Article de méthode

Isolement des particules de lipoprotéine du jaune d'oeuf de poulet pour l'étude de l'incorporation d'acide gras de pathogène bactérien dans les phospholipides de membrane

DOI :

10.3791/59538

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15 mai 2019

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1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 2Department of Physiology, Michigan State University

Dans cet article

Résumé

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Cette méthode fournit un cadre pour étudier l'incorporation des acides gras exogènes des sources hôtes complexes dans les membranes bactériennes, en particulier Staphylococcus aureus. Pour ce faire, des protocoles pour l'enrichissement des particules de lipoprotéines du jaune d'oeuf de poulet et le profilage suivant d'acide gras des phospholipides bactériens utilisant la spectrométrie de masse sont décrits.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staphylococcus aureus et d'autres pathogènes Gram-positifs incorporent les acides gras de l'environnement dans les phospholipides membranaires. Pendant l'infection, la majorité des acides gras exogènes sont présents dans les particules de lipoprotéines hôtes. L'incertitude demeure quant aux réservoirs d'acides gras hôtes et aux mécanismes par lesquels les bactéries extraient les acides gras des particules de lipoprotéines. Dans ce travail, nous décrivons des protocoles pour l'enrichissement des particules de lipoprotéine de basse densité (LDL) du jaune d'oeuf de poulet et de déterminer si les LDL servent de réservoirs d'acide gras pour S. aureus. Cette méthode exploite l'analyse lipidomique impartiale et les LDL de poulet, un modèle efficace et économique pour l'exploration des interactions entre les LDL et les bactéries. L'analyse de l'intégration de S. aureus des acides gras exogènes des LDL est effectuée en utilisant la spectrométrie de masse à haute résolution/précise et la spectrométrie de masse en tandem, permettant la caractérisation de la composition en acides gras de la bactérie membrane et identification impartiale de nouvelles combinaisons d'acides gras qui surgissent dans les lipides de membrane bactérienne lors de l'exposition aux LDL. Ces techniques avancées de spectrométrie de masse offrent une perspective inégalée de l'incorporation d'acides gras en révélant les acides gras exogènes spécifiques incorporés dans les phospholipides. Les méthodes décrites ici sont adaptables à l'étude d'autres agents pathogènes bactériens et de sources alternatives d'acides gras complexes.

Introduction

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Le S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) est la principale cause d'infection associée aux soins de santé et la résistance aux antibiotiques associée est un défi clinique considérable1,2,3. Par conséquent, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est une grande priorité. Une stratégie de traitement prometteuse pour les pathogènes Gram-positifs inhibe la synthèse des acides gras, une exigence pour la production de phospholipide membranaire qui, dans S. aureus, comprend le phosphatidylglycérol (PG), lysyl-PG, et la cardiolipine4. Dans les bactéries, la production d'acides gras se produit par l'intermédiaire de la voie de synthèse d'acide gras II (FASII)5, qui est considérablement différente de la contrepartie eucaryotique, faisant FASII une cible attrayante pour le développement d'antibiotiques5,6 . Les inhibiteurs de FASII ciblent principalement FabI, une enzyme requise pour l'allongement de la chaîne de carbone d'acide gras7. Le triclosan inhibiteur FabI est largement utilisé dans les biens de consommation et médicaux8,9. D'autres inhibiteurs FabI sont en cours de développement par plusieurs sociétés pharmaceutiques pour le traitement de l'infection S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Cependant, beaucoup d'agents pathogènes Gram-positifs, y compris S. aureus,sont capables de récupérer les acides gras exogènes pour la synthèse phospholipide, en contournant l'inhibition FASII27,28,29. Ainsi, le potentiel clinique des inhibiteurs FASII est débattu en raison de lacunes considérables dans notre connaissance des sources d'acides gras hôtes et les mécanismes par lesquels les agents pathogènes extraient les acides gras de l'hôte27,28. Pour combler ces lacunes, nous avons développé une méthode d'analyse lipidomique impartiale pour surveiller l'incorporation d'acide gras exogène des particules de lipoprotéines dans les phospholipides membranaires de S. aureus.

Pendant la septicémie, les particules de lipoprotéines hôtes représentent une source potentielle d'acides gras dérivés de l'hôte dans la vascularisation, car la majorité des acides gras hôtes sont associés aux particules30. Les lipoprotéines se composent d'une coquille hydrophile composée de phospholipides et de protéines qui renferment un noyau hydrophobe de triglycérides et d'esters de cholestérol31. Quatre grandes classes de lipoprotéines - chylomicron, lipoprotéines de très faible densité, lipoprotéines de haute densité et lipoprotéines de faible densité (LDL) - sont produites par l'hôte et fonctionnent comme des véhicules de transport lipidiques, livrant des acides gras et du cholestérol à et à partir cellules hôtes par la vascularisation. Les LDL sont abondants en acides gras estérifiés, y compris les triglycérides et les esters de cholestérol31. Nous avons précédemment démontré que les LDL humains fortement purifiés sont une source viable d'acides gras exogènes pour la synthèse de PG, fournissant ainsi un mécanisme pour le contournement d'inhibiteur de FASII32. La purification des LDL humaines peut être techniquement difficile et prendre beaucoup de temps, tandis que les sources commerciales de LDL humains purifiés sont prohibitivement coûteuses à utiliser de façon routinière ou à effectuer des écrans bactériens à grande échelle. Pour remédier à ces limitations, nous avons modifié une procédure d'enrichissement des LDL à partir du jaune d'œuf de poulet, une riche source de particules de lipoprotéines33. Nous avons utilisé avec succès une spectrométrie de masse non ciblée et à haute résolution/précise et une spectrométrie de masse en tandem pour surveiller l'incorporation d'acides gras humains dérivés du LDL dans la membrane de S. aureus32. Contrairement aux méthodes précédemment signalées, cette approche peut quantifier les isoreurs individuels d'acides gras pour chacun des trois principaux types de phospholipides staphylococciques. L'acide oleique (18:1) est un acide gras insaturé présent dans toutes les particules de lipoprotéines hôtes qui est facilement incorporé e dans les phospholipides de S. aureus 29,30,32. S. aureus n'est pas capable de synthèse d'acide oléique29; par conséquent, la quantité d'acide oléique incorporé au phospholipide établit la présence d'acides gras diipoprotéines dans la membrane staphylococcique29. Ces espèces de phospholipides peuvent être identifiées par la méthode de spectrométrie de masse de pointe décrite ici, offrant une résolution sans précédent de la composition membranaire de S. aureus cultivé en présence d'une source d'acides gras qu'il est probable rencontres pendant l'infection.

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Protocole

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REMARQUE: Le protocole suivant pour l'enrichissement des particules lDL à partir du jaune d'œuf de poulet est dérivé de Moussa et al. 200233.

1. Préparation du jaune d'œuf de poulet pour l'enrichissement des particules de LDL

  1. Assainissez deux gros œufs de poulet en lavant les coquilles avec une solution d'éthanol à 70 % et laissez sécher à l'air.
  2. Assainiz le séparateur d'œufs à l'aide d'une solution d'éthanol à 70 % et laissez sécher à l'air. Fixer le séparateur d'œufs sur la lèvre d'un bécher de taille moyenne.
  3. Casser chaque œuf individuellement dans le séparateur d'œufs et laisser l'albumen s'écouler dans le bécher. Le jaune d'œuf intact sera conservé par le séparateur.
  4. Laver le jaune d'œuf deux fois avec 30 ml de saline stérile tamponnée de phosphate (PBS) pour enlever l'albumen résiduel.
  5. Placer délicatement le jaune d'œuf sur du papier filtre.
  6. Perforez la membrane vitelline à l'aide d'une pointe de pipette stérile et drainez le contenu de la membrane dans un tube de centrifugeuse conique stérile de 50 ml. Jeter la membrane et filtrer le papier.

2. Fractionnement du plasma contenant du LDL à partir du jaune d'œuf de poulet

  1. Ajouter environ deux volumes de 0,17 M NaCl au pH 7,0 au jaune d'œuf et mélanger vigoureusement. Ensuite, mélanger cette solution à 4 oC pendant 60 min.
  2. Centrifuger la dilution du jaune d'œuf à 10 oC à 10 000 x g pendant 45 min. Retirez la fraction plasmatique (supernatant) de la fraction granulaire (pellet) dans un tube conique stérile de 50 ml.
  3. Répétez l'étape 2.2.

3. Isolement des particules de LDL du plasma

  1. Mélanger la fraction de plasma avec 40% de sulfate d'ammonium (w/v) à 4 oC pendant 60 min.
  2. Ajuster le pH de la fraction plasmatique avec une solution NaOH de 420 mM à 8,7.
  3. Centrifuger la dilution du jaune d'œuf à 4 oC à 10 000 x g pendant une durée de 45 min. Retirez la fraction jaune semi-solide supérieure dans un tube de dialyse de taille pore de 7 kDa. Fournir de la place dans la tubulure pour permettre à elle de gonfler.
  4. Dialyser pendant la nuit à 4 oC dans 3 L d'eau ultrapure pour enlever le sulfate d'ammonium. Agiter doucement l'eau à l'aide d'une barre à remuer.
  5. Transférer la solution dialysée dans un tube stérile de centrifugeuse conique de 50 ml.
  6. Centrifuger la solution à 4 oC à 10 000 x g pendant une durée de 45 min. Retirez soigneusement la fraction jaune semi-solide supérieure dans un tube stérile et entreposez-la à 4 oC.

4. Évaluation des LDL de poulet comme source d'acides gras

  1. Sous-culture S. aureus cellules dans 5 ml de bouillon d'acide gras 1% tryptone et incuber pendant la nuit à 37 oC avec secousses (225 tr/min). Pour les auxotrophes d'acides gras, compléter les cultures par une source d'acides gras.
  2. Diluer les cultures du jour au lendemain à une densité optique (OD) à 600 nm (OD600) de 0,1 dans 1% de bouillon tryptone. Pipette 50 l de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque ronde de 96 puits.
    REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec des auxotrophes d'acides gras, lavez les cultures de la nuit en deux volumes de bouillon de tryptone et suspendez-les en 5 ml de bouillon tryptone pour limiter le report des acides gras avant de déterminer l'OD de la culture.
  3. Pour les puits contenant des commandes non traitées, ajouter 50 l de bouillon tryptone de 1 % par puits.
  4. Aux puits contenant les suspensions cellulaires expérimentales, ajoutez 50 l de bouillon tryptone de 1 % complété par du LDL dérivé du jaune d'œuf à 10 %, du triclosan de 2 M, ou d'un mélange de LDL dérivé du jaune d'œuf à 10 % et de 2 triclosanmM.
    REMARQUE : À ce stade, chaque puits contiendra 100 L et la concentration finale de LDL dérivé du jaune d'œuf et de triclosan par puits sera de 5 % et de 1 M, respectivement.
  5. Mesurez l'OD600 au fil du temps, à l'aide d'un lecteur de microplaques réglé à 37 oC avec des secousses linéaires continues pour surveiller la croissance.

5. Incubation de S. aureus avec LDLs pour l'analyse des lipides membranaires.

  1. Culture d'une colonie isolée en 5 ml de bouillon d'essai sans acide gras et incuber toute la nuit à 37 oC en secouant (225 tr/min).
  2. Diluer les cultures nocturnes 1:100 dans un flacon stérile de 250 ml déconcerté contenant 50 ml de bouillon tryptone 1%. Incuber à mi-log phase (environ 4 h) à 37 oC avec secousses.
  3. Transférer 25 ml de culture dans un tube de centrifugeuse stérile de 50 ml et granuler les cellules. Retirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans 750 l de bouillon tryptone de 1%.
  4. Combiner les cellules resuspension et l'aliquot 300 l de la suspension cellulaire dans un tube stérile de centrifugeuse de 1,5 mL.
  5. Ajouter les LDL à la concentration finale désirée et couver à 37 oC en secouant (225 tr/min) pendant 4 h.
  6. Centrifuger les cultures à 4 oC à 16 000 x g pour une durée de 2 min et laver les granulés cellulaires en deux volumes de PBS stérile puis répéter.
  7. Enregistrez le poids de chaque granule de cellules humides. Congelez les granulés de cellules sur de la glace sèche ou dans de l'azote liquide et entreposez-les à -80 oC ou passez directement à la section 6.

6. Extraction des lipides de membrane de S. aureus

  1. Placer les granulés de cellules S. aureus congelés sur la glace sèche. Ajouter des perles d'oxyde de zirconium de 0,5 mm sur chaque granule de cellule, en utilisant un volume de perles à peu près égal au volume de la granule cellulaire.
    REMARQUE : Comme alternative à cette méthode d'extraction de lipides, les chercheurs peuvent employer les méthodes bien établies de Bligh et de Dyer ou de Folch pour exiger des lipides des cellules bactériennes34.
  2. Ajouter 740 l de 75 % de méthanol (catégorie HPLC) refroidi s'est réfrité directement dans les granulés cellulaires.
  3. Ajouter 2 'L de 50 'M dimyristoyl phosphatidylcholine (préparé au méthanol) par 1 mg de cellules comme norme interne. Fermez le tube à essai et placez les tubes centrifugeuses de 1,5 ml contenant chaque échantillon dans un port disponible dans un homogénéisateur de tissu Bullet Blender. Homogénéiser les échantillons à basse vitesse, en réglant 2-3, pendant 3 min.
  4. Inspecter visuellement les échantillons pour vérifier l'homogénéité. Si des amas de cellules sont visibles, continuer l'homogénéisation dans le mélangeur de balles par incréments de 2 min.
  5. Retirer les échantillons du mélangeur de balles et le transférer dans une hotte chimique.
  6. Ajouter 270 l de chloroforme à chaque tube d'échantillon. Vortex les échantillons vigoureusement pendant 30 min.
    CAUTION: Le chloroforme est un cancérogène possible.
  7. Centrifuger les échantillons dans une centrifugeuse de banc jusqu'à 30 min à un minimum de 2 000 x g. Des vitesses plus rapides peuvent être utilisées avec des tubes de centrifugeuse compatibles et la durée de centrifugation peut être raccourcie à 10 min.
  8. Dans un capot chimique, recueillir le supernatant monophasique et transférer dans un nouveau tube à essai, tout en évitant soigneusement la pastille protéique au fond du tube d'extraction.
  9. Ajouter 740 l de méthanol à 75 % (catégorie HPLC) et 270 l de chloroforme à la pastille protéique, et réextraire chaque échantillon tel que décrit dans les étapes 6,6-6,8 ci-dessus. Combinez le supernatant de la deuxième extraction avec le supernatant précédemment recueilli pour chaque échantillon.
  10. Évaporer les solvants d'extraction sous un flux de gaz inerte comme l'azote ou l'argon, ou sous vide à l'aide d'un concentrateur de centrifugeuse (Tableau des matériaux).
  11. Laver les extraits de lipides séchés trois fois avec 1,0 ml de solution aqueuse de 10 mM de bicarbonate d'ammonium et résécher les échantillons comme à l'étape 6,10.
  12. Resuspendre les extraits de lipides séchés dans un solvant non polaire approprié comme l'isopropanol. Resuspendre les échantillons à l'aide de 20 l par mg de poids de cellules fraîches déterminés à l'étape 5.7 Alternativement, si le poids des granulés de cellules est inconnu, resuspendre les échantillons dans 200 'L d'isopropanol et passer à la section 7.

7. Analyse des profils lipidiques de S. aureus à l'aide d'une spectrométrie de masse à haute résolution/précise

  1. Avant d'effectuer une analyse complète des lipides, sélectionnez des échantillons d'essai représentatifs du groupe expérimental et analysez-les sur une gamme de facteurs de dilution de l'échantillon afin de déterminer les plages de dilution de l'échantillon dans lesquelles les concentrations totales de lipides se situent dans le linéaire la gamme de réponse de détecteur pour le spectromètre de masse, comme précédemment décrit35.
  2. Évaporer les aliquots de chaque extrait lipidique de l'échantillon pour être soumis à l'analyse lipidique, en séchant les aliquots sous le gaz inerte ou sous vide dans un concentrateur de centrifugeuse (Tableau des matériaux).
  3. Resuspendre chaque extrait de lipide séché dans la chromatographie liquide - spectrométrie de masse (LC-MS) grade isopropanol:methanol (2:1, v:v) contenant 20 mM d'ammonium formate, en utilisant des volumes équivalents à un facteur optimal de dilution de l'échantillon tel que déterminé à l'étape 7.1.
  4. Pour une analyse lipidique non ciblée, des échantillons peuvent être introduits directement à la plate-forme de spectrométrie de masse à haute résolution/précise sans l'utilisation de la chromatographie par injection de flux ou infusion directe d'extraits35,36. Transférer les extraits lipidiques dilués préparés à l'étape 7.3 dans une fiole d'autosampler appropriée ou une plaque de 96 puits.
  5. Pour l'analyse basée sur l'injection d'écoulement, placez les flacons d'autosampler dans un autosampler à température contrôlée (15 oC) d'un système HPLC capable d'applications capillaires/à faible débit, comme un HPLC (Tableau des Matériaux) équipé d'un flux électronique système de surveillance des proportions et des flux.
  6. Remplissez les réservoirs de solvants HPLC avec isopropanol:méthanol de qualité LC-MS (2:1, v:v) contenant 20 mM de format ammonium.
  7. À l'aide du logiciel Agilent Chemstation, programmez l'autosampler HPLC pour effectuer des injections d'échantillons de 5 ll. Dans le menu Instrument, sélectionnez Set Up Injectoret tapez 5.0 dans le champ Volume d'injection. Les unités sont données sous forme de microlitres. Assurez-vous que le HPLC est réglé sur le débit isocratique à 1 oL par min de 2:1 (v:v) isopropanol:méthanol contenant 20 mM d'ammonium formate.
  8. Dans le menu Chemstation Instrument, sélectionnez Set Up Pump... puis sélectionnez le commutateur de bascule en mode Micro Flow.
  9. Dans les champs d'horaire, entrez: Temps 0,00, 100% B, Flow 1.0. Hit Enter et créer une deuxième rangée dans le calendrier en entrant Temps 10.0, 100% B, Flow 1.0. Sélectionnez le bouton OK en bas du menu Set Up Pump. Ces paramètres permettront 10 exécutions analytiques à un débit de 1,0 L par minute.
  10. Introduire l'éluate de la ligne de transfert HPLC au spectromètre de masse à l'aide d'une source d'ionisation électrospray équipée d'une aiguille métallique à faible débit (34 G).
  11. À l'aide du logiciel de contrôle des instruments Thermo Tune Plus, sélectionnez le menu Setup et sélectionnez Heated ESI Source. Définir la tension d'ionisation à 4000 V et le gaz de gaine à 5 (unités arbitraires) en tapant ces valeurs dans les champs correspondants de la boîte de dialogue. De la même façon, fixez le Temp capillaire à 150 oC et l'objectif S à 50 %.
    REMARQUE : Ces valeurs doivent être optimisées pour chaque plate-forme de spectrométrie de masse.
  12. Pour l'analyse non ciblée des lipides, utilisez une plate-forme de MS à haute résolution/masse précise (Tableau des matériaux) comme détecteur.
  13. À l'aide du logiciel Thermo Tune Plus, cliquez sur le bouton Définir l'analyse et, dans le menu Analyzer, sélectionnez FTMS. Définir le champ Mass Range à Normal et dans le champ résolution sélectionnez 100.000. Assurez-vous que le type de scan est réglé sur Full. Dans le menu Scan Ranges, entrez 200 dans le champ First Mass (m/z) et entrez 2000 dans le champ Last Mass (m/z).
  14. Assurez-vous que la polarité négative est utilisée pour détecter les lipides Les plus abondants de S. aureus.
  15. Répétez l'analyse de l'échantillon à l'aide de la cartographie ionique de la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) fragmentation de tous les ions lipidiques dans une région spectrale d'intérêt afin de confirmer les structures lipidiques et les constituants d'acides gras. Alternativement, certains ions lipidiques d'intérêt peuvent être soumis à l'analyse de la SP/MS après que les identifications lipidiques initiales ont été assignées à la section 8.

8. Recherche de base de données pour identifier les lipides endogènes s. aureus et exogènes dérivés du LDL

  1. Utilisez le logiciel Thermo Xcalibur pour affiner la précision de masse observée. Dans Xcalibur, sous le menu Outils, sélectionnez le Recalibrate Offline. Une fois la fenêtre Recalibrate Offline ouverte, chargez le fichier de spectre de masse pour être recalibré en sélectionnant le menu Fichier et en sélectionnant l'option Open.
  2. Ouvrez le fichier d'intérêt, basculez le bouton Insert Row en haut de la fenêtre de vue, pour afficher le chromatogramme ion total pour la course MS. Moyenne des signaux mS acquis en cliquant à gauche sur la souris d'ordinateur sur un bord du pic de signal observé dans le chromatogramme total d'ion et en faisant glisser la souris à travers la partie la plus large du pic.
  3. Dans le menu Filtre d'analyse, sélectionnez le filtre correspondant aux données complètes de la SP. Chargez un fichier de référence contenant les masses monoisotopiques théoriques d'au moins trois lipides endogènes connus de S. aureus en sélectionnant le bouton Load Ref... et en sélectionnant le fichier de référence. Cochez la case Utilisation à côté de chaque masse monoisotopique lipidique.
  4. Cliquez sur le bouton Recherche en bas de la fenêtre d'affichage. Re-moyenne du signal De SP à travers le pic de signal dans le chromatogramme total d'ion comme fait précédemment.
  5. Cliquez sur le bouton Convertir près du bas de la fenêtre d'affichage. Lorsque la boîte de dialogue Convertir s'ouvre, cliquez sur OK. Omettre cette étape si des données ont été recueillies sur des plates-formes de spectrométrie de masse auprès de fournisseurs autres que Thermo Scientific.
  6. À l'aide du logiciel Xcalibur, exportez les listes de pointedes de masse exactes recalibrées pour chaque échantillon non traité ou traité au LDL pour séparer les feuilles de travail d'un fichier Excel. Sélectionnez l'icône Qual Browser. Ouvrez le fichier d'intérêt recalibré en sélectionnant le menu Fichier et en sélectionnant l'option Open...
  7. Moyenne du signal à travers le pic large dans le chromatogramme total d'ion tel que décrit dans l'étape 8.2.
  8. Cliquez à droite sur l'icône de la pune dans la fenêtre d'affichage du spectre de masse et sélectionnez Afficher Liste du spectre. Dans le même menu, sélectionnez Options d'affichage, puis boîte à bascule All Peaks dans le menu Affichage. Cliquez sur le bouton OK pour fermer la fenêtre d'affichage.
  9. Cliquez à droite sur l'icône de la pune dans la fenêtre d'affichage du spectre de masse à nouveau et sélectionnez l'Exportation . Clipboard (Exact Mass). Collez la cellule de données exportée A1 de la première feuille de calcul dans une nouvelle feuille de calcul Excel.
  10. Supprimer les 8 premières lignes de texte dans le fichier de données exportés, de sorte que la cellule A1 de la feuille de calcul Excel contient le premier point de données de masse du spectre de masse. Répétez l'exportation de chaque fichier MS recalibré, en utilisant une nouvelle feuille de travail dans le fichier Excel pour chaque liste de pointe exportée.
  11. À l'aide du logiciel 37 Add-In pour Excel, le logiciel lipidique d'analyse spectrale de masse lipidique (LIMSA) construit une base de données contenant des formules moléculaires d'espèces lipidiques connues de S. aureus telles que décrites par Hewelt-Belka et al. 201438, ainsi que formules représentant des espèces lipidiques qui pourraient hypothétiquement être présentes dans le LDL.
    REMARQUE : En outre, il faut prendre soin d'inclure des formules moléculaires potentielles dans la base de données pour les lipides bactériens hypothétiques qui ont incorporé les acides gras majeurs de LDL, tels que les acides gras oléiques (18:1) et linoléiques (18:2) les acides gras32.
  12. Pour construire la base de données, ouvrez une feuille de calcul Excel vierge. Dans la cellule A1 de la première feuille de travail, tapez la masse monoisotopique théorique/computée des espèces lipidiques à ajouter à la base de données, correspondant à la masse des espèces lipidiques dans l'état ionique observé dans le spectromètre de masse. Dans la cellule B1, entrez un nom pour les espèces lipidiques, telles que PG(34:0).
  13. Dans la cellule C1, entrez la formule moléculaire pour l'espèce lipidique, correspondant à l'état ionique du lipide observé dans le spectromètre de masse. Dans la cellule D1, entrez la charge de l'espèce lipidique telle qu'observée dans le spectromètre de masse. Déplacez-vous vers la cellule A2 pour commencer une nouvelle entrée pour la prochaine espèce lipidique à entrer dans la base de données consultable.
  14. Répétez les étapes 8.12 et 8.13 jusqu'à ce que toutes les espèces lipidiques désirées aient été entrées dans la base de données. Enregistrez le fichier de base de données et laissez-le ouvert dans Excel.
  15. Dans Excel, sélectionnez le menu Add-Ins. Sélectionnez LIMSA pour démarrer le logiciel LIMSA. À partir du menu principal, cliquez sur le bouton Bibliothèque composée... Dans la nouvelle fenêtre qui s'affiche, cliquez sur Composés d'importation. Cela permettra de télécharger la base de données composée pour une utilisation par le logiciel LIMSA.
  16. Effectuez des identifications lipidiques basées sur la masse précise sur tous les spectres MS à l'aide du logiciel LIMSA Add-In pour Excel selon les instructions du fournisseur35. Dans le menu principal de LIMSA, sélectionnez Peak List sous le menu spectrum. Sélectionnez le mode positif ou négatif pour correspondre à la polarité dans laquelle les données de SP ont été acquises.
  17. Dans la fenêtre Peak fwhm (m/z), entrez la fenêtre de recherche de masse souhaitée pour trouver le pic. Une fenêtre de recherche de tolérance de masse de 0,003-0,005 m/z est recommandée pour les données de mS de masse à haute résolution/précises.
  18. Dans la fenêtre Sensibilité, entrez le seuil de référence souhaité (par exemple, 0,01 % d'abondance relative). Dans le menu de correction D'isotopes, sélectionnez algorithmes linear fit ou Subtract, qui peuvent être utilisés avec des données de liste de pointe.
  19. Mettre en évidence les composés lipidiques à inclure dans la recherche de base de données en cliquant sur les espèces lipidiques désirées dans la fenêtre Composés disponibles. Cliquez sur le bouton Ajouter pour ajouter des espèces lipidiques en surbrillance au groupe de recherche.
  20. Définissez les normes internes en cliquant sur les composés ajoutés, puis en modifiant la fenêtre Concentration pour la concentration correspondante de la norme interne sélectionnée.
  21. Assurez-vous que la norme interne et les espèces lipidiques sélectionnées à quantifier appartiennent au même nom de classe en sélectionnant chaque espèce lipidique ajoutée et la norme interne et en tapant un nom de classe (comme PG ou Lipid) dans le champ Classe.
  22. Pour enregistrer le groupe consultable de composés lipidiques pour une utilisation future, cliquez sur le bouton Enregistrer à côté du menu Groupes.
  23. Assurez-vous que le fichier Excel contenant toutes les listes de pointe MS exportées est ouvert à la feuille correspondant à la première exécution S. aureus MS, puis cliquez sur le bouton Recherche à partir du menu principal LIMSA.
    REMARQUE : La sortie de la recherche de base de données LIMSA comprendra une liste de caractéristiques spectrales de masse appariées aux lipides présents dans la base de données construite dans les étapes 8.12-8.13, ainsi que des concentrations pour chaque entité appariée après la normalisation à une ou plusieurs sélectionnées normes internes.
  24. Utilisez le logiciel Xcalibur pour examiner la masse précise des spectres MS/MS pour les m/z correspondant aux ions lipidiques d'intérêt afin de confirmer les constituants d'acides gras présents dans chaque espèce moléculaire lipidique identifiée. Sélectionnez l'icône Qual Browser. Ouvrez le fichier d'intérêt MS/MS en sélectionnant le menu déroulant du fichier et en sélectionnant l'option Open...
  25. Sélectionnez le filtre d'analyse correspondant à l'analyse MS/MS d'un m/z lipidique d'intérêt en cliquant sur l'icône de la clé de pouce dans la fenêtre d'affichage du spectre de masse et sélectionnez Ranges du menu. Dans la nouvelle fenêtre qui s'affiche, sélectionnez le menu Filtre pour sélectionner l'analyse.
  26. Moyenne du signal à travers le chromatogramme total d'ion tel que décrit dans l'étape 8.2. Utilisez le logiciel MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) pour effectuer des tests statistiques appropriés. Évaluer la différence statistiquement significative dans la composition lipidique de S. aureus en comparant les abondances normalisées de lipides selon les conditions non traitées et lorées de LDL.

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Résultats

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Le protocole d'enrichissement du LDL à partir du jaune d'œuf de poulet est illustré à la figure 1. Ce processus commence par la dilution du jaune d'œuf entier avec salin et la séparation des solides jaune d'œuf appelés granules de la fraction soluble ou plasma contenant les LDL (Figure 1)33. La teneur en LDL de la fraction plasmatique est encore enrichie par la précipitation de la 30-40 kDa -livetins (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus intègre des acides gras exogènes dans sa membrane phospholipides27,32,43. La synthèse phospholipide utilisant des acides gras exogènes contourne l'inhibition faSII mais modifie également les propriétés biophysiques de la membrane27,32,44. Bien que l'incorporation d'acides gras exogènes dans les phospholipides d'agents...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont pas de divulgations.

Remerciements

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Nous remercions les membres du laboratoire Hammer pour leur évaluation critique du manuscrit et leur soutien à ce travail. Dr Alex Horswill de l'Université du Colorado School of Medicine aimablement fourni AH1263. Le laboratoire du Dr Chris Waters de l'Université d'État du Michigan a fourni des réactifs. Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association subvention 16SDG30170026 et les fonds de démarrage fournis par l'Université d'État du Michigan.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Sulfate d’ammoniumFisherBP212R-1&ge ; Incubateur de culture cellulaire pur à 99,5 %
ThermoMaxQ 6000
CentrafugeThermo75-217-420Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Plaque d’essai CostarCorning378896 puits
Papier filtreSchleicher & Schuell597
Grand œuf de pouleN/AN/AOeuf commun acheté en magasin
Spectrophotomètre à microplaquesBioTekEpoch 2
NaClSigmaS9625
S. aureus souche AH1263N/AN/AFourni par Alex Horswill de l’Université du Colorado
Tube de dialysePierce687007 000 MWCO
TryptoneBecton, Dickison and Company211705
billes d’oxyde de zirconium de 0,5 mmNext AdvanceZROB05
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24B
(grade LC-MS)FisherA4561
Chloroforme (grade réactif)FisherMCX10559
Isopropanol (grade LC-MS)FisherA4611
Dimyristoyl phosphatidylcholineAvanti Lipides polaires850345C-25mg
Bicarbonate d’ammoniumSigma9830&ge ;
Formiate d’ammoniumSigma70221-25G-F
Logiciel Xcalibur ThermoScientificOPTON-30801
LTQ-Orbitrap Spectromètre de masse VelosThermo Scientifichaute résolution/masse précise MS
Agilent 1260 HPLCAgilent
SpeedVac Concentrateurs de videThermo Scientific
pur à 99,5 % capillaire

Références

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Mots-clés

Isolation des LDLStaphylococcus aureusspectrom trie de masseanalyse lipidomiquepr cipitation au sulfate d ammoniummembrane de dialyseinjection en flux continu

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