Cette méthode fournit un cadre pour étudier l'incorporation des acides gras exogènes des sources hôtes complexes dans les membranes bactériennes, en particulier Staphylococcus aureus. Pour ce faire, des protocoles pour l'enrichissement des particules de lipoprotéines du jaune d'oeuf de poulet et le profilage suivant d'acide gras des phospholipides bactériens utilisant la spectrométrie de masse sont décrits.
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Article de méthode
Isolement des particules de lipoprotéine du jaune d'oeuf de poulet pour l'étude de l'incorporation d'acide gras de pathogène bactérien dans les phospholipides de membrane
Dans cet article
Résumé
Résumé
Staphylococcus aureus et d'autres pathogènes Gram-positifs incorporent les acides gras de l'environnement dans les phospholipides membranaires. Pendant l'infection, la majorité des acides gras exogènes sont présents dans les particules de lipoprotéines hôtes. L'incertitude demeure quant aux réservoirs d'acides gras hôtes et aux mécanismes par lesquels les bactéries extraient les acides gras des particules de lipoprotéines. Dans ce travail, nous décrivons des protocoles pour l'enrichissement des particules de lipoprotéine de basse densité (LDL) du jaune d'oeuf de poulet et de déterminer si les LDL servent de réservoirs d'acide gras pour S. aureus. Cette méthode exploite l'analyse lipidomique impartiale et les LDL de poulet, un modèle efficace et économique pour l'exploration des interactions entre les LDL et les bactéries. L'analyse de l'intégration de S. aureus des acides gras exogènes des LDL est effectuée en utilisant la spectrométrie de masse à haute résolution/précise et la spectrométrie de masse en tandem, permettant la caractérisation de la composition en acides gras de la bactérie membrane et identification impartiale de nouvelles combinaisons d'acides gras qui surgissent dans les lipides de membrane bactérienne lors de l'exposition aux LDL. Ces techniques avancées de spectrométrie de masse offrent une perspective inégalée de l'incorporation d'acides gras en révélant les acides gras exogènes spécifiques incorporés dans les phospholipides. Les méthodes décrites ici sont adaptables à l'étude d'autres agents pathogènes bactériens et de sources alternatives d'acides gras complexes.
Introduction
Le S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) est la principale cause d'infection associée aux soins de santé et la résistance aux antibiotiques associée est un défi clinique considérable1,2,3. Par conséquent, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est une grande priorité. Une stratégie de traitement prometteuse pour les pathogènes Gram-positifs inhibe la synthèse des acides gras, une exigence pour la production de phospholipide membranaire qui, dans S. aureus, comprend le phosphatidylglycérol (PG), lysyl-PG, et la cardiolipine
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Protocole
REMARQUE: Le protocole suivant pour l'enrichissement des particules lDL à partir du jaune d'œuf de poulet est dérivé de Moussa et al. 200233.
1. Préparation du jaune d'œuf de poulet pour l'enrichissement des particules de LDL
- Assainissez deux gros œufs de poulet en lavant les coquilles avec une solution d'éthanol à 70 % et laissez sécher à l'air.
- Assainiz le séparateur d'œufs à l'aide d'une solution d'éthanol à 70 % et laissez sécher à l'air. Fixer le séparateur d'œufs sur la lèvre d'un bécher de taille moyenne.
- Casser chaque œuf individuellement dans le séparateur d'œufs et laisser l'al....
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Résultats
Le protocole d'enrichissement du LDL à partir du jaune d'œuf de poulet est illustré à la figure 1. Ce processus commence par la dilution du jaune d'œuf entier avec salin et la séparation des solides jaune d'œuf appelés granules de la fraction soluble ou plasma contenant les LDL (Figure 1)33. La teneur en LDL de la fraction plasmatique est encore enrichie par la précipitation de la 30-40 kDa -livetins (
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Discussion
S. aureus intègre des acides gras exogènes dans sa membrane phospholipides27,32,43. La synthèse phospholipide utilisant des acides gras exogènes contourne l'inhibition faSII mais modifie également les propriétés biophysiques de la membrane27,32,44. Bien que l'incorporation d'acides gras exogènes dans les phospholipides d'agents.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont pas de divulgations.
Remerciements
Nous remercions les membres du laboratoire Hammer pour leur évaluation critique du manuscrit et leur soutien à ce travail. Dr Alex Horswill de l'Université du Colorado School of Medicine aimablement fourni AH1263. Le laboratoire du Dr Chris Waters de l'Université d'État du Michigan a fourni des réactifs. Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association subvention 16SDG30170026 et les fonds de démarrage fournis par l'Université d'État du Michigan.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Sulfate d’ammonium | Fisher | BP212R-1 | &ge ; Incubateur de culture cellulaire pur à 99,5 % |
| Thermo | MaxQ 6000 | ||
| Centrafuge | Thermo | 75-217-420 | Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE |
| Plaque d’essai Costar | Corning | 3788 | 96 puits |
| Papier filtre | Schleicher & Schuell | 597 | |
| Grand œuf de poule | N/A | N/A | Oeuf commun acheté en magasin |
| Spectrophotomètre à microplaques | BioTek | Epoch 2 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| S. aureus souche AH1263 | N/A | N/A | Fourni par Alex Horswill de l’Université du Colorado |
| Tube de dialyse | Pierce | 68700 | 7 000 MWCO |
| Tryptone | Becton, Dickison and Company | 211705 | |
| billes d’oxyde de zirconium de 0,5 mm | Next Advance | ZROB05 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24B | |
| (grade LC-MS) | Fisher | A4561 | |
| Chloroforme (grade réactif) | Fisher | MCX10559 | |
| Isopropanol (grade LC-MS) | Fisher | A4611 | |
| Dimyristoyl phosphatidylcholine | Avanti Lipides polaires | 850345C-25mg | |
| Bicarbonate d’ammonium | Sigma | 9830 | &ge ; |
| Formiate d’ammonium | Sigma | 70221-25G-F | |
| Logiciel Xcalibur Thermo | Scientific | OPTON-30801 | |
| LTQ-Orbitrap Spectromètre de masse Velos | Thermo Scientific | haute résolution/masse précise MS | |
| Agilent 1260 HPLC | Agilent | ||
| SpeedVac Concentrateurs de vide | Thermo Scientific |
Références
- Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
- Noskin, G. A., et al.
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Réimpressions et autorisations
