Visualisation de la protéine Kinase Une activité chez des souris à behaving à l'aide de la microscopie d'imagerie à deux photons in vivo fluorescence à vie

La neuromodulation, également connue sous le nom de transmission synaptique lente, impose un contrôle fort sur la fonction cérébrale pendant différents états comportementaux, tels que le stress, l'excitation, l'attention, et la locomotion^{1,2,3, 4}. Malgré son importance, l'étude du moment et de l'endroit où se déroulent les événements neuromodulatoires en est encore à ses balbutiements. Les neuromodulateurs, y compris l'acétylcholine, la dopamine, la noradrénaline, la sérotonine et de nombreux neuropeptides, activent les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR), qui déclenchent à leur tour des voies intracellulaires de deuxième messager avec une large fenêtre d'échelles de temps allant de secondes à quelques heures. Tandis que chaque neuromodulateur déclenche un ensemble distinct d'événements de signalisation, la voie de kinase A de cAMP/protéine est une voie en aval commune pour beaucoup de neuromodulators^1,5. La voie cAMP/PKA régule l'excitabilité neuronale, la transmission synaptique et la plasticité^6,7,8,9, et donc, accorde la dynamique neuronale du réseau. Étant donné que différents neurones ou types neuronaux expriment différents types ou niveaux de récepteurs neuromodulateurs¹⁰, les effets intracellulaires du même neuromodulateur extracellulaire peuvent être hétérogènes à travers différents neurones, et doivent donc être avec résolution cellulaire. À ce jour, il reste difficile de surveiller les événements neuromodulatoires dans les neurones individuels in vivo pendant le comportement.

Pour étudier la dynamique spatiotemporale de la neuromodulation, une modalité appropriée d'enregistrement est exigée. La microdialyse et la voltamétrie cyclique à balayage rapide sont fréquemment utilisées pour étudier la libération des neuromodulateurs, mais ils n'ont pas la résolution spatiale pour surveiller les événements cellulaires^11,12. Analogue à la dynamique du calcium utilisé comme un proxy pour l'activité électrique neuronale dans l'imagerie de la population¹³, pDJ peut être utilisé pour lire les événements neuromodulatoires à travers une population neuronale à la résolution cellulaire. Le protocole actuel décrit l'utilisation d'un journaliste d'activité A-kinase amélioré (AKAR) pour surveiller les activités De PKA in vivo pendant le comportement animal. La méthode décrite ici permet l'imagerie simultanée des populations neuronales à la résolution subcellulaire avec une résolution temporelle qui suit les événements neuromodulatoires physiologiques.

Les AKAR sont composés d'un donneur et d'un accepteur de protéines fluorescentes reliées par un peptide de substrat de phosphorylation PKA et d'un domaine associé à la tête de fourchette (FHA) qui se lie à la sérine phosphorylée ou à la thréonine du substrat^14,15. Lors de l'activation de la voie PKA, le peptide de substrat d'AKAR est phosphorylé. En conséquence, le domaine FHA se lie au peptide phosphorylé de substrat, amenant de ce fait les deux fluorophores à proximité, dénommé l'état fermé d'AKAR. L'état fermé d'un AKAR phosphorylé entraîne une augmentation du transfert d'énergie par résonance (FRET) entre le donneur et les fluorophores accepteurs. Étant donné que la proportion d'AKAR phosphorylés est liée au niveau d'activité PKA¹⁶, la quantité de FRET dans un échantillon biologique peut être utilisée pour quantifier le niveau d'activité PKA^{16,17,18, 19,20}.

Les premières versions des RLA ont été principalement conçues pour l'imagerie ratiométrique à deux couleurs¹⁴. Lors de l'imagerie plus profondément dans le tissu cérébral, la méthode ratiométrique souffre de distorsion du signal due à la diffusion de la lumière dépendante de la longueur d'onde^17,18,21. Comme nous l'avons vu ci-dessous, la microscopie d'imagerie à vie par fluorescence (FLIM) élimine ce problème parce que la FLIM ne mesure que les photons émis par le fluorophore du donneur^18,21. En conséquence, la quantification FLIM de FRET n'est pas affectée par la profondeur tissulaire¹⁷. En outre, une variante « foncée » (c.-à-d. faible rendement quantique [QY]) du fluorophore accepteur peut être utilisée. Cela libère un canal de couleur pour faciliter la mesure multiplexée des propriétés neuronales orthogonales par l'imagerie simultanée d'un deuxième capteur ou d'un marqueur morphologique^17,19,20.

L'imagerie FLIM quantifie le temps qu'un fluorophore passe dans l'état excité, c'est-à-dire la durée de vie de la fluorescence¹⁸. Le retour d'un fluorophore à l'état de sol, donc la fin de l'état excité, se concomite souvent avec l'émission d'un photon. Bien que l'émission d'un photon pour une molécule excitée individuelle soit stochastique, dans une population la durée de vie moyenne de fluorescence est une caractéristique de ce fluorophore particulier. Quand une population pure de fluorophores sont excitées simultanément, la fluorescence résultante suivra une seule décomposition exponentielle. La constante temporelle de cette carie exponentielle correspond à la durée de vie moyenne de la fluorescence, qui varie généralement de une à quatre nanosecondes pour les protéines fluorescentes. Le retour d'un fluorophore donneur excité à l'état du sol peut également se produire par FRET. En présence de FRET, la durée de vie de fluorescence du fluorophore donneur est réduite. Les AKAR non phosphorylés présentent une durée de vie relativement plus longue de fluorescence des donneurs. Lors de la phosphorylation par PKA, le capteur montre une durée de vie plus courte parce que le donneur et les fluorophores accepteurs sont amenés près de l'autre et FRET est augmenté. La quantification de la durée de vie de la fluorescence dans une population d'AKAR représente donc le niveau d'activité de la PKA.

Les premières versions des RCR n'ont pas été utilisées avec succès pour l'imagerie in vivo à résolution monocellulaire. Cela est principalement dû à l'amplitude du signal faible des capteurs AKAR aux activations physiologiques¹⁷. Récemment, en comparant systématiquement les capteurs AKAR disponibles pour la microscopie d'imagerie à vie à deux photons (2pFLIM), un capteur appelé FLIM-AKAR a été trouvé pour surpasser les capteurs alternatifs. En outre, une série de variantes FLIM-AKAR appelées AKAR ciblées (tAKARs) ont été développées pour visualiser l'activité de La PKA à des endroits sous-cellulaires spécifiques : microtubules (tAKARMD), cytosol (tAKARMD), actine (tAKARMD), actine filamentuse (tAKARMD), membrane (tAKARMD), et la densité postsynaptique (tAKAR- ). Parmi les tAKAR, le tAKARMD a multiplié par 2,7 l'amplitude du signal obtenue par la noradrénaline. Ceci est compatible avec la connaissance que la majorité de PKA dans les neurones sont ancrés aux microtubules à l'état de repos^22,23. tAKAR a été le meilleur performer parmi les AKAR existants pour 2pFLIM. En outre, tAKARMD a détecté l'activité physiologiquement pertinente de PKA obtenue par les neuromodulators multiples, et l'expression de tAKAR mD n'a pas modifié des fonctions neuronales¹⁷.

Récemment, tAKAR a été utilisé avec succès pour visualiser les activités PKA chez les souris de comportement fixes à la tête¹⁷. Il a été démontré que la locomotion forcée déclenchait l'activité de la PKA dans le soma des neurones de couche superficielle (couche 1 à 3, jusqu'à une profondeur de 300 m de pia) dans le moteur, le baril et les cortices visuels. L'activité de PKA locomotion-déclenchée a été en partie dépendante de la signalisation par l'intermédiaire des récepteurs adrénergiques et des récepteurs de dopamine d'A1, mais n'a pas été affectée par un antagoniste de récepteur de dopamine de D2. Ce travail illustre la capacité des tAKARs à suivre les événements de neuromodulation in vivo à l'aide de 2pFLIM.

Dans le protocole actuel, la méthode entière pour l'imagerie d'activité de PKA dans les souris éveillées tête-fixes pendant un paradigme forcé de locomotion est décrite en six étapes. Tout d'abord, l'ajout de capacités 2pFLIM à un microscope conventionnel à deux photons (figure 1). Deuxièmement, la construction d'un tapis roulant motorisé (figure 2). Troisièmement, l'expression du capteur tAKARMD dans le cortex de la souris par électroporation in utero (IUE) des plasmides d'ADN, ou injection stéréotaxique du virus adéno-associé (AAV). D'excellents protocoles pour les chirurgies pour IUE^24,25 et l'injection stéréotaxique de particules virales²⁶ ont été précédemment publiés. Les paramètres clés que nous avons utilisés sont décrits ci-dessous. Forth, l'installation d'une fenêtre crânienne. D'excellents protocoles ont déjà été publiés pour la chirurgie de fenêtre crânienne^27,28. Plusieurs étapes qui ont été modifiées à partir des protocoles standard sont décrites. Cinquième, effectuer in vivo 2pFLIM. Sixièmement, les analyses des images 2pFLIM (figure3 et figure 4). Cette approche devrait être facilement applicable à beaucoup d'autres paradigmes comportementaux et zones cérébrales fixés à la tête.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Oregon Health and Science University.

1. 2pFLIM Microscope Setup

1. Installer un module de comptage de la synchronisation des photons (PTCM, Table ofMaterials) et vous connecter à l'ordinateur (Figure 1) selon le manuel du fabricant.
   REMARQUE: Le PTCM est généralement une carte d'ordinateur qui reçoit une entrée "sync" pour le moment de l'impulsion laser et une entrée de photon du tube photomultiplicateur (PMT). Il reçoit également le chronomètre pour les pixels, les lignes et les cadres, à partir d'un logiciel de contrôle d'imagerie à deux photons. Le PTCM utilise les signaux de l'horloge pour séparer les photons individuels en différents pixels et cadres.
2. Ajoutez une photodiode avec une bande passante de 200 MHz pour mesurer le timing laser. Placez un bordereau de verre standard dans le chemin de lumière pour refléter une petite fraction de la lumière laser dans la photodiode placée perpendiculairement au chemin de lumière (Figure 1). Connectez la sortie photodiode à l'entrée "sync" du PTCM.
   REMARQUE: Beaucoup de lasers modernes également sortir le timing laser. Pour ces lasers, la photodiode n'est pas nécessaire, et on peut connecter directement la sortie de synchronisation laser à l'entrée de synchronisation du PTCM.
3. Échangez le PMT, dans le cas du tAKAR, le canal vert PMT, avec un faible bruit, rapide GaAsP PMT (Figure 1). Connectez la sortie PMT à l'entrée de signal du PTCM.
   1. Ajouter un séparateur de signaux optionnel (figure 1) si l'acquisition simultanée de l'intensité par le canal conventionnel d'imagerie à deux photons est souhaitée. Connectez la sortie PMT au séparateur de signaux et connectez la sortie de séparateur au PTCM et au module d'imagerie conventionnel à deux photons.
      REMARQUE: Les TPM GaAsP donnent des signaux monophotons plus rapides que les PmT bialkali conventionnels et permettent une détermination plus précise du moment du photon. Certains modèles de TPM GaAsP peuvent être refroidis à 10 à 35 oC en dessous de la température ambiante, ce qui permet de réduire la consommation de dénombrements sombres à un niveau inférieur à quelques centaines par seconde (généralement 200 comptes/s). Ce faible niveau de bruit est important pour la mesure précise de la durée de vie de la fluorescence, car le nombre de photons sonores ne peut pas être facilement distingué ou soustrait de la courbe de vie de fluorescence.
4. Ajoutez un filtre d'émission de fluorescence de passage de bande qui minimise la contamination spectrale, le cas échéant, du fluorophore d'accepteur. Par exemple, pour le tAKARMD, un filtre de barrière de 500 nm et 20 nm pour le canal vert est utilisé pour réduire la contamination de l'accepteur sREACh, qui est une protéine fluorescente jaune foncée (QY 0,07)^29,30. Connectez les signaux de synchronisation, tels que les horloges pour les pixels d'image individuels, les lignes et les cadres, le cas échéant pour le logiciel de contrôle et décrit sa dans le manuel d'utilisation du PTCM. Installez le logiciel de contrôle et d'acquisition de données approprié.
   REMARQUE: Certains fabricants de PTCM (Tableaudes Matériaux) fournissent leur logiciel pour l'imagerie 2pFLIM. Ici, un logiciel personnalisé appelé FLIMimage est utilisé, qui a été développé par le laboratoire Yasuda (Max Planck Floride, via la communication personnelle). Ce logiciel fonctionne comme une fonction utilisateur add-on à certains logiciels d'acquisition de deux photons (Tableau des matériaux). Il contrôle et communique avec le PTCM au moment approprié pendant l'imagerie à deux photons pour acquérir des images 2pFLIM.

2. Construction d'un tapis roulant motorisé

REMARQUE: La conception du tapis roulant motorisé sur mesure est illustrée dans la figure 2.

1. Couper un rouleau de mousse (200 mm) à 150 mm de longueur à l''égard d'une fine scie à métaux. Sinon, coller les deux moitiés d'une boule de mousse ensemble et placer le ruban adhésif sur la couture. Optionnellement, collez un tapis en caoutchouc avec le profil sur le rouleau pour augmenter la traction sur le rouleau.
2. Percer un trou de 1/4 pouce de diamètre à travers le centre du rouleau sur le côté plat du rouleau ou percer un trou de 1/4 pouce de diamètre à travers le milieu de chaque moitié de la balle si la boule de mousse est utilisée.
3. Installez un essieu en acier de 1/4 pouce de diamètre à travers le trou. Collez le rouleau/boule de mousse à l'essieu à l'aide de colle compatible avec la mousse. Optionnellement, modifiez deux accouplements flexibles d'arbre (1/4 pouce de diamètre intérieur) pour renforcer l'accouplement de l'essieu au rouleau/boule de mousse.
   REMARQUE: Veuillez noter que de nombreuses colles communes peuvent dissoudre la mousse.
   1. Pour chaque couplage d'arbre, placez le couplage de l'arbre sur son côté plat et au centre de la plaque métallique rectangle (0,7 mm x 15 mm x 76 mm). Soudladez la plaque au couplage de l'arbre. Percer un trou de 1/4 pouce au centre de la plaque pour permettre l'installation de l'accouplement de l'arbre modifié sur l'essieu et deux trous de vis dans la plaque métallique latérale du centre.
   2. Installez l'accouplement de l'arbre sur l'essieu contre le rouleau/balle en mousse. Si vous utilisez ce dernier, pliez légèrement la plaque pour s'adapter à la courbure de la balle. Placez les vis dans les trous latéraux pour fixer le rouleau/balle sur l'essieu.
4. Percer et appuyez sur un fil 3/8-32 au centre d'une plaque de cage et installez l'encodeur rotatif. Percer un trou de vis dans la base du support moteur à angle droit pour permettre l'attachement du moteur sur le support du poteau. Fixez à la fois l'encodeur rotatif et le moteur à l'extrémité de l'essieu à l'aide d'un couplage flexible de l'arbre.
5. Installer le tapis roulant assemblé sur une planche à pain en aluminium à l'aide de poteaux pour le moteur et l'encodeur rotatif (figure 2). Connectez les entrées du moteur au contrôleur de vitesse et la sortie de l'encodeur rotatif à une entrée analogique du tableau d'acquisition de données informatiques (DAQ).
   REMARQUE: La vitesse angulaire de rotation est codée par l'encodeur rotatif sous forme de tension et est numérisée à l'aide d'un logiciel personnalisé appelé AnimalTracker écrit en MATLAB.
6. Installez le support compatible plaque de tête sur un support à angle droit. Installez un poteau solide sur la plaque de pain devant le tapis roulant et installez le support de plaque de tête assemblé avec le support d'angle droit sur le poteau (Figure 2). Assurez-vous que les barres de support de plaque de tête sont alignées avec l'essieu de telle sorte que la souris puisse adopter une position de marche adéquate et confortable sur le tapis roulant (figure 2C).

3. Expression du capteur tAKARMD dans le Cortex de souris

1. Électroporation in utero
   1. Préparer une solution d'ADN pour l'UeI en ajoutant une concentration finale de 0,2 % de colorant vert rapide (pour la visualisation pendant l'injection) à un ADN plasmide (3 à 4 g/L; le capteur construit contenant un moteur CAG, une séquence de capteur et un virus de l'hépatite de la marmotte l'élément de réponse post-transcriptionnelle [WPRE] rehausseur translationnel) dissous/dilué dans l'eau ou Tris-EDTA.
   2. Préparer une souris femelle enceinte chronométrée (p. ex. C57BL/6) pour l'UEI à l'E16²⁴. Anesthésiez la souris à l'isoflurane (4 % pour l'induction et 1,5 % pour l'entretien, sur 95 % d'O2 avec 5 % de CO₂) et appliquez l'injection sous-cutanée d'analgésiques périopératoires contenant 5 mg/kg de Méloxicam et 4 mg/kg de Bupivacaine. Coupez la cavité abdominale avec un scalpel et une paire de ciseaux et exposez soigneusement les cornes utérines.
   3. Injecter 1 L de solution d'ADN par embryon dans le ventricule latéral d'un hémisphère, tel que décrit précédemment²⁴.
   4. Effectuez régulièrement IUE²⁴ pour les neurones corticaux en plaçant le pied d'extrémité d'électrode positif au cortex et en utilisant cinq impulsions carrées de 100 ms (38 V) à 1 Hz avec un électroporateur.
      REMARQUE : Différentes régions corticales peuvent être ciblées pour l'électroporation en changeant le placement du pied d'extrémité d'électrode par rapport au ventricule latéral.
2. Injection stéréotaxique
   1. Préparer une souris au jour postnatal 30 pour la chirurgie stéréotaxique²⁶. Anesthésiez la souris telle que décrite à l'étape 3.1.2., et appliquez l'injection sous-cutanée d'analgésiques périopératoires contenant 5 mg/kg de carprofène.
   2. Diluer le sérotype AAV 2/1 (AAV2/1) exprimant hSyn-tAKAR-WPRE à un tter déterminé empiriquement (1 x 10⁹x 1 x 10¹⁰ génomes/L) dans une membrane d'acétate de cellulose de 0,2 m) tamponnée par le phosphate.
   3. Percer un trou de 500 m de diamètre à l'aide d'une perceuse portatif sous un stéréomicroscope aux coordonnées suivantes pour le cortex moteur : 0,5 mm antérieur à bregma, 1,2 mm latérale à moyenne.
   4. Monter un injecteur (p. ex., manipulateur hydraulique à l'huile, avec piston sur mesure/porte-pipette en verre) à un manipulateur motorisé. Placez l'aiguille d'injection à un angle de 15 degrés par rapport au plan bregma-lambda. Programmez un mouvement diagonal à travers les axes x et z équivalant à une progression de 700 m et de 200 m le long des axes antérieurs-postérieurs et dorsal-ventral, respectivement.
      REMARQUE: Pour éviter d'endommager le tissu directement au-dessus du champ d'imagerie prévu, les particules AAV sont injectées à un angle par rapport au plan bregma-lambda.
   5. Placez la pointe de l'aiguille d'injection au centre du trou de forage et exécutez lentement le mouvement diagonal (25 m/s) décrit ci-dessus. Cette procédure positionnera le centre d'injection à 1,2 mm antérieure à bregma, 1,2 mm latérale à midline, 0,2 mm au-dessous de la pia.
   6. Injecter 20 nL de particules virales diluées (10 nL/min). Attendez au moins 10 min et rétractez lentement l'aiguille d'injection (12,5 m/s).
   7. Terminer la procédure d'injection stéréotaxique et coller / suturer la peau²⁶.

4. Installation de la fenêtre crânienne

1. Effectuer le placement de la fenêtre crânienne sur des souris exprimant tAKARMD par l'intermédiaire de l'IUE (section 3.1) ou l'injection stéréotaxique de particules virales (section 3.2), entre les jours postnatals 30 et 60. Pour la souris infectée par des particules virales, implémentez la fenêtre crânienne au moins deux semaines après l'injection du virus. Installer la fenêtre crânienne comme décrit précédemment^27,28, avec les détails suivants. Anesthésiez la souris telle que décrite à l'étape 3.1.2., et appliquez l'injection sous-cutanée d'analgésiques périopératoires 0,075 mg/kg Buprenex et l'agent anti-inflammatoire Dexamethasone à 4 mg/kg.
2. Enlever le périoste et rétracter le muscle du cou. Collez le bord de la peau au crâne avec de l'adhésif tissulaire pour éviter l'exposition de la musculature du cou après la chirurgie.
3. Séchez et enlevez tout périosteume du crâne en grattant doucement à l'aide d'un scalpel. Placez la plaque d'imagerie (8 mm de diamètre intérieur) pour entourer le champ d'imagerie prévu. Collez la plaque de tête sur le crâne à l'aide de colle à base de cyanoacrylate, suivie de ciment acrylique dentaire. Pour une adhérence optimale, assurez-vous que la plaque de tête repose sur le crâne exposé et séché. L'accélérateur de colle peut être utilisé pour accélérer le durcissement.
4. Dessiner un cercle de 5 mm de diamètre au-dessus du champ d'imagerie prévu (coordonnées telles que spécifiées à l'étape 3.2.3) à l'aide d'une perceuse dentaire et exposer le dura mater.
5. Appliquer une fine couche de polymère transparent, également appelée dura artificielle, sur la surface de dura pour couvrir toute la fenêtre crânienne. Le polymère protégera et stabilisera le dura mater. Placer un bordereau circulaire stérile (5 mm de diamètre) sur le dura mater. Fixer le bordereau avec de la colle cyanoacrylate appliquée sur les bords de la fenêtre suivie par du ciment acrylique dentaire.

5. In Vivo Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

1. Commencer l'imagerie 2pFLIM à ou au-delà de 2 semaines après l'installation de la fenêtre crânienne (section 4). Minimisez les interférences expérimentales dues au stress par la manipulation fréquente et le griffonnage de la souris avant le début de l'étude d'imagerie pour s'habituer à la souris.
2. Définir la longueur d'onde laser excitation à deux photons à 960 nm à l'aide du logiciel qui contrôle le laser à deux photons.
3. Anesthésiez la souris à l'aide de 4% d'isoflurane. Confirmer l'anesthésie appropriée en pinçant la queue et en observant les taux respiratoires. C'est-à-dire qu'il ne devrait pas y avoir de réponse à la pince à queue et que le taux respiratoire devrait être réduit à 1 respiration par seconde. Pour minimiser le temps procédural inutile et parce que l'anesthésie ne dure que deux à trois minutes, les lubrifiants pour les yeux ne sont pas utilisés.
4. Transférer la souris anesthésié sur le tapis roulant motorisé (figure 2C) et monter la plaque avant de la souris sur le support de la plaque avant de la configuration du tapis roulant (voir la figure 2 pour plus de détails). Nettoyez la surface de la vitre crânienne de la souris avec 70 % d'éthanol.
5. Placez le tapis roulant motorisé avec la souris montée sous l'objectif 2pFLIM. Appliquer une goutte d'eau distillée entre le bordereau de fenêtre crânien et l'objectif.
6. Laissez la souris montée se réveiller de l'anesthésie et s'acclimater à l'environnement du tapis roulant et du microscope pendant au moins 10 min. Surveiller le taux de respiration de la souris pendant que la souris montée se réveille de l'anesthésie.
7. Naviguez jusqu'au lieu d'injection sous épi-illumination. Documenter les caractéristiques fiduciales (c.-à-d. les vaisseaux sanguins) sous brightfield pour faciliter l'imagerie de la même région d'intérêt (ROI) pendant les séances d'imagerie suivantes.
8. Éliminez toute lumière entrante autre que la lumière émise par le tissu cérébral. Éteignez la source de lumière de l'épi-illumination et fermez l'enceinte de la plate-forme 2pFLIM. Activez le PMT 2pFLIM en allumant le contrôle de tension de commande matériel.
9. Acquérir une image z-pile 2pFLIM à l'aide du logiciel d'acquisition 2pFLIM FLIMimage avec les paramètres recommandés suivants pour l'imagerie des somatas positifs tAKARMD chez les souris éveillées. Définir la moyenne du cadre à 3 images, la vitesse de numérisation à 2 ms/ligne, la taille de l'image à 128 x 128 pixels, et le champ de vision à 90 à 100 m. Ajuster les réglages d'imagerie en fonction de la configuration de préparation et du matériel.
10. Inspecter l'image acquise dans FLIMview (logiciel personnalisé développé à l'interne; voir la section 6). Ajuster les réglages d'imagerie après l'étape 5.9 afin d'optimiser le nombre de photons et de minimiser le photoblanchiment.
    REMARQUE: Un nombre de photons intégrés réalisables dans un retour sur investissement pour l'imagerie à vie d'un soma positif tAKARMD in vivo est de 1 000 à 10 000 photons selon l'amplitude du signal résultant d'un stimulus particulier (voir Discussion).
    1. Au besoin, utilisez un champ de vision diminué, une vitesse de balayage réduite, une augmentation de la puissance laser et une augmentation du nombre d'images à moyennepour augmenter le nombre de photons intégrés et réduire l'erreur d'estimation à vie. Dans le même temps, assurez-vous d'utiliser la puissance laser essentielle minimale, la moyenne du cadre, et la vitesse de numérisation pour minimiser le photoblanchiment.
11. Image à un intervalle de temps régulier (p. ex., tous les 30 à 60 s) en répétant l'acquisition de la pile z à l'aide de paramètres déterminés à l'étape 5.10. Acquérir des images de base 2pFLIM pendant au moins 15 min à vitesse de tapis roulant zéro.
12. Définir la vitesse de rotation du tapis roulant à 15 cm/s pendant 15 min tout en acquérant des images 2pFLIM. Poursuivre l'imagerie pendant 20 minutes après l'arrêt de la rotation du tapis roulant, afin d'évaluer la durée de l'activité des PKA après l'arrêt de la locomotion forcée.

6. Analyse de 2pFLIM Images

1. Ouvrez les images acquises dans FLIMview et définiz les paramètres suivants dans le FLIMview.
   REMARQUE : Les détails du paramètre sont décrits dans DISCUSSION.
   1. Cliquez sur les champs de comptage de photonunique (SPC) minimum et de portée maximale dans FLIMview. Entrez la valeur de la plage sPC minimale et maximale appropriée, qui varie généralement entre 1,2 et 10 à 12 ns, respectivement.
   2. Cliquez sur le champ de valeur t₀ dans FLIMview et entrez la valeur t₀ (généralement 2 ns). Cliquez sur le champ de valeur seuil minimum de luminance à vie dans FLIMview et entrez la valeur de seuil souhaitée à 5 à 30 photons.
2. Cliquez sur le nouveau bouton de groupe (N) et attribuez un nom de groupe expérimental. Cela générera un groupe qui combine les données de chaque image FLIM ajoutée.
3. Cliquez sur le bouton ROI dans le module Roi Controls de FLIMview et tirez un retour sur investissement autour d'un soma positif au tAKAR. Réduisez la plage de z-stack, en déplaçant la limite z inférieure et supérieure dans les curseurs de contrôle de z-pile dans FLIMview, pour réduire au minimum la contamination de signal provenant des photons de fond dans d'autres profondeurs de z.
4. Cliquez sur le bouton '' pour ajouter l'image FLIM au groupe (étape 6.2). Cliquez sur le bouton Calc pour calculer la durée de vie moyenne (LT, également appelée temps d'émission moyen de photons [MPET]), pour le retour sur investissement et l'erreur d'estimation de la durée de vie.
5. Ouvrez le fichier suivant de la série d'imagerie chronique 2pFLIM. Répétez l'étape 6.4. Assurez-vous d'ajuster la position de la gamme ROI et z-stack pour mesurer le même soma tAKARMD positif au fil du temps, car il peut y avoir une dérive tissulaire au fil du temps.
6. Sélectionnez le deltaMPET/MPET₀ dans le menu déroulant du module Contrôles de groupe. Cliquez sur le champ de base et entrez l'index (es) (p. ex., 1 2 3 4 5 pour les cinq premières images du groupe créé à l'étape 6.3). Cela définira l'image (s) utilisée pour calculer la durée de vie de base (LT₀).
7. Cliquez sur Plot pour générer un graphique contenant la réponse FLIM (LT/LT₀) de tAKARmD pendant l'expérience dans les ROIs définis. Les changements normalisés de durée de vie (LT) des IA individuels par la durée de vie de référence correspondante (LT₀) permettent de comparer l'activité de la PKA pendant la locomotion entre les différents ROI.

Les capteurs FRET-FLIM permettent la visualisation de nombreuses voies de signalisation différentes, y compris la voie cAMP/PKA impliquée dans la neuromodulation. Le protocole actuel utilise le capteur tAKARMD récemment développé en combinaison avec 2pFLIM pour visualiser les activités de PKA chez les souris ayant un comportement fixe à la tête. La plupart des microscopes à deux photons existants peuvent être améliorés avec des capacités 2pFLIM en ajoutant trois à quatre composants, comme illustré à la figure 1 (voir aussi la section 1). Pour visualiser FRET en images acquises 2pFLIM, la quantification de la durée de vie moyenne a été réalisée sur des parcelles histogrammes de la synchronisation des photons recueillies par pixel (Figure 3A, B). La durée de vie moyenne a été visualisée à l'aide d'une image pseudo-colorée, dans laquelle les durées de vie moyennes élevées (couleur froide) et basses (couleur chaude) représentent des activités PKA faibles et élevées, respectivement, puisque l'activation de PKA conduit à la diminution de la durée de vie. Il faut prendre soin de définir correctement la plage de CPS; cette plage doit être fixée dans l'intervalle d'impulsion laser (p. ex., 12,5 ns d'un pouls de 80 MHz) avec des artefacts matériels réduits (voir aussi la section 6 et DISCUSSION). Le calcul de l'activité de La PKA au sein des IO a été effectué en combinant le LT de tous les pixels au sein d'un retour sur investissement donné (Figure 3C,D). Chez les souris éveillées fixées à la tête, la durée de vie basale variait entre 1,3 et 1,8 ns (figure3E). L'imagerie de tAKARMD dans le cortex moteur chez des souris éveillées fixées à la tête a permis la quantification en temps réel de l'activité de la PKA avec une résolution cellulaire pendant la locomotion basale et forcée (figure 4). L'expérience peut être répétée sur des jours et des mois. La locomotion forcée déclenche l'activité de PKA dans une population de neurones dans les couches superficielles du cortex moteur de souris17. Cette activité de PKA dépend de la neuromodulation par l'activation des récepteurs adrénergiqueet et D117.

Figure 1 : Schéma d'un système 2pFLIM. 2pFLIM peut être mis en œuvre sur un microscope conventionnel à deux photons par l'ajout des composants matériels jaunes mis en évidence : un module de comptage de chronométrage de photon, un tube de photomultiplicateur rapide à faible bruit (PMT), un photodiode (seulement nécessaire si le laser n'a pas un la signalisation de sortie pour la synchronisation de laser), et un séparateur de signal facultatif. Ce chiffre a été modifié à partir de Ma et coll.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Conception d'un tapis roulant motorisé sur mesure. (A) Schéma de la conception du tapis roulant de l'avant (en haut à gauche), côté (en haut à droite), et les vues du haut (en bas à gauche). L'essieu du tapis roulant (boule de mousse) est relié à un encodeur rotatif et à un moteur qui sont montés collectivement sur deux poteaux sur une plaque de pain en aluminium massif. Le support compatible avec la plaque de tête sur support à angle droit est fixé à un poteau solide et placé au-dessus du tapis roulant. Les dessins schématiques ne sont pas à l'échelle. Avant (B) et côté (C) voir les photographies du tapis roulant. Le positionnement approprié de la souris sur le tapis roulant est indiqué dans le panneau C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Quantification des données 2pFLIM. (A) Une image FLIM avec chaque pixel pseudo-coloré pour représenter la durée de vie moyenne (LT), par rapport à la synchronisation laser, de tous les photons dans ce pixel. (B) Les heures d'arrivée du photon dans un seul pixel (carré violet dans le panneau A) ont été tracées dans un histogramme (panneau gauche). Des limites d'intégration ont été définies pour déterminer la plage de comptage des photons (SPC, gris). Dans la plage sCP, l'intégrale de la synchronisation des photons a été divisée par le nombre total de photons, puis soustrait par le t0 (1,65 ns, ligne pointillée), résultant en une durée de vie moyenne (LT, distance entre les lignes pointillées et pointillées) de 1,74 ns. La quantification de la durée de vie moyenne de l'ensemble du champ de vision (carré bleu clair dans le panneau A) impliquait l'intégration de la synchronisation des photons collectées dans tous les pixels (panneau droit), ce qui a donné une durée de vie moyenne de 1,7 ns. Les insets affichent les mêmes données à l'échelle semi-log. (C et D) Quantification de la durée de vie moyenne par région d'intérêt (ROI). (C) Exemple représentatif d'une image 2pFLIM. Deux ROIs ont été dessinés autour de deux somata dans la couche 2/3 du cortex moteur. (D) Distributions de synchronisation photon intégrées sur tous les pixels dans chaque roi-retour (panneau gauche). Les ROI cellulaires étaient codés en couleur (comme le montre le panneau C) rouge, cellule 1; bleu, cellule 2. Le nombre normalisé de photons permet de comparer les distributions de synchronisation des photons entre les deux ROI (panneau droit, durée de vie moyenne; cellule 1, 1,33 ns; cellule 2, 1,73 ns). Les insets affichent les mêmes données à l'échelle semi-log. (E) Parcelle de distribution des durées de vie basales moyennes de 254 cellules imaged dans les couches superficielles du cortex moteur. Cellules L1 (n 186 cellules/11 animaux, panneau gauche), résidant à moins de 100 m en dessous de la pia, exprimées tAKARMD après une injection stéréotaxique d'AAV2/1-hSyn-tAKAR-WPRE, et de cellules pyramidales L2/3 (n - 68 cellules/4 animaux, panneau droit), résidant au moins 150 m au-dessous de pia, a exprimé tAKARAprès iUE d'une construction d'ADN CAG-tAKAR-WPRE. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : tAKARMD suit les activités PKA induites par la locomotion forcée dans le cortex moteur. (A) Intensité représentative (panneau gauche) et images à vie (panneaux moyens et droits) de trois cellules L1 dans le cortex moteur. Les ROI cellulaires étaient codés en couleur : orange, cellule 1; bleu, cellule 2; jaune, cellule 3. (B) Distributions de synchronisation de photon mesurées dans la cellule 1 (panneau supérieur) pendant l'état basal (trace orange, mesurée dans le panneau moyen) et locomotion forcée (loco., trace orange légère, comme mesurée dans le panneau droit A). Le nombre normalisé de photons a permis une comparaison directe de la distribution du chronométrage des photons (panneau inférieur, durée de vie moyenne : basale, 1,72 ns; locomotion, 1,42 ns). Les insets affichent les mêmes données à l'échelle semi-log. (C) -vie/durée de vie0 (LLT/LT0) traces des cellules correspondantes (panneau supérieur, voir panneau A) avec vitesse de locomotion forcée (panneau inférieur). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs n'ont rien à révéler.