Article de méthode

Préparation de nanoparticules polymériques à charge neutralement et sensibles au pH pour la livraison de siRNA cytosoliques

DOI :

10.3791/59549

⸱

2 mai 2019

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, 2Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi, 3Biomedical Engineering Program, University of Mississippi

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

On présente des méthodes pour préparer et caractériser les propriétés physico-chimiques et la bioactivité des nanoparticules de siRNA à charge neutrale et à pH réactif. On discute des critères pour les nanomédites siRNA réussis tels que la taille, la morphologie, la charge superficielle, le chargement de siRNA et le silençage génique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le succès de la siRNA en tant que médecine moléculaire ciblée dépend de sa délivrance efficace de cytosoliques aux cellules dans le tissu de la pathologie. Le succès clinique pour le traitement des cibles de maladies hépatiques précédemment «non-droguables» avec siRNA a été atteint. Cependant, la livraison efficace de siRNA tumoral nécessite des considérations de conception pharmacocinétique supplémentaires, y compris le temps de longue circulation, l’évasion des organes de clairance (par exemple, le foie et les reins), et la pénétration et la rétention des tumeurs. Ici, nous décrivons la préparation et la caractérisation physicochimique/biologique in vitro des nanoparticules polymériques conçues pour une administration efficace de siRNA, en particulier pour les tissus non hépatiques tels que les tumeurs. Les nanoparticules de siRNA sont préparées par complexation électrostatique de siRNA et le poly copolymère dibloc (éthylène glycol-b-[2-(diméthylamino) éthyl méthacrylate-co-butyl méthacrylate]) (PEG-dB) pour former des complexes polyioniques ( polyplexes) où le siRNA est séquestré dans le noyau Polyplex et le PEG forme une couronne hydrophile à charge neutralement. De plus, le bloc DB devient membranaire comme vésicules de la voie endolysosomale acidifiante (< pH 6,8), déclenchant l’évasion endosomique et la délivrance cytosolique de siRNA. On décrit les méthodes permettant de caractériser les caractéristiques physico-chimiques des nanoparticules de siRNA telles que la taille, la charge superficielle, la morphologie des particules et le chargement de siRNA. La bioactivité des nanoparticules de siRNA est mesurée à l’aide de la luciférase comme gène modèle dans un test de silençage génique rapide et à haut débit. Les conceptions qui passent ces tests initiaux (tels que les polyplexes à base de PEG-DB) sont jugées appropriées pour la traduction à des études précliniques d’animaux évaluant la livraison du siRNA aux tumeurs ou à d’autres sites de pathologie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parce que les siRNAs inhibent la traduction des protéines des séquences d’ARNm, ils peuvent théoriquement être utilisés pour le médicament toutes les pathologies connues1,2,3,4,5. Cependant, l’utilisation de siRNA en médecine est limitée par le profil pharmacocinétique globalement médiocre des molécules de siRNA6,7. Lorsqu’elles sont injectées par voie intraveineuse, les siRNAs sont rapidement déblayés par les reins et/ou dégradés par les nucléases8,9. En raison de sa grande taille et de sa charge négative, siRNA ne peut pas pénétrer dans les cellules ou échapper à la voie endolysosomale pour accéder au complexe de silençage induit par l’ARN (RISC) qui réside dans le cytosol10,11,12, le 13. Ainsi, des efforts considérables ont porté sur la conception et la mise en œuvre des stratégies de livraison du siRNA14. Cet effort s’est largement concentré sur le développement de nanoparticules à base de lipides et de polymères qui emballez le siRNA, le protègent contre le dégagement et la dégradation in vivo, et initient l’absorption cellulaire et l’évasion endosomique par des groupes ionisables et cationiques d’amine. De nombreux succès précliniques ont été rapportés et, plus récemment, le premier succès clinique a été rapporté pour l’administration de siRNA hépatiques à base de nanoparticles pour traiter l’amylose à médiation transthyrétine héréditaire (hATTR)15.

Il y a beaucoup de gènes causant le cancer qui sont actuellement «undruggable» par la pharmacologie conventionnelle (c.-à-d. les médicaments de petite molécule), motivant la conception des nanoparticules de siRNA polymériques (si-NPs) pour traiter le cancer16. Cependant, il existe un ensemble distinct de paramètres de conception qui doivent être pris en compte pour la livraison de siRNA non hépatique. Le système de livraison doit protéger la charge cationique du Polyplex qui provoque une agglutination dans la circulation systémique17,18,19. Pour la délivrance de tumeurs, plus précisément, la stabilité du si-NP est essentielle pour doter la longue circulation et donc l’accumulation accrue dans les tumeurs par l’effet de perméabilité et de rétention améliorée (EPR)20,21. En outre, le contrôle de la taille de si-NP est essentiel puisque seulement des nanoparticules approximativement 20 – 200 nm de diamètre dans l’effet de levier de taille EPR22, et les plus petits Si-NPS (~ 20 – 50 nm de diamètre) montrent une pénétration tumorale améliorée sur des nanoparticules de plus grande taille et microparticules23.

Pour répondre à ces contraintes de conception supplémentaires pour la délivrance de tumeurs systémiques du siRNA après administration intraveineuse, des si-NPs sensibles au pH, à charge neutralement, ont été développés (figure 1)24. Ces si-NPs sont PEGylated, ou plus récemment, Zwitterionated25, pour la charge de surface neutre et la résistance à l’adsorption des protéines et l’opsonisation en circulation. Puisqu’ils ne peuvent pas compter uniquement sur le caractère cationique pour conduire l’accouchement intracellulaire, une évasion endosomique extrêmement efficace est indispensable pour obtenir un silencieux génique puissant. En conséquence, le noyau de ces si-NPs est composé d’un noyau hautement endosomolytique qui est inerte au pH extracellulaire (7,4), mais qui est déclenché de manière semblable aux commutateurs dans les conditions acidifiées de la voie endolysosomale [pH 6,8 (endosomes précoces) – 5,0 ( lysosomes)]. Enfin, un mélange de contenu cationique et hydrophobe dans le noyau du si-NPs fournit des forces de stabilisation électrostatique et van der Waals, améliorant la stabilité du si-NPs dans le sang par rapport aux systèmes simplement cationiques.

L’intégration de nombreuses fonctions dans une conception relativement simple est possible en utilisant réversible addition-fragmentation chaîne transfert (RAFT) contrôlée de polymérisation pour produire des polymères avec une architecture complexe et une composition précise. Pour produire du si-NPs avec une charge de surface neutre, une réactivité au pH et une stabilité NP, RAFT est utilisé pour synthétiser du poly (éthylène glycol-b-[2-(diméthylamino) éthyle méthacrylate de méthacrylate deco-butyle]) (PEG-DB; Figure 1a). Le PEG-DB est complexé par électrostatiquement avec le siRNA, formant le si-NPs avec une Corona de PEG et un noyau de DB/siRNA (figure 1b). Le PEG forme une couche hydrophile inerte et neutralement chargée sur la Couronne si-NP. Le bloc de DB se compose d’un ratio molaire de 50:50 de 2-(diméthylamino) éthyl méthacrylate (DMAEMA) et de méthacrylate de butyle (BMA). DMAEMA cationique complexe électrostatiquement des siRNA à charge négative. Les auto-associés BMA dans le noyau NP par les interactions de van der Waals, augmentant la stabilité de NP. Ensemble, le DMAEMA et le BMA transmettent un comportement lytique lipidique dépendant du pH au bloc polymère DB. Au pH extracellulaire, le bloc de DB est séquestré au noyau si-NP et est inerte aux bilayers lipidiques. Dans des conditions acides, telles que celles de la voie endolysosomale, le DMAEMA ionisable dans le bloc de DB facilite l’effet de l’éponge de proton, où le tampon endosomique conduit à un gonflement osmotique et à une rupture26. En outre, les fractions hydrophobes de BMA dans le bloc de DB s’intègrent activement et lyse les bicouches lipidiques, entraînant une endosomolyse puissante. Ainsi, siRNA est complexé avec PEG-DB pour former des Si-NPS qui sont neutralement chargés et très stables au pH extracellulaire, mais qui perturbent les bicouches lipidiques à pH acide, assurant la livraison cytosolique de la charge utile siRNA.

Dans les présentes sont décrits les procédures expérimentales pour produire si-NPs de PEG-DB. Les méthodes permettant de caractériser les paramètres physicochimiques et la bioactivité des si-NPs sont présentées et discutées. Afin d’évaluer rapidement la bioactivité du si-NP, la luciférase est utilisée comme gène modèle pour les études de renversement. Luciferase Firefly est la protéine responsable de la «lueur» des lucioles27. En conséquence, les cellules de mammifères transfectées avec le gène luciférase Firefly produisent une «lueur» bioluminescente qui peut être capturée à l’aide d’un luminomètre pour quantifier les niveaux d’expression de la luciférase. Ici, nous utilisons Luciferase pour évaluer la bioactivité de si-NPs en livrant siRNA contre luciferase et en quantifiant la réduction correspondante de la bioluminescence dans les cellules exprimant la luciférase par rapport aux cellules qui reçoivent un siRNA brouillé.

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Protocole

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1. préparation et caractérisation des si-NPs

  1. préparation du si-NP
    1. Dissoudre le polymère dans un tampon d’acide citrique de 10 mM (pH 4,0) à 3,33 mg/mL. Le polymère peut d’abord être dissous à une concentration de 10x dans l’éthanol pour assurer la dissolution.
      Remarque: le polymère peut être dissous à des concentrations plus faibles, mais l’utilisation à des concentrations supérieures à 3,33 mg/mL peut empêcher la formation de NP homogène.
    2. Ajouter le siRNA (50 μM dans diH2O) pour aboutir à N+:P- ratio de 10. Mélanger soigneusement les solutions de polymère et siRNA par pipetage et laisser incuber pendant 30 min. Le rapport N+:P représente le nombre de groupes d’amines chargés positivement sur le polymère et le nombre de groupes de phosphates chargés négativement sur le siRNA et est calculé par la formule ci-dessous:
      figure-protocol-1
      où, mol Pol est la quantité molaire de polymère, l’amine RU est le nombre d’unités répétées d’amines positivement chargées par polymère, mol siRNA est la quantité molaire de siRNA, et BP siRNA est le nombre de paires de base par molécule de siRNA.
    3. Ajouter un excès de 5 fois de tampon phosphate de 10 mM (pH 8,0) et mélanger doucement soit en pipetant, soit en invertant le tube. Pour confirmer que le pH final est neutre (~ 7,2-7,5), Pipetter 10 μL de solution si-NP sur des bandelettes de test de pH.
      Remarque: les tampons d’acide citrique et de phosphate sont préparés selon les graphiques du centre de référence des tampons Millipore Sigma.
  2. Caractérisation physicochimique des si-NPs
  3. Enregistrez la taille et la charge surfacique des si-NPs résultants en utilisant la diffusion dynamique de la lumière (DLS). Préparer un échantillon de DLS en filtrant 1 mL de si-NPs (0,1 – 1,0 mg/mL) à travers des filtres de seringue de taille de pores de 0,45 μm dans une cuvette carrée de quartz ou de polystyrène. Mesure de la taille des enregistrements et des frais de surface à l’aide d’un instrument DLS selon les spécifications du fabricant.
    1. Confirmer la taille et la morphologie du si-NPs par analyse d’imagerie à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM).
      1. Ajouter 5 μL de solution si-NP à 1 mg/mL aux grilles TEM et incuber pour 60 s. sécher pendant 3 s.
      2. Ajouter 5 μL de solution d’acétate d’uranyle à 3% et incuber pendant 20 s. sécher pendant 3 s. sécher les grilles pendant la nuit sous dessiccation.
      3. Grilles d’image selon le protocole établi pour le microscope spécifique à utiliser.
    2. Caractériser le chargement de siRNA dans le si-NPs à divers ratios N +:P en utilisant le retardement de gel d’d’agarose.
      1. Pour produire 2% de gel d’d’agarose, ajouter 2 g de poudre d’d’agarose de grade d’électrophorèse à 100 mL de tampon de 1x TAE (tris-acétate-EDTA) à pH 8,0. Remuer pour suspendre l’agarose. La chaleur est découverte au micro-ondes jusqu’à dissolution de tous les d’agarose (1-3 min).
      2. Une fois refroidi, ajouter 5 μL de bromure d’éthidium (10 mg/mL en H2O) et bien mélanger. Versez l’d’agarose dans un plateau de gel et placez le peigne pour produire des puits, en laissant sécher pendant 30 min. Enlevez délicatement le peigne pour laisser derrière les puits de chargement, et remplissez le plateau de gel à la ligne de remplissage maximum avec 1x tampon TAE.
      3. Générez des si-NPs (selon la procédure ci-dessus) à 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20, et 40 N+:P- ratios. Placer 2 μL d’aliquotes de colorant de chargement (sans SDS et agents réducteurs) sur pellicule de paraffine pour chaque formulation de si-NP. Mélanger 10 μL de solution si-NP avec le colorant de chargement sur le film de paraffine par pipette.
      4. Ajouter des solutions de teinture si-NP/Loading aux puits de gel d’d’agarose. Exécutez la source de tension à 100 V pour 35 min (ou jusqu’à ce que les échantillons aient parcouru 80% de la longueur du gel).
      5. Visualisez les bandes de siRNA sur un Transilluminateur UV selon les spécifications du fabricant.

2. détermination de la bioactivité in vitro du si-NPs

  1. Renversement du gène modèle luciférase
    1. Générez la luciférase si-NPs (selon la procédure ci-dessus) en utilisant la luciférase siRNA et les si-NPs brouillés en utilisant une séquence de siRNA brouillée comme un contrôle. Formualte les deux si-NPs à la même finale N+:P- ratio et au rapport optimal identifiés par des études de retardement de gel d’d’agarose. Exemples de séquences de siRNA sont incluses dans la table des matières.
    2. Cellules exprimant la luciférase des semences [MDA-MB-231/luciférase (BSD) cellules stables] dans 96-puits à parois noires à une densité de 2 000 cellules par puits. Permettre d’adhérer pendant la nuit dans un support complet (DMEM, 10% FBS) dans un incubateur (37 ° c, 5% CO2, 95% d’humidité).
    3. Diluer le si-NPs dans des milieux sériques complets pour un volume final de 100 μL par puits et une concentration de siRNA de 100 nM. Traitez les cellules pendant 24 h avec le si-NPs.
    4. Après 24 h, enlever les traitements et remplacer les fluides par des milieux sériques complets contenant 150 μg/mL de D-luciférine. Incuber les cellules pendant 5 min avant de mesurer la luminescence sur un lecteur de plaque ou un système d’imagerie optique in vivo selon les spécifications du fabricant.
    5. Remplacez les milieux contenant de la luciférine par des milieux sériques frais et pleins et incubez 24 h de plus. Répétez l’étape ci-dessus, en enlevant le support et en le remplaçant par des milieux sériques complets contenant 150 μg/mL de D-luciférine, suivis d’une incubation de 5 min avant de mesurer la luminescence au point de temps de 48 h.
    6. Pour les études longitudinales, maintenir les cellules dans des conditions stériles tout en mesurant la luminescence. Continuez à la culture dans les médias frais et pleins entre les mesures après avoir remplacé le contenant de luciférine.
      NOTE: la concentration de siRNA appropriée variera avec différentes molécules de si-NPs et de siRNA. Lors de l’utilisation de polyplexes à charge neutrale avec un noyau endosomolytique (p. ex. PEG-DB), 100 nM est généralement bien toléré par les cellules et produit > 75% de luciférase knockdown. Le ratio de masse de PEG-DB à siRNA à 10 N+:P- ratio et 100 nm siRNA traitements (en supposant 26 BP sirna) est 23,3, c.-à-d., ajouter 23,3 ng de PEG-DB pour chaque 1,0 ng de siRNA. Par exemple, ajouter 1,16 μL de 3,33 mg/mL de polymère pour 166,5 ng de siRNA pour traiter un puits à 100 nM dans une plaque de 96 puits (100 mL de volume de support par puits).

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Résultats

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Certaines caractéristiques essentielles d’un si-NPs efficace pour la livraison de siRNA in vivo sont la taille appropriée (~ 20 – 200 nm de diamètre), l’emballage de siRNA, et la bioactivité de silençage génique. Bien qu’il ne s’agit pas d’une liste exhaustive (telle que abordée dans la discussion), ces caractéristiques de base devraient être confirmées avant d’envisager d’autres essais d’une formulation.

La

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les si-NPs décrits ici sont formés par l’association électrostatique de siRNA anionique et de polymères cationiques en complexes POLYIONS (polyplexes). Le complexage électrostatique du siRNA et du bloc de DB cationique des polymères PEG-DB est facilité par un mélange à faible pH (4,0). À pH 4,0, le DMAEMA est fortement protoné, et par conséquent le bloc de DB est fortement chargé. Cela garantit que les polymères se dissolvent comme unimères en solution par opposition à former des micelles et que DB complexes efficacement...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne divulguent aucun conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs sont reconnaissants aux Drs Craig Duvall et Rebecca Cook d’avoir accès aux données et aux ressources de laboratoire pour mener cette recherche. Les auteurs sont reconnaissants à l’Institut Vanderbilt pour la science et l’ingénierie nanométrique (VINSE) d’avoir accès aux instruments DLS et TEM (NSF EPS 1004083). Les auteurs sont reconnaissants à la National Science Foundation de soutenir le programme de bourses de recherche des diplômés (NSF # 1445197). Les auteurs sont reconnaissants aux instituts nationaux de la santé pour leur soutien financier (NIH R01 EB019409). Les auteurs sont reconnaissants au ministère de la défense du programme de recherche médicale dirigée par le Congrès pour le soutien financier (DOD CDMRP OR130302).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,45 μ ; Filtres pour seringuesThermo Fisher ScientificF2513317 mm de diamètre, membrane PTFE
0-14 bandelettes de test de pHMillipore SigmaP4786
10x tampon TAEThermo Fisher Scientific/InvitrogenAM9869
6-7,7 bandelettes de test de pHMillipore SigmaP3536
96 puits à paroi noireCorning3603Poudre d’agarose traitée par culture tissulaire
Thermo Fisher Scientific/Invitrogen16500
Acide citrique monohydratéMillipore SigmaC1909
phosphate de sodium dibasique dihydratéMillipore Sigma71643
D-luciférineThermo Fisher Scientific88294Sel monopotassique
DMEMGibco11995065Éthanol à haute teneur en glucose et en pyruvate
Millipore Sigma459836
bromure d’éthidiumThermo Fisher Scientific/Invitrogen15585011
FBSGibco26140079
colorant de chargementThermo Fisher Scientific/InvitrogenR0611
Luciferase siRNAIDTN/ASéquense de brin antisens : GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC
AAUUGUU
Sense Strand Sequense : CAAUUGCACU
GAUAAUGAACUCCT*C* * Bases d’ADN
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) Cellules stablesGenTarget IncSC059-BsdCellules exprimant la luciférase poursuivies pour évaluer la bioactivité du si-NP
de sodium monobasiquemonohydraté Millipore SigmaS9638
SiRNA SCARMBLEDIDTN/ ASéquence de brins antisens : AUACGCGUAUU
AUACGCGAUUAACGAC
Sense Strand Sequense : CGUUAAUCGCGUAUAAUAC
GCGUA*T* *DNA bases
cuvettes carrées en polystyrèneFisher Scientific14-955-129d’une capacité de 4,5 mL
Ted Pella, Inc.1GC50PELCO Grilles marquées au centre, 50 mailles, 3,0 mm de diamètre extérieur, cuivre
citrate trisodique dihydratéMillipore SigmaS1804
acétate d’uranylePolysciences, Inc.Référence 21447-25
phosphate Grilles TEM

Références

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Diffusion dynamique de la lumi reMicroscopie lectronique transmissionRetardement sur gel d agarosevasion endosomalePolym re sensible au pHD livrance cytosoliqueEssai d extinction g nique

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