Article de méthode

Préparation de nanoparticules polymériques à charge neutralement et sensibles au pH pour la livraison de siRNA cytosoliques

DOI :

10.3791/59549

⸱

2 mai 2019

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1Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, 2Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi, 3Biomedical Engineering Program, University of Mississippi

Dans cet article

Résumé

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On présente des méthodes pour préparer et caractériser les propriétés physico-chimiques et la bioactivité des nanoparticules de siRNA à charge neutrale et à pH réactif. On discute des critères pour les nanomédites siRNA réussis tels que la taille, la morphologie, la charge superficielle, le chargement de siRNA et le silençage génique.

Résumé

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Le succès de la siRNA en tant que médecine moléculaire ciblée dépend de sa délivrance efficace de cytosoliques aux cellules dans le tissu de la pathologie. Le succès clinique pour le traitement des cibles de maladies hépatiques précédemment «non-droguables» avec siRNA a été atteint. Cependant, la livraison efficace de siRNA tumoral nécessite des considérations de conception pharmacocinétique supplémentaires, y compris le temps de longue circulation, l’évasion des organes de clairance (par exemple, le foie et les reins), et la pénétration et la rétention des tumeurs. Ici, nous décrivons la préparation et la caractérisation physicochimique/biologique in vitro des nanoparticules polymériques conçues pour une administration efficace de siRNA, en particulier pour les tissus non hépatiques tels que les tumeurs. Les nanoparticules de siRNA sont préparées par complexation électrostatique de siRNA et le poly copolymère dibloc (éthylène glycol-b-[2-(diméthylamino) éthyl méthacrylate-co-butyl méthacrylate]) (PEG-dB) pour former des complexes polyioniques ( polyplexes) où le siRNA est séquestré dans le noyau Polyplex et le PEG forme une couronne hydrophile à charge neutralement. De plus, le bloc DB devient membranaire comme vésicules de la voie endolysosomale acidifiante (< pH 6,8), déclenchant l’évasion endosomique et la délivrance cytosolique de siRNA. On décrit les méthodes permettant de caractériser les caractéristiques physico-chimiques des nanoparticules de siRNA telles que la taille, la charge superficielle, la morphologie des particules et le chargement de siRNA. La bioactivité des nanoparticules de siRNA est mesurée à l’aide de la luciférase comme gène modèle dans un test de silençage génique rapide et à haut débit. Les conceptions qui passent ces tests initiaux (tels que les polyplexes à base de PEG-DB) sont jugées appropriées pour la traduction à des études précliniques d’animaux évaluant la livraison du siRNA aux tumeurs ou à d’autres sites de pathologie.

Introduction

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Parce que les siRNAs inhibent la traduction des protéines des séquences d’ARNm, ils peuvent théoriquement être utilisés pour le médicament toutes les pathologies connues1,2,3,4,5. Cependant, l’utilisation de siRNA en médecine est limitée par le profil pharmacocinétique globalement médiocre des molécules de siRNA6,7. Lorsqu’elles sont injectées par voie intraveineuse, les siRNAs sont rapidement déblayés par les reins et/ou dégradés par les nucléases<....

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Protocole

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1. préparation et caractérisation des si-NPs

  1. préparation du si-NP
    1. Dissoudre le polymère dans un tampon d’acide citrique de 10 mM (pH 4,0) à 3,33 mg/mL. Le polymère peut d’abord être dissous à une concentration de 10x dans l’éthanol pour assurer la dissolution.
      Remarque: le polymère peut être dissous à des concentrations plus faibles, mais l’utilisation à des concentrations supérieures à 3,33 mg/mL peut empêcher la formation de NP homogène.
    2. Ajouter le siRNA (50 μM dans diH2O) pour aboutir à N+:P- ratio de 10. Mélanger soigneusement les solutions de polymère et siRNA par pipetage et laisser incuber pendant....

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Résultats

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Certaines caractéristiques essentielles d’un si-NPs efficace pour la livraison de siRNA in vivo sont la taille appropriée (~ 20 – 200 nm de diamètre), l’emballage de siRNA, et la bioactivité de silençage génique. Bien qu’il ne s’agit pas d’une liste exhaustive (telle que abordée dans la discussion), ces caractéristiques de base devraient être confirmées avant d’envisager d’autres essais d’une formulation.

La

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Discussion

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Les si-NPs décrits ici sont formés par l’association électrostatique de siRNA anionique et de polymères cationiques en complexes POLYIONS (polyplexes). Le complexage électrostatique du siRNA et du bloc de DB cationique des polymères PEG-DB est facilité par un mélange à faible pH (4,0). À pH 4,0, le DMAEMA est fortement protoné, et par conséquent le bloc de DB est fortement chargé. Cela garantit que les polymères se dissolvent comme unimères en solution par opposition à former des micelles et que DB complexes efficacement.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne divulguent aucun conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

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Les auteurs sont reconnaissants aux Drs Craig Duvall et Rebecca Cook d’avoir accès aux données et aux ressources de laboratoire pour mener cette recherche. Les auteurs sont reconnaissants à l’Institut Vanderbilt pour la science et l’ingénierie nanométrique (VINSE) d’avoir accès aux instruments DLS et TEM (NSF EPS 1004083). Les auteurs sont reconnaissants à la National Science Foundation de soutenir le programme de bourses de recherche des diplômés (NSF # 1445197). Les auteurs sont reconnaissants aux instituts nationaux de la santé pour leur soutien financier (NIH R01 EB019409). Les auteurs sont reconnaissants au ministère de la défense du programme de recherche médica....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,45 μ ; Filtres pour seringuesThermo Fisher ScientificF2513317 mm de diamètre, membrane PTFE
0-14 bandelettes de test de pHMillipore SigmaP4786
10x tampon TAEThermo Fisher Scientific/InvitrogenAM9869
6-7,7 bandelettes de test de pHMillipore SigmaP3536
96 puits à paroi noireCorning3603Poudre d’agarose traitée par culture tissulaire
Thermo Fisher Scientific/Invitrogen16500
Acide citrique monohydratéMillipore SigmaC1909
phosphate de sodium dibasique dihydratéMillipore Sigma71643
D-luciférineThermo Fisher Scientific88294Sel monopotassique
DMEMGibco11995065Éthanol à haute teneur en glucose et en pyruvate
Millipore Sigma459836
bromure d’éthidiumThermo Fisher Scientific/Invitrogen15585011
FBSGibco26140079
colorant de chargementThermo Fisher Scientific/InvitrogenR0611
Luciferase siRNAIDTN/ASéquense de brin antisens : GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC
AAUUGUU
Sense Strand Sequense : CAAUUGCACU
GAUAAUGAACUCCT*C* * Bases d’ADN
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) Cellules stablesGenTarget IncSC059-BsdCellules exprimant la luciférase poursuivies pour évaluer la bioactivité du si-NP
de sodium monobasiquemonohydraté Millipore SigmaS9638
SiRNA SCARMBLEDIDTN/ ASéquence de brins antisens : AUACGCGUAUU
AUACGCGAUUAACGAC
Sense Strand Sequense : CGUUAAUCGCGUAUAAUAC
GCGUA*T* *DNA bases
cuvettes carrées en polystyrèneFisher Scientific14-955-129d’une capacité de 4,5 mL
Ted Pella, Inc.1GC50PELCO Grilles marquées au centre, 50 mailles, 3,0 mm de diamètre extérieur, cuivre
citrate trisodique dihydratéMillipore SigmaS1804
acétate d’uranylePolysciences, Inc.Référence 21447-25
phosphate Grilles TEM

Références

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  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  2. Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mam....

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Mots-clés

Diffusion dynamique de la lumi reMicroscopie lectronique transmissionRetardement sur gel d agarosevasion endosomalePolym re sensible au pHD livrance cytosoliqueEssai d extinction g nique

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