Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Summary

Ce protocole décrit un essai de phagocytose in vivo chez l’adulte Drosophila melanogaster pour quantifier la reconnaissance phagocyte et apurement des infections microbiennes.

Abstract

Chez tous les animaux, l’immunité innée fournit une défense immédiate et robuste contre un large spectre d’agents pathogènes. Réponse immunitaire humorale et cellulaire sont les branches principales de l’immunité innée, et bon nombre des facteurs régulant ces réponses sont conservées évolutionnaires entre les invertébrés et mammifères. La phagocytose, l’élément central de l’immunité innée cellulaire, est effectuée par des cellules de sang spécialisées du système immunitaire. La drosophile, Drosophila melanogaster, est devenue un puissant modèle génétique pour étudier les mécanismes moléculaires et les effets physiologiques de la phagocytose dans animaux entiers. Nous démontrons une analyse axée sur l’injection de phagocytose in vivo afin de quantifier l’absorption de particules et de la destruction de cellules de sang de drosophile , hemocytes. La procédure permet aux chercheurs de contrôler avec précision la concentration des particules et la dose, ce qui permet d’obtenir des résultats très reproductibles dans un court laps de temps. L’expérience est quantitative, facile à exécuter et pourront être utilisés pour dépister les facteurs de l’hôte cette influence pathogène reconnaissance, absorption et dégagement.

Introduction

Défenses immunitaires innées constituent la première ligne de défense contre les microbes pathogènes. Ces réponses se divisent sur le plan fonctionnel en immunité innée humorale et cellulaire, qui sont médiés par les récepteurs de reconnaissance de modèle codé en lignée germinale (SDRP) qui détectent les profils moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs)¹. Bon nombre des voies de signalisation et les mécanismes effecteurs de l’immunité innée sont conservés chez les mammifères et les invertébrés, tels que le nématode, Caenorhabditis elegans et la drosophile, Drosophila melanogaster,². La mouche des fruits est devenue un système puissant pour étudier la défense de l’hôte contre les microorganismes infectieux³. Drosophile est génétiquement tractable, facilement et à moindre coût élevés dans les laboratoires et a un temps de génération court. Par ailleurs, la mouche à fruit présente des défenses très efficaces contre un tableau de microbes, ce qui permet l’examen de l’immunité contre les agents pathogènes virales, bactériennes, fongiques ou parasitaires hôte.

Drosophila immunologistes ont historiquement utilisé avant écrans génétiques, génome-large-mediated RNA interférence (Arni) sélection de lignées cellulaires insectes et préexistant des souches mutantes de mouche afin d’examiner l’immunité innée – menant à la identification et caractérisation de plusieurs voies immunitaires humorales évolutivement conservés^4,5,6,7,8. La réponse immunitaire innée humorale est, sans doute, le mieux caractérisé des défenses immunitaires chez la drosophile. Suite à une infection, la réponse humorale aboutit à la production et la libération systémique de peptide antimicrobien des molécules (AMP) dans l’hémolymphe, le sang équivalent chez les insectes. Ampères sont produites par hautement conservée sans frais et de l’Imd, voies de signalisation. La voie de péage est homologue aux mammifères récepteurs TLR/IL-1R de signalisation, et la voie de l’IDM est homologue au facteur de nécrose tumorale-alpha chez les mammifères de signalisation. Drosophila, péage signalisation est induite par des bactéries gram-positives, les champignons et X de la drosophile virus^6,9,10 et Imd signalisation est induite par des bactéries à gram négatif^{11 ,},¹².

L’immunité cellulaire, composée d’encapsulation, de mélanisation et phagocytose des pathogènes invasifs, réalisée par des cellules spécialisées de sang appelées hémocytes¹³. Il existe trois classes d’hémocytes chez la drosophile : crystal cellules, lamellocytes et plasmatocytes¹³. Crystal cellules, qui représentent 5 % des hémocytes circulants chez les larves, libèrent des enzymes Phénoloxydase (proPO) conduisant à la mélanisation des pathogènes et des tissus de l’hôte au sites de plaie. Lamellocytes, qui ne sont pas normalement trouvés dans les embryons sains ou des larves, sont des cellules adhérentes qui encapsulent des objets étrangers. Ces cellules sont induites sur puparium ou lorsque les oeufs de guêpe parasite sont déposés chez les larves. Plasmatocytes phagocytaires, qui représentent 95 % de diffuser les hémocytes chez les larves et tous les hémocytes restants chez l’adulte, jouent un rôle dans le tissu transformant au cours du développement et, notamment, servir la cellule principal effecteur de l’immunité cellulaire de drosophile .

Phagocytose une ligne immédiate et cruciale de défense immunitaire innée ; les microbes qui violent la barrière épithéliale de l’hôte sont rapidement engloutis et éliminés par les cellules phagocytaires de sang (pour un examen complet de la biologie cellulaire de phagocytose voir référence ¹⁴). Ce processus se lance en reconnaissance des formes codées germline récepteurs (SDRP) sur les hémocytes reconnaissent pathogène lié profils moléculaires (PAMPs) des microbes. Une fois lié à leurs cibles, SDRP initier des cascades de signalisation qui conduisent à la formation des pseudopodes par actine cytosquelette remodelage. Les pseudopodes entourent le microbe, qui est ensuite englouti et intériorisé dans un organite naissant, le phagosome. Les microbes sont détruits comme le phagosome subit le processus de maturation du phagosome lorsque le phagosome est victimes de la traite vers l’intérieur des hémocytes et acidifie à travers une série d’interactions avec les lysosomes. In vitro et la cellule des études de biologie des cellules mammaliennes primaires ont grandement contribués à identifier et à caractériser les facteurs qui régissent la phagocytose, tels que les mammifères récepteurs Fc-gamma et C3b récepteurs^15,16. Néanmoins, la possibilité d’exécuter de grands écrans ou études in vivo sont limitées dans les systèmes mammaliens.

Nous présentons ici un essai in vivo pour phagocytose chez la drosophile adulte, qui repose sur une procédure introduite par le laboratoire de David Schneider en 2000,¹⁷. Le laboratoire de Schneider a montré que sessiles hémocytes groupées le long du vaisseau dorsal abdominal facilement phagocytent les bactéries et les billes de polystyrène. Afin de visualiser la phagocytose, les mouches sont injectées avec des particules fluorescent étiquetés (comme e. coli étiquetés avec l’isothiocyanate de fluorescéine (e. coli –FITC)), incuber pendant 30 minutes pour laisser le temps de hemocytes à phagocyter les particules, puis par injection trypan blue, qui apaise la fluorescence des particules ne pas phagocytées au cours de la période d’incubation. Bateaux mouche de dorsale est imagés puis à l’aide d’un microscope inversé à fluorescent. Cet article fondamental, à l’aide d’une expérience relativement simple, ont démontré que les hémocytes phagocytent les bactéries et billes de latex, cette phagocytose bactérienne peuvent être inhibées par l’injection de pré vole avec des billes de latex, et qui vole sans cellulaires et humorales réponses immunitaires sont sensibles même à e. coli. L’analyse présentée dans le présent rapport s’appuie sur les travaux du laboratoire Schneider pour quantifier la phagocytose in vivo en mesurant l’intensité de la fluorescence des particules englouti par les hémocytes vaisseau dorsal associé.

Semblable à l’approche adoptée dans les systèmes mammaliens, Drosophila généticiens initialement utilisé génome-large in vitro Arni écrans afin d’identifier les gènes nécessaires à la réponse immunitaire cellulaire^18,,^{19,20 ,21,22,23}. Cependant, le développement du dosage adulte phagocytose in vivo a permis des expériences suivis à effectuer facilement dans des animaux entiers, ce qui permet aux chercheurs de vérifier le biologique le rôle des facteurs identifiés dans les études in vitro. Ce fut le cas avec le récepteur transmembranaire Eater, qui fut d’abord identifié comme un récepteur bactérien dans un écran d’Arni en utilisant S2 cellules²⁴ et puis plus tard montré à la médiation d’ Escherichia coli (e. coli),, Enterococcus faecalis, et la phagocytose staphylocoque doré (Staphylococcus aureus) adultes²⁵.

Notre laboratoire employé l’essai in vivo de la phagocytose dans avancer les écrans génétiques et études d’association pangénomique (en utilisant le panneau de référence génétiques Drosophila (DGRP)) pour identifier de nouveaux gènes qui régulent la phagocytose dans les hémocytes adultes. Ces études conduisirent à la caractérisation des récepteurs PGRP-SC1A et PGRP-SA²⁶, la vésicule intracellulaire traite des protéines Rab14²⁷, le glutamate transporteur Polyphème²⁸et protéines de liaison à l’ARN Fox-1²⁹.

Nous prévoyons que les futurs écrans intégrant la phagocytose in vivo pourraient conduire à l’identification de gènes supplémentaires qui sont importants pour la réponse immunitaire cellulaire chez la drosophile. Écrans à l’aide de lignées autofécondées-séquencé, tels que la DGRP ou la drosophile synthétique Population Resource (DSPR), peuvent d’identifier les variantes naturelles qui affectent le développement de phagocytose ou hémocytes. En outre, la technique pourrait être adoptée dans d’autres espèces de drosophile ou utilisée aux nouvelles ressources communautaires d’écran, telles que la collection de 250 espèces de drosophile , maintenu par la drosophile National espèces Stock Center (NDSSC ) à Cornell. Ces expériences peuvent être effectuées à l’aide de fluorescent marqué bactérienne ou fongique-mur bioparticules qui sont disponibles dans le commerce ou peuvent être effectuées à l’aide de n’importe quel nombre de bactéries ou de champignons – visé que le microbe exprime les marqueurs fluorescents .

Protocol

1. préparer les particules de fluorescéine injectable 10 mg de bactéries tuées par la chaleur disponibles dans le commerce de reconstituer particules marqués à la fluorescéine (voir Table des matières) à une concentration de stock de 10 mg/mL en ajoutant 990 µL stérile 1 x PBS et azide de sodium 10 µL 50 mM. Vortex pour mélanger. Diviser en 8 µL d’extraits non réutilisables dans des tubes de 0,2 mL et les stocker dans une boîte sombre à 4 ° C, afin de minimiser la sensibilité associée à la lumière.Remarque : L’azoture de Sodium conservateur est facultative et peut être omis si les stocks de 10 mg/mL sont faites avec du PBS stérile 1 x de 1 mL, aliquotés et conservé à-20 ° C. Préparer une solution de 10 mL de colorant dans du PBS 1 x en mélangeant 500 µL seringue filtré nourriture verte coloration et 9,5 mL stérile 1 x PBS d’alimentaire de 5 %. Laver les particules avant l’injection pour enlever l’azoture de sodium. Mix 42 µL stérile 1 x PBS et 8 µL de 10 mg/mL dans un tube de 1,7 mL. Centrifuger à vitesse maximum pendant 2,5 min à température ambiante. Retirer le surnageant, ajouter 50 µL 1 x PBS et centrifugeuse à vitesse maximum pendant 2,5 min à température ambiante. Répétez les étapes 1.3 et 1.3.1 x 2, pour un total de 3 lavages. Après le lavage final, éliminer le surnageant et remettre en suspension les particules à 1,6 mg/mL dans 50 µL de 5 % de colorant dans du PBS 1 x alimentaire. Enrouler le tube en papier d’aluminium pour protéger de la lumière. Conserver à 4 ° C, mettre au rebut après 1 semaine. 2. préparer le poste d’injection et les mouches Préparer la garniture de l’injection. D’injecter jusqu’à 4 génotypes de mouches en même temps, utiliser du ruban laboratoire de diviser une mouche de2 CO rectangulaire pavé en 4 sections. Sur le banc près du microscope, désigner des zones de placer les flacons une fois que les mouches ont été alignés sur le clavier (un pour chaque coin du pad). Préparer les flacons de même âge, 4-7 jours-vieux, mouches pour injection. Pour chaque souche à tester, transfert 5 males et 5 femelles dans un flacon frais, marqué des aliments préparés de mouche et garder à 25 ° C. Préparer l’injecteur pneumatique (voir Table des matières) en affectant à l’instrument un mode temporisé de 100 ms (saccades de pression de gaz pour expulser le liquide – permettant la livraison de sub-nanolitres volumes). Préparer des lames de microscope. Couper des bandes de 1,5 po de ruban électrique, incorporer une boucle avec le côté adhésif sur et placer sur une lame de microscope étiquetée. 3. préparer les aiguilles capillaires de verre Tirer des aiguilles de verre (capillaires en verre à paroi fine) à l’aide d’un extracteur de l’aiguille. Tenez l’aiguille sous le microscope avec un micromètre et casser la pointe avec une pincette en acier inoxydable de fine pointe #5. 100 µm conseils ne suffisent pas à percer la cuticule de la mouche tout en minimisant les blessures. Mesurer le volume de liquide qui est injecté dans chaque volée. Chargez l’aiguille stérile 5 % nourriture à colorier dans du PBS 1 x et expulser le liquide sur une goutte d’huile minérale sur un micromètre de 0,01 mm.Remarque : Si la goutte de liquide est sphérique, le volume en picolitre est calculé comme (taille)3/1910. 30 une aiguille d’un diamètre de 100 µm éjecte 2 ~ nL à 100 ms. 4. injecter mouches Déposer 10µl de particules de 1,6 mg/mL sur un petit carré de parafilm. Tirer le liquide dans l’aiguille et monter dans la buse de l’injecteur (voir Table des matières). Anesthésier les mouches avec du CO2 et les aligner dans leur région désignée sur la flypad, avec la face ventrale vers le haut et la tête orientée vers l’avant du coussin. Placer les flacons dans les zones correspondantes sur le banc. Injecter des mouches dans le coin supérieur de l’abdomen avec 5, ms 100 pompes de liquide (au total 10 ~ nL). Transférer les mouches injectés dans les flacons appropriés, noter l’heure sur le flacon. Conserver à 25 ° C. Charger une nouvelle aiguille avec 0,4 % Solution de bleu de Trypan. Affectez l’injecteur pneumatique GATED, qui permet un débit constant d’air pour pousser le liquide hors de l’aiguille. Anesthésier les mouches après que qu’ils ont reposé pendant 30 min et injecter avec le bleu Trypan, jusqu’à ce que l’abdomen est plein et distendu.Remarque : Lorsqu’on examine la maturation phagosome avec particules marqués par un agent sensibles au pH, permettent des mouches se reposer pendant 1 h et ne pas injecter avec trypan bleu avant le montage de mouches. Monter les mouches sur lames de microscope avec du chatterton, la face ventrale vers le bas. Pousser les ailes sur le côté de la mouche et les fixer au ruban. En outre, poussez doucement la tête dans le ruban adhésif pour s’assurer que la mouche ne bougera pas. Passer immédiatement à l’étape 5. 5. imagerie mouches Image d’oiseau, un à la fois, à 25 x ou 32 x grossissement, à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé attaché à un appareil photo numérique et l’ordinateur (voir Table des matières). Mettre l’accent sur le vaisseau dorsal de la volée en utilisant des logiciels pour l’appareil photo numérique. Enregistrer le temps d’exposition et de grossissement entre les expériences.NOTE : Perdre la trace des génotypes est une source potentielle d’erreur lorsque vous photographiez des souches multiples en une seule séance. Pour éviter un étiquetage erroné de mouches, notez le numéro de l’image de la première et la dernière photographie de mouche pour chaque génotype. 6. quantification et normaliser la fluorescence Ouvrez le logiciel et ouvrir une image à la fois. Mesurer l’intensité de la fluorescence du vaisseau dorsal. Dessiner un polygone autour du vaisseau dorsal. Sélectionnez la mesure et enregistre l’intensité de fluorescence à l’intérieur du polygone. Déterminer l’intensité de fluorescence de fond. Copiez le premier polygone et le déplacer dans une zone adjacente au vaisseau dorsal de la mouche. Sélectionnez la mesure et l’intensité de fluorescence record de la zone d’arrière-plan. Normaliser la fluorescence de vaisseau dorsal de la fluorescence de fond :Fond de ÷ vaisseau dorsal. Calculer que la moyenne normalisée d’intensité de fluorescence du vaisseau dorsal de toutes les mouches dans une souche. Répétez l’expérience 2 fois plus. Utiliser un étudiant de non appariés t-test pour comparer les intensités de fluorescence relative moyenne des mouches de contrôle et d’essai à partir les trois expériences. Calculer la taille de l’effet en utilisant la formule : Cohen d = (M – M12) ÷ SDmis en commun, où M1 correspond à la moyenne de génotype 1 et M2 correspond à la moyenne du génotype 2 &SD mise en commun =où SD1 est l’écart-type de génotype 1 et SD2 est l’écart-type du génotype 2.

Representative Results

Une représentation schématique de l’essai de phagocytose in vivo à l’aide de particules marqué à la fluorescéine est montrée dans la Figure 1 a. Les mouches sont monté sur la face ventrale vers le bas sur un morceau de ruban isolant et les deux premiers segments de l’abdomen, où se trouve le vaisseau dorsal, est clairement visible (Figure 1 b). Principales sources d’erreurs expérimentales se posent à l’inject…

Discussion

Disponibles dans le commerce, fluorescent étiquetés de particules sont utilisés pour évaluer la phagocytose en général (0,2 µm carboxylate-modified microsphères) ou la phagocytose des microbes (chaleur – fluorescent-étiquetés ou chimiquement tués bactéries ou levures). Afin d’évaluer la maturation phagosome, chercheurs peuvent sélectionner des particules marqués par un agent sensibles au pH qui émet une fluorescence quand le pH diminue de neutre à acide, comme dans le phagolysosome. Altern…

Materials

0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres	Invitrogen	F8810	Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	E13231	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	E23370	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	P35361	Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	A10010	Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	S23371	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	S23372	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2851	Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)	Zeiss	SteREO Discovery.V8	Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Z23373	Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	Z23374	Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	Z2841	Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red	Invitrogen	Z2843	Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)