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Article de méthode

Méthodes pour tester la perturbation endocrinienne dans le mélanogaster drosophila

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DOI :

10.3791/59535

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3 juillet 2019

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1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

Dans cet article

Résumé

Les perturbateurs chimiques endocriniens (CED) représentent un grave problème pour les organismes et pour les milieux naturels. Drosophila melanogaster représente un modèle idéal pour étudier les effets d'EDC in vivo. Ici, nous présentons des méthodes pour étudier la perturbation endocrinienne dans Drosophila, traitant des effets d'EDC sur la fécondité, la fertilité, le moment développemental, et la durée de vie de la mouche.

Résumé

Ces dernières années, il y a eu de plus en plus de preuves que tous les organismes et l'environnement sont exposés à des produits chimiques hormonaux, connus sous le nom de produits chimiques perturbateurs endocriniens (CED). Ces produits chimiques peuvent modifier l'équilibre normal des systèmes endocriniens et entraîner des effets néfastes, ainsi qu'un nombre croissant de troubles hormonaux dans la population humaine ou une croissance perturbée et une reproduction réduite chez les espèces sauvages. Pour certains EDC, il y a des effets documentés sur la santé et des restrictions sur leur utilisation. Cependant, pour la plupart d'entre eux, il n'y a toujours aucune preuve scientifique en ce sens. Afin de vérifier les effets endocriniens potentiels d'un produit chimique dans l'organisme entier, nous devons le tester dans les systèmes modèles appropriés, ainsi que dans la mouche des fruits, Drosophila melanogaster. Ici nous rapportons les protocoles in vivo détaillés pour étudier la perturbation endocrinienne dans Drosophila, traitant des effets d'EDC sur la fécondité/fertilité, le moment développemental, et la durée de vie de la mouche. Au cours des dernières années, nous avons utilisé ces traits de vie Drosophila pour étudier les effets de l'exposition à 17-ethinylestradiol (EE2), bisphénol A (BPA), et bisphénol AF (BPA F). Au total, ces essais couvraient toutes les étapes de la vie de Drosophila et permetaient d'évaluer la perturbation endocrinienne dans tous les processus à médiation hormonale. Les tests de fécondité/fertilité et de synchronisation du développement ont été utiles pour mesurer l'impact d'EDC sur la performance reproductrice de la mouche et sur les stades de développement, respectivement. Enfin, l'exemple de durée de vie impliquait une exposition chronique d'EDC aux adultes et mesurait leur survie. Cependant, ces traits de vie peuvent également être influencés par plusieurs facteurs expérimentaux qui ont dû être soigneusement contrôlés. Donc, dans ce travail, nous suggérons une série de procédures que nous avons optimisées pour le bon résultat de ces essais. Ces méthodes permettent aux scientifiques d'établir une perturbation endocrinienne pour n'importe quelle EDC ou pour un mélange de différentes EDC dans Drosophila, bien que pour identifier le mécanisme endocrinien responsable de l'effet, d'autres essais pourraient être nécessaires.

Introduction

Les activités humaines ont libéré dans l'environnement une quantité massive de produits chimiques, qui représentent un grave problème pour les organismes et pour les écosystèmes naturels1. Parmi ces polluants, on estime qu'environ 1 000 produits chimiques différents peuvent modifier l'équilibre normal des systèmes endocriniens; selon cette propriété, ils sont classés comme produits chimiques perturbateurs endocriniens (EDC). Plus précisément, sur la base d'une définition récente de la Société endocrinienne, les EDC sont « un produit chimique exogène, ou mélange de produits chimiques, qui peut interférer avec n'importe quel aspect de l'action hormonale »2. Au cours des trois dernières décennies, il y a eu de plus en plus de preuves scientifiques que les EDC peuvent affecter la reproduction et le développement des animaux et des plantes3,4,5,6,7, 8. En outre, l'exposition à EDC a été liée à la prévalence croissante de certaines maladies humaines, y compris le cancer, l'obésité, le diabète, les maladies thyroïdiennes, et les troubles du comportement9,10,11.

Mécanismes généraux d'EDC

En raison de leurs propriétés moléculaires, les EDC se comportent comme des hormones ou des précurseurs d'hormones3,5,6,7,8,9, 10,11,12. En ce sens, ils peuvent se lier au récepteur d'une hormone et perturber les systèmes endocriniens soit en imitant l'activité hormonale ou en bloquant les hormones endogènes liant. Dans le premier cas, après la liaison au récepteur, ils peuvent l'activer comme son hormone naturelle ferait. Dans l'autre cas, la liaison de l'EDC au récepteur empêche la liaison de son hormone naturelle, de sorte que le récepteur est bloqué et ne peut plus être activé, même en présence de son hormone naturelle3. En conséquence, les EDC peuvent affecter plusieurs processus, tels que la synthèse, la sécrétion, le transport, le métabolisme, ou l'action périphérique des hormones endogènes qui sont responsables du maintien de l'homéostasie, de la reproduction, du développement, et/ou du comportement de l'organisme. La liaison des récepteurs n'est pas le seul moyen d'action décrit jusqu'à présent pour les CED. Il est maintenant clair qu'ils peuvent également agir en recrutant des coactivateurs ou des corepresseurs dans des voies enzymatiques ou en modifiant des marqueurs épigénétiques déréglementant l'expression génique10,11,12,13 ,14, avec des conséquences non seulement pour la génération actuelle, mais aussi pour la santé des générations à venir8.

Hormones drosophiles

Les effets potentiels de certains CED ont été largement étudiés, tant chez les espèces sauvages que dans plusieurs systèmes modèles où les mécanismes endocriniens sont raisonnablement bien connus. Pour les invertébrés, les systèmes endocriniens qui influencent la croissance, le développement et la reproduction ont été largement caractérisés chez les insectes pour plusieurs raisons, impliquant leur utilisation étendue dans le domaine de la recherche biologique, leur importance économique, et enfin le développement d'insecticides capables d'interférer spécifiquement avec le système hormonal des insectes nuisibles.

En particulier, chez les insectes, la mouche des fruits D. melanogaster s'est avérée être un système modèle très puissant pour évaluer les effets endocriniens potentiels des SEE. Dans D. melanogaster, ainsi que chez les vertébrés, les hormones jouent un rôle important tout au long du cycle de vie. Dans cet organisme, il ya trois principaux systèmes hormonaux, qui impliquent l'hormone stéroïde 20-hydroxyecdysone (20E)15,16, l'hormone juvénile sesquiterpenoid (JH)17, et les neuropeptides et peptide / protéines hormones18. Ce troisième groupe se compose de plusieurs peptides découverts plus récemment mais clairement impliqués dans une grande variété de processus physiologiques et comportementaux, tels que la longévité, l'homéostasie, le métabolisme, la reproduction, la mémoire et le contrôle locomoteur. 20E est homologue aux hormones stéroïdes cholestérol-dérivées telles que l'estradiol, alors que JH partage quelques similitudes avec l'acide rétinoïque ; les deux sont les hormones les plus connues dans Drosophila19,20. Leur équilibre est essentiel dans la coordination de la mue et de la métamorphose, ainsi que dans le contrôle de plusieurs processus post-développementaux, tels que la reproduction, la durée de vie et le comportement21, offrant ainsi différentes possibilités pour tester le système endocrinien perturbation dans Drosophila. En outre, les hormones ecdysteroid et les JHsont les principales cibles des insecticides dits de troisième génération, développés pour interférer avec les processus développementaux et reproducteurs médiés par le système endocrinien chez les insectes. Le mode d'action agoniste ou antagoniste de ces produits chimiques est bien connu, et donc ils peuvent servir de normes de référence pour évaluer les effets des EDC potentiels sur la croissance, la reproduction et le développement des insectes22. Par exemple, la métahoprène, qui a été largement utilisée dans la lutte contre les moustiques et autres insectes aquatiques23,24, agit comme agoniste JH et réprime la transcription des gènes induite par 20E et la métamorphose.

En plus des hormones, la superfamille des récepteurs nucléaires (NR) dans Drosophila est également bien connue; il se compose de 18 facteurs de transcription évolutivement conservés impliqués dans le contrôle des voies de développement hormonales dépendantes, ainsi que la reproduction et la physiologie25. Ces NR d'hormone appartiennent à chacun des six sous-types de superfamille de NR, y compris ceux impliqués dans la neurotransmission26, deux pour l'acide rétinoïque NRs, et ceux pour les NRs stéroïdes qui, dans les vertébrés, représentent l'une des cibles primaires des EDCs27.

La drosophile comme système modèle d'étude des DEC

Actuellement, sur la base de propriétés moléculaires, plusieurs agences environnementales à travers le monde attribuent le potentiel d'interférer avec les systèmes endocriniens à différents produits chimiques d'origine humaine. Étant donné que les SEE constituent un problème mondial et omniprésent pour l'environnement et les organismes, l'objectif global de la recherche dans ce domaine est de réduire leur fardeau de morbidité et de protéger les organismes vivants contre leurs effets néfastes. Afin d'approfondir la compréhension des effets endocriniens potentiels d'un produit chimique, il est nécessaire de le tester in vivo. À cette fin, D. melanogaster représente un système de modèle valide. À ce jour, la mouche des fruits a été largement utilisée comme modèle in vivo pour évaluer les effets de plusieurs SEE environnementales; il a été signalé que l'exposition à plusieurs EDC, tels que le phtalate de dibutyle (DBP)28, bisphénol A (BPA), 4-nonylphénol (4-NP), 4-tert-octylphénol (4-tert-OP)29, methylparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31, 32, bis-(2-éthylhexyl) phtalate (DEHP)33, et 17-ethinylestradiol (EE2)34, influence le métabolisme et les fonctions endocriniennes comme dans les modèles vertébrés. Plusieurs raisons ont conduit à son utilisation comme modèle dans ce domaine de recherche. Au-delà d'une excellente connaissance de ses systèmes endocriniens, d'autres avantages incluent son cycle de vie court, son faible coût, son génome facilement manipulable, une longue histoire de recherche et plusieurs possibilités techniques (voir le site Web flyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster fournit également un modèle puissant pour étudier facilement les effets transgénérationnels et les réponses des populations aux facteurs environnementaux8 et évite les questions éthiques pertinentes pour les études in vivo chez les animaux plus élevés. En outre, la mouche des fruits partage un degré élevé de conservation des gènes avec les humains, ce qui pourrait permettre à Drosophila EDC d'essayer de prédire ou de suggérer les effets potentiels de ces produits chimiques pour la santé humaine. En plus d'élargir la compréhension des effets sur la santé humaine, Drosophila peut aider à évaluer les risques d'exposition d'EDC à l'environnement, tels que la perte de biodiversité et la dégradation de l'environnement. Enfin, la mouche des fruits offre l'avantage supplémentaire d'être utilisée dans les laboratoires, où les facteurs susceptibles d'affecter son développement, sa reproduction et sa durée de vie peuvent être maîtrisés afin d'attribuer toute variation à la substance à tester.

Dans cet esprit, nous avons optimisé des tests de condition physique simples et robustes pour déterminer les effets d'EDC sur certains traits hormonaux Drosophila, tels que la fécondité/fertilité, le moment du développement et la durée de vie adulte. Ces essais ont été largement utilisés pour certains EDCs23,24,25,26,27. En particulier, nous avons utilisé les protocoles suivants pour évaluer les effets de l'exposition à l'oestrogène synthétique EE234 et au BPA et au bisphénol AF (BPA F) (données non publiées). Ces protocoles peuvent être facilement modifiés pour étudier les effets d'un EDC donné à la fois, ainsi que les effets combinés de plusieurs EDC dans D. melanogaster.

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Protocole

1. Préparation des aliments

  1. Pour l'entretien des stocks et pour la croissance larvaire, utilisez un milieu de semoule de maïs contenant 3 % de levure en poudre, 10 % de saccharose, 9 % de semoule de maïs précuite, 0,4 % d'agar, par la suite appelé maïs moyen (CM).
    1. Mettre 30 g de levure dans 100 ml d'eau du robinet, porter à ébullition et laisser bouillir pendant 15 min.
    2. Séparément, bien mélanger 90 g de semoule de maïs précuite, 100 g de sucre et 4 g d'agar dans 900 ml d'eau du robinet.
    3. Porter la solution à ébullition, baisser le feu et cuire 5 minutes en remuant continuellement.
    4. Après 5 minutes, ajouter la solution de levure chaude et laisser mijoter encore 15 minutes.
    5. Éteignez la source de chaleur et laissez la solution refroidir à environ 60 oC.
    6. Ajouter 5 mL/L de 10 % de méthyle 4-hydroxybenzoate dans l'éthanol, bien mélanger et laisser s'asseoir pendant 10 min.
      REMARQUE: Soyez prudent avec la quantité de méthyle 4-hydroxybenzoate, étant donné qu'une forte concentration de fongicide pourrait être mortelle pour les larves.
    7. Distribuer le milieu en flacons/bouteilles : 8 ml dans chaque flacon de mouche (25 mm x 95 mm), 3 ml dans chaque flacon de mouche (22 mm x 63 mm) et 60 ml dans chaque bouteille de mouche (250 ml).
    8. Couvrir les flacons de toile à fromage et les laisser sécher à température ambiante (RT) pendant 24 h avant le stockage.
    9. Calibrer expérimentalement la consistance et l'hydratation du CM en modifiant soit la quantité d'agar utilisée et/ou les temps de refroidissement/séchage.
      Remarque : les flacons débranchés, en boîte et enveloppés sont stables pendant environ 15 jours à 4 oC.
  2. Pour les adultes Drosophila, utilisez un milieu contenant 10% de levure en poudre, 10% de saccharose, 2% d'agar, par la suite appelé milieu adulte (AM).
    1. Mélanger 10 g de levure en poudre, 10 g de saccharose, 2 g d'agar dans 100 ml d'eau distillée.
    2. Porter ce mélange à ébullition deux fois, avec un intervalle de 3 minutes, ou jusqu'à ce que l'agar soit dissous, à l'aide d'un four à micro-ondes.
    3. Une fois que la solution refroidit à 60 oC, ajouter 5 mL/L de 10 % de méthyle 4-hydroxybenzoate dans l'éthanol, bien mélanger et distribuer dans des flacons (10 ml par flacon).
    4. Couvrir les flacons de toile à fromage et les laisser sécher à RT pendant 24 h avant de les ranger.
      REMARQUE : les flacons débranchés, en boîte et enveloppés sont stables pendant environ 15 jours à 4 oC.
  3. Pour l'évaluation de la fécondité et de la fertilité, utilisez le milieu de jus de tomate-maïs Drosophila.
    1. Verser 70 ml de semoule de maïs chaude dans un bécher de 100 ml et ajouter 30 ml de jus de tomate (30 % v/v).
    2. Bien mélanger avec un robot culinaire et une pipet de 3 ml dans de petites fioles.
    3. Couvrir les flacons de toile à fromage et les laisser sécher à RT pendant 24 h avant le stockage.
      REMARQUE : les flacons débranchés, en boîte et enveloppés sont stables pendant environ 15 jours à 4 oC.
  4. Pour la collecte d'embryons, utiliser des plaques d'agar, contenant 3 % d'agar, 30 % de sauce tomate et 3 % de sucre.
    REMARQUE: veillez à ne pas faire de bulles lors de la coulée du milieu dans les assiettes.

2. Dosing Drosophila EDC

  1. Préparer une solution de stock appropriée pour dissoudre l'EDC sélectionnée dans le solvant approprié. Pour l'EE2 (poids moléculaire 296.403), dissoudre 1,48 g dans 10 ml d'éthanol 100% pour faire une solution de stock de 0,5 M et stocker à -80 oC.
    MISE EN GARDE: Les SEE sont considérés comme des polluants environnementaux et des précautions doivent être prises pour les manipuler.
  2. Diluer la solution de stock EE2 dans 10% d'éthanol dans l'eau (v/v) afin d'obtenir une solution de 100 mM. Faire les dilutions suivantes (0,1 mM, 0,5 mm et 1 mm) dans les aliments CM, en commençant par la plus faible concentration et en utilisant la même concentration finale de solvant pour chaque groupe de traitement. Pour les flacons de commande utiliser le même volume du solvant seul.
    Remarque : il est recommandé de maintenir la concentration finale du solvant aussi bas que possible, en gardant à l'esprit que la concentration finale d'éthanol ne doit pas dépasser 2 % dans les aliments à la mouche.
  3. Ajouter la solution contenant la bonne dilution de l'EDC sélectionné à l'aliment à base de semoule de maïs avant la solidification, bien mélanger avec un robot culinaire, distribuer 10 ml en flacons, couvrir de gaze de coton et laisser sécher à RT pendant 16 h avant de l'utiliser.
    REMARQUE : utilisez ce support immédiatement après sa préparation.
  4. Pour l'élevage adulte, préparer différentes solutions EE2 de travail (10 mM, 50 mm et 100 mM, respectivement) dans 10 % d'éthanol dans l'eau (v/v) et une couche de 100 l de chacune sur la surface de l'AM, afin d'obtenir la concentration souhaitée de l'EE2 (0,1 mM) , 0,5 mM et 1 mm). Pour l'utilisation de commande même volume du solvant seul.
    REMARQUE : Ajoutez également la solution contenant la bonne dilution de l'EDC sélectionnée à une petite quantité d'AM dans un tube conique de 50 ml, vortex ezinez complètement et stratiez 1 ml de celui-ci sur la surface des flacons AM.
    1. Couvrir les flacons de gaze de coton, laisser sécher à RT pendant 12-16 h sous une douce agitation et les utiliser immédiatement.
      REMARQUE : le processus de séchage doit être ajusté expérimentalement parce qu'il dépend de l'humidité ambiante.
  5. Pour l'alimentation, ajouter à la fois la solution contenant la bonne dilution de l'EDC sélectionnée (EE2 0,1 mM, 0,5 mm et 1 mm) et un colorant (p. ex., le colorant rouge no 40 à 1 mg/mL)35 au CM avant la solidification, mélanger fortement avec un robot culinaire, puis se départir e en flacons.

3. L'élevage des mouches

  1. Utilisez une souche isogénique robuste, comme l'Oregon R, maintenue par plusieurs générations en laboratoire.
  2. Gardez les mouches dans un incubateur humidifié à température contrôlée, avec une lumière naturelle de 12 h : 12 h photopériode foncée à 25 oC dans des flacons contenant de la nourriture CM.
  3. Dans chaque jeu d'enfant, utilisez des flacons à RT.

4. Nourrir l'assay

REMARQUE: Cet essai est recommandé pour vérifier si la présence de la SEE sélectionnée dans le milieu pourrait affecter l'alimentation des mouches.

  1. Mettez 15 jeunes mouches dans des flacons contenant cm complété avec différentes concentrations de l'EDC sélectionné et un aliment colorant. Laissez les mouches se nourrir sur les médias pendant 1 jour.
    REMARQUE :par exemple, utilisez un colorant rouge no 4035 (1 mg/mL).
  2. Mettez 15 jeunes mouches dans des flacons contenant CM complété avec le solvant seul et un colorant alimentaire pour le contrôle. Laissez les mouches se nourrir sur les médias pendant 1 jour.
  3. Anesthésiez individuellement chaque groupe de mouches à l'éther.
    1. Transférer les mouches de chaque groupe dans un récipient en verre cylindrique (éherisateur) avec un entonnoir inséré dans l'extrémité ouverte, inverser le flacon sur l'entonnoir et en tapant doucement les deux récipients ensemble pour faire tomber les mouches dans l'étheriseur.
      REMARQUE:  L'entonnoir les empêchera de sortir de l'étherisateur.
    2. Knock vole vers le bas en tapant doucement l'éthéisseur sur une surface molle, comme un tapis de souris, et remplacez rapidement l'entonnoir par un coton imbibé d'éther et bouchon de gaze.
    3. Attendez environ 1 min jusqu'à ce que les mouches tombent au fond et cessent de bouger.
      REMARQUE : ne dépassez pas le temps ou les mouches mourront.
  4. Placez les mouches immobilisées sous un microscope stéréo et comparez la coloration abdominale de chaque groupe de traitement par rapport au groupe témoin.

5. Défaut de travail/Test de fertilité

  1. Pour chaque concentration d'EDC, préparez 3 flacons de mouches, appelés flacons parentaux par la suite, avec 8 femelles et 4 mâles dans des aliments CM/EDC de 10 mL; pour le contrôle préparer 6 flacons de mouches avec 8 femelles et 4 mâles dans 10 mL CM aliments complétés avec solvant. L'arrière vole dans un incubateur à 25 oC.
    REMARQUE : évitez la surpopulation des larves pendant leur développement et essayez d'utiliser des densités larvaires constantes entre les traitements.
  2. Après 4 jours, retirez les parents et retournez les flacons dans l'incubateur pendant 5 jours de plus.
  3. En fin d'après-midi 9, retirer toutes les mouches nouvellement des flacons et mettre les flacons dans un incubateur à 18 oC pendant la nuit.
    REMARQUE: Cette suppression doit être faite très soigneusement, en vérifiant la surface du puits moyen.
    1. Le matin du jour 10, pour chaque groupe de traitement, recueillir les femelles vierges et les jeunes mâles en deux groupes, sous anesthésie légère co 2. Subdiviser au hasard chaque groupe de mouches en petits sous-groupes (10 femelles et 20 mâles par flacon) en flacons indépendants remplis de CM correspondant frais.
      1. Répétez l'étape 5.3.1 en prenant soin à la fois d'enlever soigneusement toutes les mouches des flacons 8-10 h avant la collecte et laisser les flacons à 18 oC, jusqu'à obtenir au moins 30 femelles vierges et 30 mâles pour chaque concentrations edC et au moins 90 femelles vierges et 90 mâles pour le contrôle.
    2. Loger ces groupes de mouches à 25 oC jusqu'à ce qu'ils soient âgés de 4 jours après l'éclosion, en les transférant dans de nouvelles flacons contenant un milieu correspondant frais tous les deux jours.
      Note: 4 jours est suffisant pour que les mouches deviennent des adultes matures, mais il est très loin du début de la sénescence.
    3. Après deux jours, assurez-vous qu'il n'y a pas de larves dans les flacons des femelles. Si c'est le cas, les mouches ne sont pas utilisables parce qu'elles ne sont pas vierges et doivent être jetées.
  4. Utilisez 20 mouches simples de chaque sexe pour chaque groupe de traitement pour mettre en place 20 croisements simples en petites fioles contenant du milieu cm-tomate frais sans EDC, comme décrit ci-dessous.
    1. À chaque groupe de traitement, attribuer une série différente de nombres séquentiels, qui l'identifie de façon unique et étiquette les flacons respectifs; p. ex., groupe1 (solvant seul) de 1 à 20, groupe 2 (concentration d'EDC x) de 20 à 40, et ainsi de suite.
    2. Faire une feuille de calcul de fertilité pour enregistrer les différentes séries, chacune correspondant à un groupe de traitement.
    3. Pour chaque sexe anesthésiez toutes les mouches appartenant à chaque groupe de traitement sous la lumière CO2 et les transférer au hasard comme suit.
      1. Transférer une femelle traitée par solvant dans une petite fiole contenant du milieu frais de CM-tomate sans EDC et ajouter un mâle traité par solvant pour la croix témoin.
        Remarque : le jus de tomate doit être ajouté au milieu pendant sa préparation parce que le milieu foncé augmente le contraste avec les embryons blancs.
      2. Transférer une femelle traitée par EDC dans une petite fiole contenant de la tomate CM fraîche sans EDC et ajouter un mâle traité par solvant pour chaque traitement.
      3. Transférer un mâle traité par EDC dans un petit flacon contenant du milieu frais de CM-tomate sans EDC et ajouter une femelle traitée par solvant pour chaque traitement.
    4. Abritez toutes ces croix simples à 25oC.
  5. Transférer chaque paire d'accouplement dans des flacons de CM-tomates fraîches sans EDC tous les jours pendant les dix jours suivants. Étiqueter les flacons répliqués de chaque série de façon séquentielle; p. ex. 1-a, 1b, 1c...... 20a, 20b, 20c et rapportez ces nombres sur la feuille de calcul de fertilité.
  6. Inspectez visuellement chaque flacon chaque jour pour les œufs et rapportez leur numéro sur la feuille de calcul de fertilité.
  7. Enregistrez chaque flacon et, lorsque de nouvelles mouches commencent à émerger, enregistrez également le nombre quotidien de descendants adultes au cours de la période de 10 jours. Après 10 jours à partir de l'accouplement initial, retirez les parents.
    REMARQUE : jetez la fiole dans laquelle l'un ou les deux parents sont morts; en cas d'évasion de l'un ou des deux parents, inclure dans l'analyse toutes les données jusqu'au jour où ils ont été perdus.
  8. Sommez le nombre quotidien d'œufs et le nombre quotidien de descendants adultes de chaque groupe de traitement, pour obtenir la fécondité/fertilité totale, la production moyenne d'ovules et de descendants adultes par une mouche pendant dix jours, et le rapport entre la descendance totale et le nombre total d'œufs pondus. Calculer les différences en pourcentage de chaque valeur de traitement par rapport au contrôle.
  9. Effectuez trois expériences indépendantes pour chaque groupe de mouches, en utilisant un minimum de 10 mouches pour chaque groupe de traitement.
  10. Effectuer une analyse statistique pour comparer les différents groupes.

6. Calendrier de développement

REMARQUE: Dans les deux protocoles alternatifs suivants, le moment du développement est évalué en comptant à la fois le nombre de pupas souper qui se forment par jour et le nombre de descendants adultes qui s'élit par jour.

  1. Protocole d'eclosion 1
    1. Pour chaque groupe de traitement, mettre en place 10 flacons de jeunes (2 jours), des mouches en bonne santé, chacune avec 6 femelles et 3 mâles dans des aliments de 10 ml de semoule de maïs sans EDC.
    2. Laissez les mouches sur la nourriture pendant 24 h, et laissez-les s'accoupler.
    3. Préparer 10 flacons parallèles par groupe de traitement avec 10 ml chacun d'aliments frais de semoule de maïs complétés par différentes concentrations d'EDC ou le solvant seul pour le contrôle. Transfert des mouches accouplées à ces nouvelles fioles.
      REMARQUE : pour chaque groupe de traitement, assignez une série différente de nombres séquentiels, qui l'identifie de façon unique et étiquete les flacons respectifs.
    4. Faites une feuille de calcul de développement pour enregistrer les différentes séries.
    5. Laisser les mouches pondre pendant 16 h. Ensuite, retirez les parents des flacons.
      REMARQUE: Les mouches parentes peuvent être utilisées pour répéter l'étape 6.1.5, en les transférant à d'autres flacons correspondants.
    6. Incuber les flacons pendant 3-4 jours à 25 oC, ou jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de forme de chiots. Chaque jour, comptez le nombre de jeunes chiots dans chaque flacon et signalez-le sur la feuille de calcul du développement. Pour éviter de compter deux fois la même chiot, écrivez un numéro en séquence à chaque chiot avec un marqueur permanent à l'extérieur de la fiole.
    7. À partir du jour 9, comptez quotidiennement le nombre d'adultes émergents jusqu'à ce qu'aucun adulte n'émerge plus, et signalez-le sur la feuille de calcul du développement.
    8. À partir de ces données brutes, calculez la période larvaire moyenne, la période pupale moyenne, ainsi que les différences en pourcentage de chaque traitement par rapport au contrôle.
    9. Effectuez trois expériences indépendantes pour chaque groupe de mouches, en utilisant un minimum de 5 flacons pour chaque groupe de traitement.
    10. Effectuer une analyse statistique pour comparer les différents groupes.
  2. Protocole d'eclosion d'assay 2
    1. Les femelles jeunes et en bonne santé (environ 150) et mâle (environ 50) vole sur une cage de collecte (Tableau des matériaux) avec le milieu d'agar-tomate complété avec la pâte fraîche de levure de boulanger (3 g de levure de boulanger dans 5 ml d'eau), par la suite appelé plateau de pose, pendant 2 jours à 25 oC.
    2. Pendant ces 2 jours, permettre aux mouches de s'acclimater à la cage dans un endroit sombre et calme, avant de commencer la collecte des œufs, et changer le plateau de ponte deux fois par jour.
    3. Le troisième jour, changer le plateau de pose tôt le matin. Après 1 h, remplacer le plateau de ponte, en jetant ces œufs pondus.
    4. Laisser les mouches pondre pendant 2 h et remplacer par un plateau de ponte frais.
      REMARQUE: Au jour 3, un bon plateau de ponte devrait produire 100-200 œufs en 2 h.
    5. Pour chaque groupe de traitement, préparez une série de trois plats de 60 mm contenant des aliments de semoule de maïs tomate complétés par la concentration correspondante d'EDC ou avec du solvant seul et rapportez chaque série dans la feuille de calcul du calendrier de développement. Alternativement, si vous préférez, utilisez des flacons au lieu de plats.
    6. Ramassez délicatement les œufs au microscope à l'aide d'un pinceau ou d'une sonde et transférez-les vers le haut du milieu dans chaque plat/flacon. Afin de faciliter le comptage, sur le plateau de ponte, disposer les œufs en 5 groupes de 10 chacun et les transférer un à la fois.
      REMARQUE: Répétez l'étape 6.2.4 autant de fois que nécessaire pour obtenir suffisamment d'embryons.
    7. Loger tous ces plats/flacons à 25 oC. Entreposez également chaque plateau de pontàe à 25 oC et comptez le nombre total d'œufs pondus.
    8. Après 24-30 h, vérifiez chaque plat/vial sous un stéréomicroscope et comptez à la fois le nombre d'œufs blancs non fécondés et le nombre d'embryons morts foncés.
    9. Soustrayez le nombre d'œufs blancs non fécondés de la valeur des 50 œufs transférés afin d'obtenir la valeur « embryons totales » par plat/vial. Le nombre d'embryons morts foncés peut être utilisé pour déterminer les effets toxiques potentiels d'EDC pendant l'embryogenèse.
    10. Répéter les étapes 6.1.6-6.1.10 du Protocole d'eclosion 1.

7. Protocole sur la durée de vie

  1. Mettre en place 20 flacons de mouches avec 8 femelles et 4 mâles et loger à 25 oC en CM (10 ml chacun).
  2. Après 4 jours, jetez les mouches et placez les flacons dans l'incubateur.
    REMARQUE : ces mouches peuvent être utilisées pour recommencer à obtenir d'autres cohortes synchronisées selon l'âge des mouches.
  3. En fin d'après-midi du jour 9, retirez toutes les mouches nouvellement des flacons et retournez les flacons à l'incubateur.
    Remarque : quelques adultes devraient commencer à se refermer dès le neuvième jour; jeter ces mouches permet de recueillir un nombre maximum de mouches synchronisées, en évitant la sélection négligente de l'émergence précoce.
  4. 16-24 h plus tard, transférer les mouches adultes (1 jour) des deux sexes en quatre groupes de bouteilles de 250 ml contenant des aliments AM complétés par trois concentrations différentes d'EDC et un avec le solvant seul. Si nécessaire, collectez un autre lot le lendemain.
  5. Maintenir les mouches à 25 oC pendant 2 à 3 jours pour leur permettre de s'accoupler.
    REMARQUE : le jour du transfert aux flacons de nourriture AM correspond au premier jour de l'âge adulte.
  6. Après deux-trois jours, trier chaque cohorte de mouches par sexe en deux groupes sous anesthésie légère de CO 2. Subdiviser aléatoirement chaque sexe en cinq flacons par traitement à une densité de 20 individus par flacon, jusqu'à ce qu'il y ait trois répliques de 5 flacons parallèles pour chaque sexe par traitement.
    REMARQUE: Travailler avec de petits groupes de mouches afin d'éviter d'éventuels problèmes de santé durables en raison du temps d'exposition long au CO2.
  7. Préparer une feuille de calcul de durée de vie dans laquelle le nombre de mouches mortes est soustrait du nombre de mouches survivantes au transfert précédent, de manière à obtenir automatiquement le nombre de survivants à chaque transfert.
  8. Transférer les mouches dans de nouvelles fioles contenant la nourriture correspondante tous les 3 jours en même temps et vérifier la mort.
    REMARQUE: le transfert doit avoir lieu sans anesthésie qui pourrait avoir un effet négatif à long terme sur la longévité de la mouche.
    1. À chaque transfert, enregistrez l'âge des mouches et le nombre de mouches mortes.
      REMARQUE : le nombre de mouches survivantes est automatiquement calculé dans la feuille de calcul, mais il est recommandé de le vérifier visuellement. Les mouches qui s'échappent accidentellement ou meurent pendant le transfert ne doivent pas être prises en considération. Veillez à ne pas compter deux mouches mortes transportées au nouveau flacon signalant cette note dans la feuille de calcul.
    2. Répétez les étapes 7.8 et 7.8.1 jusqu'à ce que toutes les mouches meurent.
  9. Pour chaque groupe de traitement, créez une courbe de survie comme le montre la figure6, afin d'afficher la probabilité de survie d'une mouche à un moment donné.
  10. Effectuez trois expériences indépendantes pour chaque groupe de mouches de traitement, en utilisant 100 mouches nouvellement fermées pour chaque expérience.
  11. Préparer un tableau dans lequel déclarer la durée de vie moyenne (jours de survie moyen de toutes les mouches pour chaque groupe), la demi-temps de la mort (période de temps en jours nécessaire pour atteindre 50% de mortalité) et la durée de vie maximale (quantité maximale de jours nécessaires pour atteindre 90% de mortalité).
  12. Calculer les différences de pourcentage entre chaque groupe de traitement par rapport au groupe témoin.
  13. Effectuer une analyse statistique pour comparer les différents groupes de traitement.

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Résultats

Dans cette section, les étapes clés des protocoles ci-dessus sont signalées sous la forme de schémas simplifiés. Étant donné que les mouches ont tendance à éviter les composés désagréables, la première chose à faire est d'essayer le goût de la EDC sélectionnée. Cela peut être fait en mélangeant un colorant alimentaire (par exemple, colorant alimentaire rouge no 40)35 avec l'aliment complété avec l'EDC sélectionné à diverses doses ou avec le solvant seul. Les mouches nourries sur ces supports sont ...

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Discussion

La mouche des fruits D. melanogaster a été largement utilisé comme un système de modèle in vivo pour étudier les effets potentiels des EDC environnementales telles que DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33, et EE234. Plusieurs raisons ont conduit son utilisation comme modèle dans ce domaine de recherche. Outre ses avant...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs remercient Orsolina Petillo pour son soutien technique. Les auteurs remercient le Dr Mariarosaria Aletta (CNR) pour son soutien bibliographique. Les auteurs remercient le Dr Gustavo Damiano Mita de les avoir introduits dans le monde d'EDC. Les auteurs remercient Leica Microsystems et Pasquale Romano pour leur aide. Cette recherche a été appuyée par le projet PON03PE-00110-1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Projet PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
17&alpha ;-ÉthinylestradiolSigmaE4876-1G
Gélose pour Drosophila moyenneBIOSIGMA789148
Bisphénol ASigma239658-50G
Bisphénol AFSigma90477-100MG
Semoule de maïsCA' BIANCA
Éther diéthyliqueSigma
Flacons de drosophileBIOSIGMA78900825 mm x 95 mm
Flacons de drosophileBIOSIGMA78900929 mm x 95 mm
Flacons de drosophileKaltek18722 mm x 63 mm
Cage de collecte d’embryonsCraftsCylindre en plexiglas (12,5 mm x7 cm) avec une extrémité ouverte et l’autre extrémité fermée par une base rectangulaire dans laquelle une fente permet l’insertion de plateaux spéciaux pour la pose
d’éthanolFLUKA2860
EtherizerCraftsrécipient cylindrique en verre avec un bouchon en coton
Bouteille en verre Bouteillesde 250 mL
Flacons en verreMicrotechST 10024Tube à fond plat 100 x 24
Mixeur plongeant Robot culinaire PimmyAriete
Instant Levure SuccessESKALevure en poudre
Plateau de posePlateaux enplexiglas (11 cm x 2,6 cm) dans lesquels verser
Methyl4-hydroxybenzoateSIGMAH5501
Boîte de PétriFalcon35101660x5
Colorant rouge n° 40SIGMA16035
Stéréomicroscope avec lumières LEDLeicaS4E
SucroseHIMEDIAMB025
Sauce tomateCirio
le milieu pour la pose

Références

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