le support DMEM de la plaque de culture cellulaire de la lignée cellulaire attachée, comme les cellules HEK-293. Les supports peuvent être aspirés à l'aide d'une pipette Pasteur reliée à un vide.
  2. Laver les cellules avec 5 ml de PBS stérile au plat de culture pour rincer les supports résiduels.
  3. Pipette 1 ml de trypsine-EDTA dans le plat de culture et inclinez doucement l'assiette de culture pour s'assurer que le plat entier est couvert de trypsine-EDTA.
  4. Trypsiniser les cellules à température ambiante pendant 5 min. Quench la réaction trypsine-EDTA avec 3 ml de support DMEM et de recueillir les cellules avec une pipette de 5 ml dans 15 ml tube centrifugeur dans le capot de culture.
  5. Centrifuger les cellules collectées à 200 x g pendant 3 min dans une centrifugeuse de contre-dessus. Jetez le supernatant et enregistrez la pastille cellulaire.
  6. Resuspendre les cellules avec 5 ml de support DMEM et compter les cellules avec un hémocytomètre.
  7. Plaque 2 x 105 cellules dans une plaque de 35 mm en utilisant 3 ml de support de culture cellulaire jusqu'à une hauteur de 1 cm de support.
  8. Après 24 h de culture cellulaire dans l'incubateur à 37 oC, transférer les cellules plaquées dans un contenant secondaire (c.-à-d. une boîte en mousse isolée) à l'installation d'irradiation d'un chariot utilitaire.
  9. Irradier les cellules telles que décrites à l'étape 4.

3. Préparation cellulaire pour l'immunostaining suite à l'irradiation

  1. Décongeler la matrice commerciale de protéines extracellulaires sur la glace à 4 oC pendant la nuit. Pré-réfrigérer 200 pointes de pipette ll et tubes de centrifugeuse de 1,5 ml à 4 oC pendant la nuit.
  2. Matrice de protéines extracellulaires Aliquot avec des pointes de pipette préréfrigérées et des tubes centrifugeuses de 1,5 ml à 200 l l par tube.
  3. Diluer 200 l de matrice extracellulaire de protéine dans 20 mL pré-réfrigéré de médias de culture cellulaire pour faire 1% de protéine extracellulaire de matrice de médias.
  4. Placer un bordereau stérilisé (22 mm x 22 mm) dans une plaque de 35 mm. Placez 400 l de 1 % de protéique extracellulaire sur le bordereau.
  5. Placez la plaque de 35 mm dans l'incubateur de culture cellulaire à 37 oC pendant 1 h pour permettre à la matrice extracellulaire de protéines de polymériser sur le bordereau.
  6. Lorsque vous utilisez la culture des cellules de suspension, faire une suspension de cellule unique comme décrit dans les étapes 1.1 à 1.5.
  7. Plaque 5 x 104 cellules sur un bordereau enduit de matrice de protéines extracellulaires placé dans une plaque de 35 mm. Retournez les cellules plaquées à l'incubateur de culture cellulaire pendant la nuit pour s'assurer que les cellules sont soutenues par la matrice protéique. Le volume total des supports dans l'assiette doit être de 3 ml pour que la hauteur des médias atteigne 1 cm dans le plat de culture.
  8. Observez les cellules sous un microscope de champ lumineux avec la lentille objective de grossissement de 10x. Les cellules doivent s'étaler sur le bordereau au lieu de flotter. Transférer le plat de culture avec des cellules plaquées dans un récipient secondaire comme une boîte en mousse à l'installation d'irradiation sur un chariot utilitaire et irradier les cellules comme décrit à l'étape 4.
  9. Lors de l'utilisation des cultures cellulaires ci-jointes (par exemple, les cellules HEK-293), digérez les cellules telles que décrites dans les étapes 2.1 à 2.6. Placez 5 x 104 cellules sur un couvercle stérile dans une plaque de 35 mm un jour avant l'irradiation pour s'assurer que les cellules sont entièrement attachées à la surface de la couverture en les observant au microscope comme à l'étape 3.9. Utilisez 3 ml de support DMEM pour faire le liquide 1 cm de hauteur dans la plaque.
  10. Après avoir cultivé des cellules sur des plaques de couverture pendant la nuit ou jusqu'à un jour, transférez le plat de culture avec des cellules plaquées dans un récipient secondaire à l'installation d'irradiation. Un chariot utilitaire peut être utilisé pour réduire le risque de déversement. Irradier les cellules telles que décrites à l'étape 4.

4. Irradiation avec un accélérateur linéaire (LINAC)

  1. À l'aide du logiciel de console du LINAC, définir le portique et le collimateur de l'accélérateur à 0 degrés, ouvrir les mâchoires X et Y à une taille symétrique de 20 x 20 cm2 de champ et rétracter les collimateurs multi-feuilles (MLC) s'ils sont présents.
    REMARQUE : Les LINAC peuvent avoir un mode sans filtre d'aplatissement (FFF), ce qui permet des taux de dose très élevés. Comme son nom l'indique, ce rayonnement n'est pas uniforme (plat), et le taux de dose élevé n'est atteint qu'au centre du faisceau. Dans ce cas, un champ de 7 x 7 cm2 est utilisé.
  2. Placer au moins 5 cm de matériau équivalent à l'eau sur le canapé de traitement. Placez le plat cellulaire à irradié à 400 MU/min (taux de dose standard) sur le matériau équivalent à l'eau et centrez-le au réticule LINAC.
  3. Placez les cellules à irradier à une profondeur de dose maximale dans un faisceau de rayons X de 6 MV, d'environ 1,5 cm. Placez 1 cm de matériau équivalent à l'eau supplémentaire sur le dessus du plat. Combiné avec le 1 cm de milieu dans lequel les cellules sont suspendues, cela place les cellules à une profondeur moyenne de 1,5 cm.
  4. Affix le pointeur avant à la tête du LINAC. Étendre le pointeur avant jusqu'à ce qu'il entre en contact avec la surface du matériau d'accumulation et noter la distance. Ajustez la hauteur de la table jusqu'à ce que la distance entre la source et la surface d'accumulation soit de 100 cm.
    REMARQUE : La distance peut être confirmée avec l'indicateur de distance optique. Alternativement, l'indicateur de distance optique peut être utilisé au lieu du pointeur avant pour définir la source à la surface d'accumulation à 100 cm.
  5. Calculez le nombre approprié d'unités de surveillance (MU) pour fournir la dose désirée de rayonnement aux cellules et programmez l'accélérateur pour qu'il soit livré à 400 MU/min.
    REMARQUE : Pour la configuration de la distance de surface de la source (SSD) sur un LINAC calibré pour délivrer 1 cGy/MU à la profondeur de la dose maximale, le nombre requis d'unités de moniteur est calculé à l'aide de MU - Dose (cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20x20), où of signifie facteur de sortie. Ce calcul devra être modifié pour les LINAC à l'aide d'autres configurations d'étalonnage.
  6. Quittez le coffre-fort du traitement et vérifiez que toutes les autres personnes sont sorties. Vrify qu'il n'y a pas d'autres cellules dans la salle, ou ils recevront de faibles doses de rayonnement. Fermez la porte de la chambre forte.
  7. Confirmer la taille du champ, MU et MU/min à la console, puis activer le faisceau.
  8. Répétez les étapes 4.3-4.8 pour que les cellules soient irradiées à des taux de dose plus ou moins élevés.
    1. Pour obtenir des taux de dose plus élevés (p. ex., 2100 MU/min ou plus) avec l'accélérateur, diminuer le SSD afin d'augmenter le taux de dose effectif pour les cellules selon la loi carrée inverse : DoseRateEffective - Doserate ( 100 cm / SSD-New)2.
    2. Pour les faibles taux de dose (p. ex., 20 MU/min), augmentez la source à la distance de surface (SSD-Nouveau) pour diminuer le taux de dose. Par exemple, le plat de culture cellulaire peut être placé sur le plancher de la salle de traitement.
    3. Recalculer le réglage de l'unité de moniteur sur l'accélérateur si cette configuration est nécessaire, en utilisant MU -Dose(cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20x20)/ (100 cm / SSD-New)2. Pour plus d'informations sur les calculs de MU, se référer à la référence par McDermott et Orton18.
  9. Déterminer le taux de dose en Gy/minute par DoseRate (Gy/Min) - Dose(Gy) (MU/min)/MU. par exemple, 4 Gy livré à 400 MU/min nécessite 380 MU, donc 4'400/380 '4.2 Gy/min. Voir tableau 1.

figure-protocol-1
Figure 1 : Mise en place du plat de culture cellulaire sur accélérateur linéaire. (A) Un accélérateur linéaire clinique est montré. (B) 5 cm de matériau équivalent à l'eau est placé sur le canapé de traitement. (C) Un plat de culture cellulaire est placé sur la surface du matériau. (D) Le plat est centré à l'aide du réticule de l'accélérateur dans le champ de traitement montré par le champ de lumière carrée. (E) 1 cm de matériau équivalent à l'eau est placé sur le plat de culture cellulaire. La source à la distance de surface (SSD) est vérifiée à l'aide d'un indicateur de distance optique (F, G) ou d'un pointeur avant (H, I). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

5. Essais biologiques après irradiation

  1. Après irradiation, retournez les cellules à l'incubateur de culture cellulaire de la même manière que décrite ci-dessus (étape 1.9, 2.8 et 3.10).
  2. Au besoin, adaptez une variété d'analyses biologiques pour qu'elles s'inscrivent dans le projet de recherche.
    REMARQUE : Ici, nous montrons une analyse représentative de cycle cellulaire16 comme exemple d'un analyse biologique suivant l'irradiation.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour étudier l'effet du cycle cellulaire du taux de dose standard et de l'irradiation du taux de dose extra élevé par un accélérateur linéaire, trois échantillons de cellules souches de gliome ont été préparés à l'aide de ce protocole et ont recueilli 24 h après irradiation17: un échantillon témoin qui n'a pas été irradié (Figure 2A), un échantillon irradié avec 400 MU/min (unité de surveillance, taux de dose standard de 4,2 Gy/min,

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La radiothérapie fait partie intégrante de la prise en charge du cancer. Les efforts en cours visent à améliorer l'efficacité et l'efficacité de la radiothérapie. Les progrès de la technologie des accélérateurs linéaires ont permis de traiter les patients avec une précision et une sécurité sans précédent. Puisque la plupart des patients sont traités avec des rayons X à haute énergie des accélérateurs linéaires, les études examinant les effets biologiques d'un large éventail de taux de dose exécutés sur des accélérateurs ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Cleveland Clinic Department of Radiation Oncology pour l'utilisation des accélérateurs linéaires. Nous remercions le Dr Jeremy Rich pour son don généreux de cellules souches de gliomes. Cette recherche a été soutenue par la Cleveland Clinic.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
material
387du Dr Jeremy Rich
293 cellulesATCCCRL-1573
Milieu de culture de cellules souches neuronalesThermo Fisher Scientific21103049NeurobasalTM
DMEMThermo Fisher Scientific10569044
Sérum fœtal bovinThermo Fisher Scientific16000044
Pénicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific15140-122
Protéine EGF humaine recombinanteR& D Systems236-EG-01M
FGF humain recombinantR& D Systems4114-TC-01M
B-27& ; commerce ; SupplémentThermo Fisher Scientific17504044
Pyruvate de sodiumThermo Fisher Scientific11360070
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030164
Tripsin-EDTAThermo Fisher25200056
matrice de protéines extracellulairesCorning354277MatrigelTM
ÉthanolFisher chemicalA4094
Equipment
Boîte de culture cellulaire de 10 cmDenvilleT1110
Boîte de culture cellulaire de 3,5 cmUSA Scientific Inc.CC7682-3340
22x22mm couvercle en verre à glissementde microscopie électronique sciences72210-10
Tube à centrifuger de 15 mlThomas Scientific1159M36
Tube à centrifuger de 50 mlThomas Scientific1158R10
Pipette de 5 mlFisher Scientific14-955-233
Aide à la pipetteFisher Scientific13-681-06
Mélangeur vortexFisher Scientific02-215-414
CentrifugeuseEppendorf5810R
Accélérateur linéaireVariann/a
matériau équivalent à l’eauSun Nuclear corporation557Eau solideTM
Préparation des réactifs
Milieu DMEM10 % sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 unités/mL de pénicilline G, 100 et micro ; g/mL de streptomycine dans 500 ml
10 ml de supplément de B27, 20 & micro ; g hFGF, 20 et micro ; g hEGF, 2 mM L-glutamine, 100 unités/mL pénicilline G, 100 & micro ; g/mL de streptomycine dans 500 ml de milieu
Cellule souche de type gliome de milieu de culture de cellules souches DMEM neurobasal

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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