Ce protocole décrit un ensemble de méthodes pour identifier la connectivité fonctionnelle spécifique de type cellulaire des entrées à longue portée des régions éloignées de cerveau utilisant des stimulations optogénétiques dans des tranches de cerveau ex vivo.
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Article de méthode
Injections stéréotaxiques intracérébrales in vivo pour la stimulation optogénétique des entrées à longue portée dans les tranches de cerveau de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
La connaissance de la connectivité synaptique spécifique de type cellulaire est une condition préalable cruciale pour comprendre les circuits neuronaux à l'échelle du cerveau. L'étude fonctionnelle des connexions à longue portée nécessite des enregistrements ciblés de neurones uniques combinés à la stimulation spécifique d'intrants éloignés identifiés. Ceci est souvent difficile à réaliser avec les techniques conventionnelles et de stimulation électrique, parce que les axones des zones convergentes du cerveau en amont peuvent se mêler dans la région cible. Le ciblage stéréotaxique d'une région spécifique du cerveau pour l'expression par le virus des canaux ioniques sensibles à la lumière permet la stimulation sélective des axones provenant de cette région avec la lumière. Les injections stéréotaxiques intracérébrales peuvent être utilisées dans des structures bien délimitées, telles que les noyaux thalamiques antérieurs, en plus d'autres zones sous-corticales ou corticales dans tout le cerveau.
Décrit ici est un ensemble de techniques pour l'injection stéréotaxique précise des vecteurs viraux exprimant la canalrhodopsine dans le cerveau de souris, suivie par la photostimulation des terminaux d'axone dans la préparation de tranche de cerveau. Ces protocoles sont simples et largement applicables. En combinaison avec l'enregistrement de pince de correction de pleine cellule d'un neurone postsynaptically relié, la photostimulation des axones permet la détection des connexions synaptiques fonctionnelles, la caractérisation pharmacologique, et l'évaluation de leur force. En outre, le remplissage de biocytine du neurone enregistré peut être employé pour l'identification morphologique post-hoc du neurone postsynaptic.
Introduction
Définir la connectivité entre les régions du cerveau est nécessaire pour comprendre les circuits neuronaux. Les méthodes classiques de traçage anatomique permettent d'établir une connectivité interrégionale, et les études sur les lésions aident à comprendre l'organisation hiérarchique du flux d'information. Par exemple, les circuits cérébraux pour l'orientation spatiale et la signalisation de direction de la tête impliquent le flux directionnel de l'information du thalamus au présubiculum. Ceci a été démontré par des études de lésion des noyaux thalamicants antéro-dorsal (ADN) qui dégradent le signal de direction de tête dans le presubiculum dorsal en aval, aussi bien....
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Protocole
Toutes les procédures ont été réalisées conformément à la directive du Conseil communautaire européen (2010/63/UE) et approuvées par le comité d'éthique de l'Université Paris Descartes. L'expérimentateur doit obtenir l'autorisation de la procédure pour se conformer à la réglementation locale.
1. Planification de l'expérience
- Définir la zone du cerveau à cibler. Déterminer les coordonnées stéréotaxiques du site d'injection à l'aide d'un atlas du cerveau de souris15. Pour le noyau thalamique antéro-dorsal droit (ADN), les coordonnées sont : -0,82 postérieur, 0,75 latéral, -3,2 profondeur (mm) par rapport au b....
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Résultats
La procédure présentée ici a été utilisée pour exprimer une canalrhodopsine bleu sensible à la lumière (Chronos) fusionnée à GFP dans le noyau antéro-dorsal du thalamus (ADN), par injection stéréotaxique du virus antérograde adéno-associé. Les coordonnées stéréotaxiques ont été déterminées selon un atlas du cerveau de souris et testées en injectant 200 nL de fluoro-ruby fluorescent. L'animal a été sacrifié 10 min après l'injection, et le cerveau a été extrait et fixé pendant la nuit. Les sections du cerveau coronal ont é.......
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Discussion
L'injection virale in vivo pour exprimer les opsines sensibles à la lumière dans une zone cérébrale définie est une méthode de choix pour l'analyse optogénétique de la connectivité fonctionnelle à longue portée10,11,17,18. Les injections stéréotaxiques offrent la possibilité de cibler précisément une zone spécifique du cerveau. La coexpression d'un opsin avec un journaliste fluorescent permet c.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
Nous remercions Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang et Jean Simonnet pour leur aide dans le développement des versions précédentes du protocole d'injection stéréotaxique et Marin Manuel et Patrice Jegouzo pour leur aide technique. Ce travail a été soutenu par le ministère Français de l'éducation et de la recherche (L. R., L. S.), le Centre national des Etudes Spatiales (M. B.) et l'Agence Nationale de la Recherche Grant
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Meule de 0,5 mm ; | Appareil de Harvard | 724962 | |
| 10 & micro ; L Seringue Hamilton | Hamilton | 1701 RN - 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | ; text |
| 36 % PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED ; | Cairn Research | P1105/470/LED ; DC/59022m | utilisation avec filtre d’excitation adapté 470/40x ; et filtre d’émission pour GFP ; |
| AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 ; |
| Tous les produits chimiques | Sigma | ||
| Régulateur de température de bain | Luigs & Neumann | SM7 | réglé à 34° ; C ; |
| aiguille en métal biseauté | Hamilton | 7803-05 | calibre 33, 13mm, pointe style 4-20° ; |
| Grands ciseaux | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytine | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Capillaires en borosilicate | Havard Apparatus | GC150-10 | 1,5 mm extérieur, 0,86 diamètre intérieur |
| Marron Extracteur d’électrode enflammé | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Tamponné Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| aiguille papillon pour la perfusion | Braun ; | Venofix A | 24G |
| Caméra CCD | Andor ; | DL-604M | |
| Microscope Confocal | Zeiss | LSM710 | 20X |
| pince courbée | FST ; | 11011-17 | |
| Configuration CY5 (confocale) | Hélium-Néon 633nm (5,0 mW) laser ; Miroir : MBS 488/561/633 ; | ||
| Configuration CY5 (épifluo) | Nikon/Chroma | Lumière fluorescente (Intensilight) ; Filtre d’excitation : BP645/30 ; Miroir dichroïque : 89100 BS ; Filtre d’émission : BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Configuration DAPI (epifluo) | Nikon/Chroma | Lumière fluorescente (Intensilight) ; Cube : Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation : BP 377/50 ; Rétroviseur : BS 409 ; Émission : BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Compteur optique numérique portable | ThorLabs | PM100D | Paramétré sur 475 nm |
| Lames de rasoir en acier inoxydable Double egde | Microscopie électronique Sciences | 72000 | Utiliser la moitié de la lame dans la trancheuse |
| Lampe de poche à protéines fluorescentes double | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm ; Filtre d’émission sur lunettes, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Microscope à épifluorescence | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 ou 20X |
| Papier filtre | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10 % | Millipore | AG335 | dissoudre 10 mg en 100 & micro ; l d’eau distillée ; injecter 150 à 300 nl |
| Configuration GFP (epifluo) | Nikon/Chroma | Lumière fluorescente (Intensilight) ; Cube : Jeu de filtres Nikon B-2E/C FITC (Excitation : BP 465-495 ; Rétroviseur : BS 505 ; Emission : BP 515-555) | |
| Plaque chauffante | Physitemp | HP4M | |
| Héparine choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml flacon | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| Kit de micromoteur rotatif haute vitesse | Foredom | K.1070 | vitesse de forage maximale 38 000 tr |
| /minComposés de solution interne : | |||
| Stimulateur d’impulsions isolé | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Kétamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10 | Merial | 100 mg/ml : diluer 1 & micro ; l dans 1ml au total (0,1 %) | |
| Laocaïne (lidocaïne) | MSD | 16,22 mg/ml : diluer 1 ml dans 4 ml au total (environ 4 %) | |
| LED haute puissance spot pour la chirurgie | Photonique (via Phymep) | 10044 | |
| Alimentation LED | Cairn | Research OptoLED | |
| Luigs & Neumann | SM-7 | ||
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro régulateur de température | Physitemp | MTC-1 | |
| Lait en poudre | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0,4 |
| mM porte-aiguille/hémostat | FST | 13005-14 | |
| Logiciel d’acquisition pClamp Axon | Instruments | ||
| Pompe péristaltique | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 sur l’écran pour 2-3 ml/min ; |
| Gluconate de potassium (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold anti-décoloration | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2 % (xylazine) | Petits | ||
| FST | 14060-09 | ||
| Chlorure de sodium 0,9 % ; | Virbac | dilué 8,5 mL dans 10 ml au total | |
| Stéréomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Cadre stéréotaxique avec affichage numérique | Kopf | Modèle 940 | Instrument stéréotaxique pour petits animaux |
| Streptavidin-Cy3 conjugué | Life technologies ; | ||
| Streptavidin-Cy5 conjugué | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Filament de suture Ethilon II 4-0 polyamide | Ethicon | F3210 | |
| Pompe à seringue | kdScientific | Legato 130 - 788130 | Utiliser les modes d’infusion et de retrait |
| Trancheuse de tissus | Leica | VT1200S | vitesse 0,07, amplitude 1. |
| tube | Gilson | F117942, F117946 | Jaune/Noir, Violet/Noir |
| droit | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry papier absorbant | de paillasse Nalgene |
Références
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S.
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Réimpressions et autorisations
