Une procédure est présentée pour visualiser les activités de kinase a de protéine dans les souris head-fixed, se comportant. Un journaliste amélioré d'activité de A-kinase, tAKARMD, est exprimé dans les neurones corticaux et rendu accessible pour la formation image par une fenêtre crânienne. La microscopie d'imagerie à vie à deux photons est utilisée pour visualiser les activités de LPJ in vivo pendant la locomotion forcée.
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Article de méthode
Visualisation de la protéine Kinase Une activité chez des souris à behaving à l'aide de la microscopie d'imagerie à deux photons in vivo fluorescence à vie
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La neuromodulation exerce un contrôle puissant sur le fonctionnement du cerveau. La dysfonction des systèmes neuromodulatoires entraîne des troubles neurologiques et psychiatriques. Malgré leur importance, les technologies de suivi des événements neuromodulatoires avec résolution cellulaire commencent à peine à émerger. Les neuromodulateurs, tels que la dopamine, la noradrénaline, l'acétylcholine et la sérotonine, déclenchent des événements de signalisation intracellulaire s'il y a des signaux intracellulaires par l'intermédiaire de leurs récepteurs couplés aux protéines G respectifs afin de moduler l'excitabilité neuronale, les communications synaptiques et d'autres fonctions, régulant ainsi le traitement de l'information dans le réseau neuronal. Les neuromodulateurs mentionnés ci-dessus convergent vers la voie cAMP/protéine kinase A (PKA). Par conséquent, la formation image in vivo de PKA avec la résolution unicellulaire a été développée comme readout pour des événements neuromodulatoires d'une manière analogue à l'imagerie de calcium pour des activités électriques neuronales. Ici, une méthode est présentée pour visualiser l'activité de PKA au niveau des neurones individuels dans le cortex des souris se comportant head-fixed. Pour ce faire, un journaliste d'activité A-kinase amélioré (AKAR), appelé tAKARMD, est utilisé, qui est basé sur le transfert d'énergie de résonance de Fârster (FRET). Ce capteur PKA génétiquement codé est introduit dans le cortex moteur par électroporation in utero (IUE) des plasmides d'ADN, ou injection stéréotaxique du virus adéno-associé (AAV). Les changements de FRET sont représentés à l'aide de la microscopie d'imagerie à vie à deux photons (2pFLIM), qui offre des avantages par rapport aux mesures fret ratiométriques pour quantifier le signal FRET dans le tissu cérébral qui disperse la lumière. Pour étudier les activités de La PKA pendant la locomotion forcée, tAKAREstEst est représenté à travers une fenêtre crânienne chronique au-dessus du cortex des souris éveillées, fixées à la tête, qui courent ou se reposent sur un tapis roulant motorisé à commande de vitesse. Cette approche d'imagerie s'appliquera à de nombreuses autres régions du cerveau pour étudier les activités Correspondantes de LTP induites par le comportement et à d'autres capteurs FLIM pour l'imagerie in vivo.
Introduction
La neuromodulation, également connue sous le nom de transmission synaptique lente, impose un contrôle fort sur la fonction cérébrale pendant différents états comportementaux, tels que le stress, l'excitation, l'attention, et la locomotion1,2,3, 4. Malgré son importance, l'étude du moment et de l'endroit où se déroulent les événements neuromodulatoires en est encore à ses balbutiements. Les neuromodulateurs, y compris l'acétylcholine, la dopamine, la noradrénaline, la sérotonine et de nombreux neuropeptides, activent les récepteurs couplés au....
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Protocole
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Oregon Health and Science University.
1. 2pFLIM Microscope Setup
- Installer un module de comptage de la synchronisation des photons (PTCM, Table ofMaterials) et vous connecter à l'ordinateur (Figure 1) selon le manuel du fabricant.
REMARQUE: Le PTCM est généralement une carte d'ordinateur qui reçoit une entrée "sync" pour le moment de l'impulsion laser et une entrée de photon du tube photomultiplicateur (PMT). Il reçoit également le chr....
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Résultats
Les capteurs FRET-FLIM permettent la visualisation de nombreuses voies de signalisation différentes, y compris la voie cAMP/PKA impliquée dans la neuromodulation. Le protocole actuel utilise le capteur tAKARMD récemment développé en combinaison avec 2pFLIM pour visualiser les activités de PKA chez les souris ayant un comportement fixe à la tête. La plupart des microscopes à deux photons existants peuvent être améliorés avec des capacités 2pFLIM en ajoutant trois à quatre composants, comme.......
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Discussion
Ce protocole démontre l'utilisation du capteur FRET-FLIM tAKARMD pour visualiser l'activité PKA déclenchée par la neuromodulation chez les souris ayant un comportement fixe à la tête. Cette application est basée sur des tests approfondis et des caractérisations de tAKARMD in vitro et in vivo pour démontrer que le signal FLIM obtenu est pertinent pour les événements neuromodulatoires physiologiques17. Ici, une application in vivo, l'activité PKA induite par la locomotion dans le cortex moteur, est .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions Mme Tess J. Lameyer, Mme Ruth Frank et le Dr Michael A. Muniak pour les modifications et les commentaires, et le Dr Ryohei Yasuda de Max Planck Florida pour le logiciel d'acquisition 2pFLIM. Ce travail a été soutenu par deux prix BRAIN Initiative U01NS94247 (H.Z. et T.M.) et R01NS104944 (H.Z. et T.M.), une subvention R01RS081071 (T.M.), et une subvention R21NS097856 (H.Z.). Tous les prix proviennent du National Institute of Neurological Disorders and Stroke, États-Unis.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,2 &mu ; m filtre seringue en acétate de cellulose | Nalgene | 190-2520 | Étape 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA objectif à immersion dans l’eau | Nikon | MRP07220 | Étape 5.5. |
| Câble 3 broches | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Étape 2.5. Pour connecter le capteur de rotation à l’entrée DAQ du microscope |
| Planche à pain en aluminium | Thorlabs | MB1012 | Étape 2.5. |
| Logiciel AnimalTracker MATLAB | N/A | /A | Étape 2.5 et sections 5 à 6. Sera fourni sur demande à l’auteur principal |
| Filtre barrière passe-bande | Chroma | ET500-40m | Étape 1.4. |
| Plaque de cage | Thorlabs | CP01 | Étape 2.4. Utilisé comme support pour capteur |
| de rotation Meules en acier au carbone pour micro-foret, diamètre de pointe de 0,5 mm | FST | 19007-05 | Étapes 3.2.3. et 4.4. |
| Lamelle circulaire (5 mm de diamètre) | VWR | 101413-528 | Étape 4.5. |
| Porte-aiguille d’injection sur mesure | N/A N | /A | Étape 3.2.4. Détails techniques fournis sur demande à l’auteur principal |
| Acrylique dentaire | Yates Motloid | 44114 | Étapes 4.3. et 4.5. |
| Foret dentaire ; Produits Microtorque ii | Ram | 66699 | Étapes 3.2.3. et 4.4. |
| Polymère transparent Dowsil | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Étape 4.5. Dure-mère artificielle |
| Électrode d’électroporation | Bex | LF650P5 | Étape 3.1.4. |
| Électroporateur | Bex | CUY21 | Étape 3.1.4. |
| Vert rapide FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Étape 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB software | N/A N | /A | Section 5. Aimablement fourni par Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
| FLIMview MATLAB software | N/A | /A | Sections 5. et 6. Sera fourni sur demande à l’auteur principal |
| Colle compatible avec la mousse (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Étape 2.3. |
| Plaque de tête | N/A | N/A | Étape 4.3. Détails techniques fournis sur demande à l’auteur principal Support de |
| plaque de tête | N/A | N/A | Étape 2.6. Détails techniques fournis sur demande auteur principal, utilisé en combinaison avec le support de poteau de montage et le support à angle droit |
| Micromanipulateur hydraulique | Narishige | MO-10 | Étape 3.2.4. |
| Colle Krazy Colle | Krazy | KG82648R | Étape 4.3. Colle à base de cyanoacrylate |
| Tube photomultiplicateur rapide à faible bruit | Hamamatsu | H7422PA-40 ou H10769PA-40 | Étape 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6 et sections 5 et 6. Utilisé pour exécuter le logiciel d’acquisition de microscopes et d’analyse de données |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Étape 2.4. |
| Régulateur de vitesse moteur | Elenker | EK-G00015A1-1 | Étape 2.5. |
| Micromanipulateur motorisé | Sutter | MP-285 | Étape 3.2.4. |
| Base de montage | Thorlabs | BA1S | Étape 2.5. Utilisé pour les poteaux pour moteur et capteur en combinaison avec PH4 et TR2 |
| Poteau de montage | Thorlabs | P14 | Étape 2.6. Utilisé pour le poteau de support de plaque de tête en combinaison avec PB2 |
| Base de poteau de montage | Thorlabs | PB2 | Étape 2.6. Utilisé pour le poteau de support de plaque de tête en combinaison avec le |
| support de poteau de montage | Thorlabs | C1515 | Étape 2.6. Utilisé en combinaison avec le support à angle droit et le support de plaque de tête |
| Poteau optique | Thorlabs | TR2 | Étape 2.5. Utilisé pour les tenons pour moteur et capteur en combinaison avec BA1S et PH4 |
| Phosphate salin | Nu ;/&Alpha ; | &nu ;/&alpha ; | Étape 3.2.2. Protocole : Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi : 10.1101/pbd.rec8247 |
| Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Étape 1.2. |
| Module de comptage de synchronisation de photons | Becker et Hickl | SPC-150 | Étape 1.1. |
| Plasmide : tAKAR&alpha ; (CAG-tAKAR&alpha ;-WPRE) | Ajouter | 119913 | Étape 3.1.3. |
| Support de poteau | Thorlabs | PH4 | Étape 2.5. Utilisé pour les poteaux de moteur et de capteur en combinaison avec BA1S et TR2 |
| Support à angle droit | Thorlabs | AB90 | Étape 2.6 Utilisé en combinaison avec le support de poteau de montage et le support de plaque de tête |
| Codeur de rotation | US digital | MA3-A10-250-N | Étape 2.4. |
| Tapis en caoutchouc | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Étape 2.1. |
| Accouplement d’arbre (1/4 pouce x 1/4 pouce) | McMaster | 6208K433 | Étapes 2.3. et 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Étapes 5.9 et 6.1. |
| Répartiteur de signal | Becker et Hickl | HPM-CON-02 | Étape 1.3.1. |
| Essieu en acier inoxydable (diamètre 1/4 pouce, L = 12 po) | McMaster | 1327K66 | Étape 2.3. |
| Système d’alignement stéréotaxique | David kopf | 1900 | Étapes 3.2. et 4.1. modifiées ; Micromanipulateur Sutter, porte-aiguille d’injection sur mesure, micromanipulateur hydraulique |
| Microscope à deux photons | N/A | N/A | Section 5. Construit sur la base du système modulaire de microscopie multiphotonique in vivo (MIMMS) du HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
| Adhésif tissulaire Vetbond | 3M | 14006 | Étape 3.2.6. |
| Virus : tAKAR&alpha ; (AAV2/1 hSyn-tAKAR&alpha ;-WPRE) | Addgene | 119921 | Étape 3.2.2. |
| Rouleau en mousse PE blanc (8 po x 12 po) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Étape 2.1.1. |
| Polystyrène blanc pour demi-boules | GrahamSweet | 200mm de diamètre 2 moitiés creuses | Étape 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | Étape 4.3. Accélérateur de durcissement |
Références
- Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).
- Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).
- Sun, Y., Hunt, S., Sa....
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Réimpressions et autorisations
