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Article de méthode

Un modèle in vivo de souris d'insuffisance d'oestrogène pour le criblage des traitements exogènes exogènes de la dysfonction cardio-vasculaire après ménopause

12K vues

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DOI :

10.3791/59536

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13 août 2019

 ,  , 
1Institute of Medicinal Plant Development (IMPLAD), Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Shandong University of Traditional Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

Cliniquement, l'insuffisance d'oestrogène dans les femmes ménopausiques peut aggraver l'incidence de la perturbation de lipide et de l'athérosclérose. Nous avons établi un modèle in vivo d'insuffisance d'oestrogène par ovariectomy bilatéral par l'intermédiaire d'une double incision dorsal-latérale dans apoE-/- souris. Le modèle de souris est applicable pour le dépistage des traitements exogènes exogènes de dysfonctionnement cardio-vasculaire après la ménopause.

Résumé

Les femmes ménopausées sont plus à risque de développer des maladies cardiovasculaires que les femmes préménopausées. Les souris femelles ovariectomized (OVX) à l'affichage de soudure ont augmenté des lésions athérosclérotiques dans l'aorte comparées aux souris femelles avec la fonction ovarienne intacte. Cependant, les modèles de laboratoire impliquant des souris oestrogène-déficientes avec l'état athérosclérose-enclin font défaut. Ce déficit est crucial parce que l'insuffisance clinique d'oestrogène dans les femmes ménopausées peut aggraver l'incidence de la perturbation préexistante ou continue de lipide et de l'athérosclérose. Dans cette étude, nous établissons un modèle in vivo de souris oestrogène-déficient par ovariectomy bilatéral par l'intermédiaire d'une double incision dorsal-latérale dans l'apolipoprotein E (apoE)-/- souris. Nous comparons ensuite les effets de la propagation de la tartine de noisette et de la pseudoprotodioscine (PPD) (un phytoestrogène) administrés peroraux par tartinade aux noisettes. Nous constatons que bien que PPD exerce un certain effet sur la réduction du poids corporel final et du plasma TG chez les souris OVX apoE-/- il a des capacités anti-atherosclérotiques et cardiaques-protectrices comparables à son homologue de 17 ans et plus. PPD est un phytoestrogène qui a été rapporté pour exercer des propriétés anti-tumorales. Ainsi, la méthode proposée est applicable pour le dépistage des phytoestrogènes par l'administration perorale pour remplacer l'hormonothérapie substitutive traditionnelle chez les femmes ménopausées, qui a été rapportée pour avoir potentiellement délétère tumorigenetic capacité. L'administration perorale par l'intermédiaire de la propagation de noisette est non envahissante, la rendant largement applicable à beaucoup de patients. Cet article contient des démonstrations étape par étape de l'ovariectomy bilatéral par l'intermédiaire de l'incision dorsal-latérale double dans apoE-/- souris et peroral 17-estradiol ou remplacement d'hormone de phytoestrogen par la propagation de noisette. Les analyses de lipide et de fonction cardio-vasculaire de plasma utilisant l'échocardiographie suivent.

Introduction

Des études épidémiologiques et cliniques ont montré que les femmes ménopausées sont considérablement plus à risque de maladie cardiovasculaire que les femmes préménopausées1,2. L'hormonothérapie substitutive (THS) peut réduire le risque relatif de maladie cardiovasculaire à 0,37-0,793. Parmi d'autres complications, l'athérosclérose causée par les maladies cardiovasculaires est la principale cause de décès dans le monde4. Cependant, les modèles de laboratoire impliquant des souris oestrogène-déficientes présentant le statut enclin d'athérosclérose manquent. Ce protocole fournit un modèle in vivo de souris d'insuffisance d'oestrogène pour le criblage des traitements exogènes d'oestrogène de la dysfonction cardio-vasculaire après ménopause.

Des études antérieures montrent que l'application d'OVX chez les rongeurs athérosclérotiques nourris avec un régime riche en cholestérol peut imiter les femmes ménopausées souffrant d'athérosclérose5,6,7,8. Un modèle animal reproductible et commode ressemblant à l'état athérosclérotique dans les femmes ménopausées est la base de la recherche exogène d'oestrogène. Ici, une double incision dorsal-latérale de l'ovariectomy bilatéral a été appliquée dans l'athérosclérose-encline E knock-out (apoE-/-) souris9,10. Comparé e à l'incision abdominale moyenne ou dorsal, l'incision double dorsal-latérale est une méthode plus facile et moins longue qui peut éviter l'adhérence et l'inflammation abdominales graves de cavité. L'administration perorale par propagation de noisette (voir tableau des matériaux) est non invasive et pratique, la rendant largement applicable en tant que mode d'administration à long terme11. L'implantation de granulés à libération lente est également populaire6. Cependant, les implants peuvent aggraver l'incidence de l'infection en particulier chez les souris soumises à OVX. D'autres modes d'administration non invasifs, tels que le gavage oral et l'administration de l'eau, ont également de nombreux inconvénients. Le gavage oral stresse généralement les souris et peut causer des lésions oesophagiennes. L'administration de l'hormone par l'intermédiaire de l'eau potable est très bénéfique; cependant, l'ajout de DMSO comme émulsifiant est inévitable car les oestrogènes exogènes sont insolubles dans l'eau. Ici, nous avons choisi le remplacement peroral d'hormone de 17 ou de phytoestrogen par l'écart de noisette pour l'administration à long terme.

Récemment, l'effet bénéfique de HRT sur le système cardio-vasculaire des femmes postmenopausal a été contesté dans les essais d'initiative de santé des femmes (WHI)12. D'une part, l'oestrogène exogène seul exerce un effet bénéfique sur le système cardio-vasculaire ; d'autre part, il peut combiner avec l'acétate de metohydroxyprogestérone pour augmenter le risque d'événements cardio-vasculaires. Plus sérieusement, HRT peut mener à la progression de tumeur de sein et utérin, et cet effet a nettement limité son utilisation13,14. Plus d'intérêt a été porté sur les effets cardio-protecteurs des oestrogènes exogènes manquant d'activité mitotique dans les cellules tumorales15,16,17. De multiples études chez l'homme et les animaux suggèrent que les phytoestrogènes avec des structures similaires à celle des oestrogènes peuvent jouer un rôle bénéfique dans la protection cardiovasculaire15,18.

Ainsi, les buts du travail actuel sont (i) de construire un modèle in vivo de souris d'insuffisance d'oestrogène par ovaricectomie bilatérale par l'intermédiaire d'une incision dorsal-latérale double dans apoE-/- souris et (ii) pour comparer les effets protecteurs cardio-vasculaires de perorally administré 17'-estradiol et pseudoprotodioscine (PPD), par l'intermédiaire de la propagation de noisette. 17-estradiol est un genre d'oestrogène exogène qui appartient aux hormones sexuelles féminines6,11,19. PPD, une saponine stéroïde et phytoestrogène des usines de Dioscorea, a été précédemment rapporté pour exercer des propriétés anti-tumorales20.

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Protocole

Tous les protocoles de soins aux animaux et d'expérimentation ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Académie chinoise des sciences médicales et du Peking Union Medical College (Permission No.: SYXK (Beijing) 2013-0023). L'origine de apoE-/- souris est C57BL/6J9,10.

1. Ovariectomy bilatéral par l'intermédiaire d'une incision dorsal-latérale double dans l'apoE-/- Souris

  1. Au sœur (âge 28 jours), anesthésier l'apoE femelle-/- souris C57BL/6J avec avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg ; intraperitoneally).
    REMARQUE : 32 apoE-/- les souris ont été aléatoirement divisées en 4 groupes : SHAM, OVX, OVX/E2, et OVX/PPD (n - 8 par groupe).
  2. Placez l'animal en position couchée sur un coussin chauffant. Appliquer le lubrifiant pour les yeux pour la protection oculaire pendant l'anesthésie.
  3. Maintenir la température corporelle dans un rayon de 36 à 0,5 oC. Administrer le poids corporel de 5 mg/kg du carprofène analgésique sous-cutané à l'aspect latéral du cou de la souris.
  4. Raser une zone de souris de 3 x 5 cm2 céphalique de la crête iliaque. Avant de recouvrir l'animal d'une feuille chirurgicale d'ouverture de 3 x 5 cm 2, nettoyez soigneusement la zone rasée avec de l'iode, puis 70 % de l'éthanol. Utilisez des instruments et des gants stériles pendant l'expérience.
  5. Utilisez des ciseaux et des forceps pour faire une incision latérale de 1 cm à la ligne médiane et de 1 cm latérale mentaux aux côtes costales.
  6. Disséquer carrément le tissu sous-cutané à l'aide de forceps.
  7. Utilisez des lunettes de dissection (voir Tableau des matériaux)pour identifier le tissu adipeux blanc dans la cavité abdominale.
  8. Utilisez des microcisse et des microforceps pour faire une incision de 0,5 à 1 cm à travers le fascia jusqu'à ce que la cavité abdominale soit atteinte.
    REMARQUE: Pour le groupe opéré par une imposture, refermez directement les plaies. Suturer la couche musculaire et la peau séparément à l'aide d'une suture monofilament.
  9. Lorsque le tissu adipeux blanc dans la cavité abdominale peut être vu, saisir le tissu adipeux à l'aide de microforceps et le retirer doucement. Un ovaire rose en forme de mûrier enveloppé par le tissu adipeux dans la cavité abdominale peut être vu.
  10. Ligate le vaisseau proximal de 0,5 à 1 cm et la corne utérine à l'aide d'une suture monofilament. Retirez l'ovaire à l'aide de microscissors et placez le tissu restant dans la cavité abdominale.
    REMARQUE: Les principaux symptômes indésirables de l'opération OVX sont la ligature uréérale qui entraîne une mortalité élevée chez les souris opérées par OVX. Cela peut être évité en identifiant les tissus à l'aide d'une lunette séchage.
  11. Fermez les plaies. Suturer la couche musculaire et la peau séparément à l'aide d'une suture monofilament.
  12. Utilisez des ciseaux et des forceps pour faire une autre incision latérale de 1 cm à la ligne médiane et de 1 cm latérale ment aux côtes costales de l'autre côté. Répétez la procédure ci-dessus (1,5 à 1,11).
  13. Laissez l'animal se réveiller de l'anesthésie. Séparer garder la souris le premier jour après la chirurgie.
  14. Nettoyez ou remplacez fréquemment la cage pendant la phase de récupération.
  15. Environ 24 h après chirurgie, administrer un autre poids corporel de 5 mg/kg du carprofène analgésique sous-cutané.

2. Administration perorale de 17 estradiol ou PPD par l'intermédiaire de la propagation de noisette

  1. Dissoudre complètement 17'-estradiol ou PPD dans l'huile de sésame, puis mélanger l'huile de sésame avec la tartinade de noisette (voir Tableau des matériaux). Une portion quotidienne pour chaque souris de 30 g contient 3 g de 17 o-estradiol ou 15 g de PPD, 4 l'huile de sésame et 60 mg de tartinade de noisettes. Préparer un placebo pour chaque souris de 30 g contient 4 L d'huile de sésame et 60 mg de tartinade de noisettes.
    REMARQUE: La partie d'administration quotidienne de 17-estradiol ou PPD était basée sur des études précédentes6,11 et des expériences préliminaires.
  2. Une semaine après OVX, nourrir les souris avec un régime riche en cholestérol (1,25% de cholestérol, 0% de cholate) pendant 12 semaines. Un schéma de traitement expérimental typique, tel qu'il est utilisé dans cette étude, est illustré dans la figure 1.
  3. 5 jours avant l'administration perorale de la propagation de noisette à la semaine 4, former les souris à manger le placebo contenant environ 30 mg de propagation de noisette pour 2-5 souris pendant 5 jours. Entraînez les souris en groupes dans leurs cages d'origine pendant les 3 premiers jours. Placez les souris dans des cages séparées les quatrième et cinquième jours de formation et servez la partie quotidienne pour ressembler à la situation expérimentale.
  4. Au cours des 9 dernières semaines, placez les souris dans des cages séparées, puis servez une portion quotidienne de la portion de tartinade de noisettes pour chaque occasion d'alimentation.
    REMARQUE: Servir une portion quotidienne contenant 17 'estradiol (0.1 mg-kg-1) ou PPD (0.5 mg-kg-1) par l'intermédiaire de la tartinade de noisette dans le groupe OVX/E2 et OVX/PPD respectivement; servir une portion quotidienne contenant la propagation de noisette sans hormone dans le groupe SHAM et OVX.

3. Détermination de l'épaisseur intima-média et du dysfonctionnement cardiaque à l'aide d'un système de microéchographie

  1. Biomicroscopie ultrasonographique
    1. Un jour avant la terminaison, examinez l'épaisseur intima-média et le dysfonctionnement cardiaque à l'aide d'un système de micro-échographie (voir Tableau des matériaux) tel que décrit précédemment21.
    2. Avant l'examen, donnez à chaque souris une injection intrapéritonéale de 200 mg/kg d'avertin (tribromoéthanol) sous anesthésie (n - 8 souris par groupe).
    3. Raser soigneusement les poils du cou de chaque souris. Appliquer le gel de transmission d'ultrason chaud généreusement pour assurer la qualité optimale d'image.
    4. Obtenez des images ultrasonographiques de base de la racine aortique et de l'aorte ascendante avec la tête de balayage de 30 MHz à une mise au point de 12,7 mm et une résolution de 40 m.
    5. Utilisez l'électrocardiographie avec une configuration lead II pour la surveillance.
    6. Capturez des images à long axe parasternal droite de l'aorte ascendante, de l'arc aortique et de la branche de l'artère brachiocéphale dans un plan en systole (figure 3).
  2. Mesures de l'épaisseur de l'intima-média et de la plaque maximale
    1. Ajuster facilement la distance entre le transducteur et le site artériel pour obtenir des images claires.
    2. Stockez une boucle de 10 s ciné numériquement pour un examen hors ligne sur un système d'analyse d'image.
    3. Choisissez manuellement une image ultrasonographique à cadre gel optimal pour d'autres mesures. Vérifiez les images dans la courbure mineure de l'aorte ascendante. Si la plaque dans l'aorte ascendante peut être vue, mesurez l'épaisseur maximale de plaque. Si la plaque dans l'aorte ascendante ne peut pas être vue, mesurez l'IMT maximal.
    4. Mesurer l'IMT (distance entre l'interface vasculaire luminal-intimal et l'interface médial-adventitial). Mesurer l'épaisseur maximale de la plaque (la distance la plus épaisse entre la bordure du lumen vasculaire et la couche adventitielle).
    5. Données moyennes provenant de trois sites de lésion (figure 3).
  3. Détermination du dysfonctionnement cardiaque utilisant l'échocardiographie
    REMARQUE :     Examiner la fonction cardiaque par l'échocardiographie utilisant un système de microécho, comme précédemment décrit22.
    1. Dirigez un faisceau d'ultrasons vers le cœur, près des muscles papillaires.
    2. Atteindre la visualisation bidimensionnelle de kilohertz à base d'électrocardiogramme.
    3. Effectuer l'échocardiographie transthoracique in vivo du ventricule gauche à l'aide d'une tête de balayage de 30 MHz.
    4. Mesurer les paramètres associés à la fonction cardiaque numériquement à partir des tracés en mode M.
    5. Moyenne des données de trois à cinq cycles cardiaques (tableau1).
  4. Variabilité intra- et interobservateur
    1. Pour la validation de la variabilité intra-observateur, analysez les données par un opérateur à deux occasions différentes.
    2. Pour l'évaluation de la variabilité interobservateur, analyser les données par un opérateur différent.

4. Mesure hebdomadaire du poids corporel et plasma cholestérol total (TC) et détermination du triglycéride (TG)

  1. Mesure hebdomadaire du poids corporel
    1. Mesurez le poids corporel une fois par semaine de la semaine -1 à la semaine 12.
      REMARQUE : n 8 souris par groupe.
  2. Préparation au plasma
    1. Avant de prélever des échantillons de sang par perforation intracardiaque, préparez des seringues et des tubes. Utilisez EDTA comme anticoagulant. Ajouter 10 OL de 0,5 M EDTA à chaque seringue de 2 ml, et ajouter 8 'L de 0,5 M EDTA à chaque tube de 1,5 ml.
    2. À la semaine 12, après une nuit rapide, anesthésier les souris avec avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intrapéritonement).
      REMARQUE : n 3 souris par groupe.
    3. Préparer la zone de la poitrine ventrale avec 70% d'éthanol.
    4. Utilisez des ciseaux et des forceps pour ouvrir la cavité thoracique et couper les côtes jusqu'à ce que le cœur battant soit exposé.
    5. Insérer l'aiguille de 25 G dans le ventricule droit. Aspirez lentement jusqu'à ce que le sang commence à couler dans la seringue.
      REMARQUE: Nous utilisons des seringues jetables dans un état stérile avec des aiguilles de 25 G (voir Tableau des matériaux).
    6. Continuez à aspirer avec une pression constante et uniforme. Si aucun sang n'est vu, repositionner l'aiguille et répéter l'aspiration.
    7. Gardez les souris profondément anesthésiés avant de recueillir le volume sanguin requis. Normalement, jusqu'à 1 ml de sang peut être recueilli. Euthanasier les souris par luxation cervicale sous cette condition anesthésique profonde.
    8. Échantillons de sang Pipette dans des tubes de 1,5 ml et inverser le sang à fond pour assurer le mélange EDTA dans le sang. Ensuite, placez des échantillons de sang sur la glace immédiatement.
    9. Échantillons de centrifugeuse de 20 min à 400 x g à 4 oC dans les 30 min de la collecte.
    10. Recueillir le supernatant soigneusement. Aliquot et stocker des échantillons de plasma à -80 oC.
  3. Construire des courbes standard pour la mesure du contenu TC ou TG
    1. Pour la courbe standard de TC, préparez diverses concentrations de normes de cholestérol : 0 mmol/L, 0,52 mmol/L, 1,03 mmol/L, 2,07 mmol/L, 4,14 mmol/L, 6,20 mmol/L, 8,27 mmol/L et 10,34 mmol/L. Measure O.D. pour chaque norme de cholestérol. Définir l'OD moyen pour chaque norme de cholestérol. En tant que valeur verticale (Y) de l'axe, définir la concentration comme valeur horizontale (X) de l'axe. Créez une courbe standard à l'aide d'un logiciel statistique.
    2. Pour la courbe standard TG, préparez diverses concentrations de normes TG : 0 mmol/L, 0,45 mmol/L, 0,90 mmol/L, 1,81 mmol/L, 3,62 mmol/L, 5,42 mmol/L, 7,23 mmol/L et 9,04 mmol/L. Measure O.D. pour chaque norme TG. Définir l'O.D. moyen pour chaque norme TG comme valeur verticale (Y) de l'axe ; définir la concentration en tant que valeur horizontale (X) de l'axe. Créez une courbe standard à l'aide d'un logiciel statistique.
      REMARQUE: Un raccord de courbe logistique à quatre paramètres (4 pl) a été utilisé pour la construction de la courbe standard dans la présente étude. Vérifiez la courbe standard avant de mesurer les échantillons de plasma et assurez-vous que r2 est supérieur à 0,995.
  4. Mesure du contenu de TC
    1. Étiquetez la bouteille de réactif de couleur (25 ml) du kit d'assidut de TC comme « solution de travail de TC ».
    2. Vortex les spécimens réfrigérés brièvement. Préparer les dilutions : 20 l de plasma dans 80 l d'eau distillée. Dilutions de vortex brèves.
    3. Ajouter 2,5 l de normes de cholestérol (5,17 mmol/L) ou 2,5 l de plasma dilué ou 2,5 l d'eau distillée (blanc) aux puits appropriés d'une assiette de 96 puits. La triplication est recommandée.
    4. Pour tous les puits, ajouter 250 l de la couleur réagent.
    5. Incuber à 37 oC pendant 10 min.
    6. Allumez le lecteur de microplaque et laissez un échauffement de 10 min.
    7. Retirez la plaque de l'incubateur et lisez le lecteur de microplaque à 510 nm. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles ou de poussière dans les puits de microtiter ou au fond de la plaque, respectivement.
    8. Calculez la concentration de TC comme suit :
      TC cont. - normes de cholestérol cont. (échantillon plasmatique O.D.-blank O.D)/(normes de cholestérol O.D.-blank O.D)
  5. Mesure du contenu TG
    1. Étiquetez la bouteille de réactif de couleur (25 ml) du kit d'assay TG comme « solution de travail TG ».
    2. Vortex les spécimens réfrigérés brièvement.
    3. Ajouter 2,5 L de normes TG (2,26 mmol/L) à ou 2,5 l de plasma dilué ou 2,5 l d'eau distillée (blanc) aux puits appropriés d'une plaque de 96 puits. La triplication est recommandée.
    4. Pour tous les puits, ajouter 250 l de la couleur réagent.
    5. Incuber à 37 oC pendant 10 min.
    6. Allumez le lecteur de microplaque et laissez un échauffement de 10 min.
    7. Retirez la plaque de l'incubateur et lisez le lecteur de microplaque à 510 nm.
      REMARQUE: Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles ou de poussière dans les puits de microtiter ou au fond de la plaque.
    8. Calculez la concentration TG comme suit :
      TG cont. - Normes TG cont. (échantillon plasma o.D.-blank O.D)/(TG standards O.D.-blank O.D)

5. En Face Analyse des lésions athérosclérotiques aortiques

  1. Isolement et excision d'Aorta
    1. À la semaine 12, après une nuit rapide, anesthésier les souris avec avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intrapéritonement). Euthanasier les souris par luxation cervicale sous cette condition anesthésique profonde.
      REMARQUE: Nous avons utilisé 3 souris par groupe.
    2. Préparer la zone de la poitrine ventrale avec 70% d'éthanol. Utilisez des ciseaux et des forceps pour ouvrir la cavité thoracique et couper les côtes jusqu'à ce que le cœur battant soit exposé.
    3. Remplissez une seringue de 50 ml de phosphate tamponné salin au pH 7.4 (voir Tableau des matériaux). Insérez un 25 G d'aiguille dans le ventricule gauche et coupez l'oreillette droite pour éviter la pression élevée de la perfusion.
    4. Effectuer la perfusion in situ à un débit de 0,05-0,08 ml/min. Absorber le liquide de perfusion avec les tissus.
    5. Enlever les côtes et les poumons dans la cavité thoracique à l'aide de ciseaux et de forceps. Ensuite, ouvrez la cavité abdominale et enlevez les organes à l'intérieur pour une meilleure vue de l'aorte.
    6. Enlever l'aorte en tenant le cœur avec les microforceps et en séparant l'aorte de la colonne vertébrale dorsally avec microscissors jusqu'à la bifurcation iliaque.
      REMARQUE: Lorsque vous disséquez près des branches rénales auriculaires, coupez profondément à l'aide de microcise pour éviter les dommages causés par l'aorte.
    7. Fixer le cœur et l'aorte pendant 48 h dans 4% de paraformaldéhyde. Conserver les aortes dans la saline à température ambiante ou à 2-8 oC pendant quelques heures.
      REMARQUE: Cette procédure facilitera le nettoyage.
  2. Préparation de l'aorte
    1. Retirez le cœur. Retirez soigneusement les tissus adventitiaux des aortes à l'aide de microforceps et de microscissors sous un stéréomicroscope. Utilisez saline pour garder le tissu humide pendant le nettoyage.
      REMARQUE: Veillez à ne pas déchirer ou entailler l'aorte et certaines branches importantes, telles que l'artère innominée, l'artère carotide commune gauche, et l'artère sous-clavian gauche.
    2. Laisser 1 mm de l'innominate et laisser les artères carotides communes et couper toute l'artère sous-clavière gauche.
    3. Coupez la courbure externe par l'artère innominée, puis à l'artère carotide commune gauche, et puis à l'artère sous-clavian gauche.
    4. Couper ouvert le long de la courbure intérieure de la partie ascendante vers le bas de la partie abdominale.
    5. Épingler l'aorte à plat sur une feuille de plastique noire et appliquer la saline pour empêcher les aortas de sécher.
  3. Image de la région intimal de l'aorte
    1. Prenez des photos d'aortes en face avec un microscope stéréo. Inclure une règle d'échelle millimétrique dans les images pour calibrer les mesures.
    2. Inclure l'arc et les régions thoraciques dans la même image et la région abdominale dans une autre. Enregistrez des images comme JPEG ou TIFF.
      REMARQUE: La région de l'arc est de la jonction du myocarde à 3 mm distal de l'artère sousclavian gauche, la région thoracique est de 3 mm distal à l'artère sousclavière gauche à la dernière artère intercostale, et la région abdominale est la dernière artère intercostale à l'iliac bifurcation.
  4. Quantification de la lésion athérosclérotique-en méthode du visage
    1. Étalonnage
      1. Ouvrez l'image avec un logiciel d'analyse d'image (voir Tableau des matériaux),allez à La calibration spatiale et suivez les instructions.
      2. Changer les unités de référence en mm en positionnant la règle sur la ligne.
    2. tour
      1. Définir l'étalonnage correct pour chaque image.
      2. Mesurer 3 mm sur la règle.
      3. Mesure de région d'arche et thoracique : Décrivez la région d'arc de la jonction du myocardium à 3 millimètres distal de l'artère subclavière gauche et de la région thoracique de 3 mm distal à l'artère subclavière gauche à la dernière artère intercostale. Tracez les lésions dans l'arc et la région thoracique et regardez l'aorte à travers le microscope.
      4. Mesure de région abdominale : Décrivez la région abdominale de la fin de la région thoracique à la bifurcation iliaque. Trace zona lésions dans la région abdominale et regarder l'aorte à travers le microscope.
      5. Calculer la zone de lésion par rapport à la surface intérieure de l'aorte.
      6. Vérifier la quantification par l'intermédiaire d'un deuxième observateur aveugle aux groupes d'étude.

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Résultats

Un schéma de traitement expérimental typique, tel qu'il est utilisé dans cette étude, est illustré dans la figure 1. Au sénage (âge 28 jours), les souris femelles d'apoE-/- C57BL/6J ont été anesthésiés aveclen (tribromoethanol ; 200 mg/kg ; intraperitoneally). Des souris ont été bilatéralement OVX ou simulacre actionné par une incision dorsal de 1 cm. Une semaine après OVX bilatéral, les souris ont été alimentées un régime à haute teneur en cholest...

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Discussion

La méthodologie décrite ici est un modèle de souris ressemblant à la perturbation de lipide et à l'athérosclérose vu dans les femmes ménopausées. Il est bien documenté que l'insuffisance d'oestrogène dans les femmes postmenopausal peut aggraver l'incidence de l'hypercholestérolémie préexistante ou continue avec les lésions atherosclérostic progressivement complexes et répandues1. Pour imiter le statut athérosclérose-enclin dans la clinique, les souris apoE-déficientes, une source reproductible et ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81202526 à J.X.), la National Natural Science Foundation of China (81302769 à B.S.), la Beijing Municipal Natural Science Foundation (47144226 à B.S.), le Science Foundation (20110490325 à J.X.), et la Ph.D. Programs Foundation of Ministry of Education of China (20121106120031 à B.S.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
17&bêta ;-œstradiol, >98 %Sigma-AldrichE8875-250MGd’œstrogène
(avec aiguilles de 25 g)Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd0.5*19TWLBHémorragie cardiaque
Régime alimentaire élevé de sourisHuafukang Bio-TechnologyN/A1,25 % de cholestérol, 0 % de cholate
Systèmede micro-imagerie in vivo à haute résolutionVisualSonicsVevo® ; 770Mesures de l’épaisseur de l’intima-media et de la dysfonction cardiaque
2-Méthyl-2-butanolSigma-Aldrich152463-250MLPréparation de l’avertin
Micro pince de dissection, courbée 8mmKanghua Medical Equipment Co., LtdOutils chirurgicaux
pince de dissection, droite 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdOutils chirurgicaux
Micro ciseaux de dissection, courbés/pointus 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdOutils chirurgicaux
Micro ciseaux de dissection, droits/tranchants 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdOutils chirurgicaux Suture
monofilament 4-0 1/2 5 x 12 19 mmShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LtdR413Suture et ligature des tissus
Crème de noix (Nutella)FerreroN/AMedium pour 17&beta ;-estradiol ou PPD
OptiVisor loupe binoculaire en verre optiqueDohegan Optical Company Inc.N/AAssistant d’identification des tissus lors de l’ovariectomie
Solution saline tamponnée au phosphate à pH 7,4SIGMAP3813Préparation de 1 L de solution saline
Pro MultiLabel Lecteur de microplaquesTecanInfinite M1000Détermination du plasma TC et TG
PseudoprotodioscinShanghai Winherb Medical S & T DevelopmentW-0427N° d’enregistrement CAS 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mLPfizer Pharma GmbH462986Analgésie postopératoire après ovariectomie
Huile de sésameSigma-AldrichS3547-1LDissoudre le 17&bêta ;-estradiol ou PPD
Solcoseryl Eye-GelMenarini, Solco Basle Ltd.Protection oculaire pendant l’anesthésie
StéréomicroscopeMCALONMCL-6STVImage de la région intimale de l’aorte
Modèle de table centrifugeuse à grande vitesseSIGMA1-14KPréparation du plasma
Ciseaux, légère courbe (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdOutils chirurgicaux
Ciseaux, droits Plat (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdOutils chirurgicaux
Pinces à tissus, dentelées, légères Courbe (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdOutils chirurgicaux
Pinces à tissus, dentelées, droites Plates (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdOutils chirurgicaux
TribromoéthanolSigma-AldrichT48402-5G
de dosage des triglycérides (TG) d’avertinInstitut de Nanjing Jiancheng Biology EngineeringA110-1Détermination de la TG plasmatique
Kit de dosage du cholestérol total (TC)Institut de Nanjing Jiancheng Biology EngineeringA111-1Détermination de la CT plasmatique
Seringues jetables Micro Préparation du kit

Références

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