Cibler les agrégats alpha synuclein dans les fibres nerveuses périphériques cutanées par l'évaluation de l'immunofluorescence flottante

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour un test d'immunofluorescence indirecte flottant sur les sections de biopsie de peau qui permet l'identification des variantes spécifiques de conformation de la maladie de la synuclein alpha impliquée dans la maladie de Parkinson et les protéines multiples du système nerveux périphérique.

Résumé

À ce jour, pour la plupart des maladies neurodégénératives, seul un diagnostic histopathologique post-mortem définitif est disponible. Pour la maladie de Parkinson (PD), le diagnostic repose toujours seulement sur des signes cliniques de la participation motrice qui apparaissent plus tard dans le cours de la maladie, quand la plupart des neurones dopaminergiques sont déjà perdus. Par conséquent, il y a un fort besoin d'un biomarqueur qui puisse identifier les patients au début de la maladie ou au risque de le développer. Au cours des dernières années, la biopsie de la peau s'est avérée être un excellent outil de recherche et de diagnostic pour les maladies nerveuses périphériques telles que la neuropathie des petites fibres. Fait intéressant, une petite neuropathie de fibre et des dépôts neuronaux alpha synucléines ont été montrés par biopsie de peau dans les patients de. En effet, la biopsie de la peau a le grand avantage d'être une procédure facilement accessible, peu invasive et indolore qui permet l'analyse du tissu nerveux périphérique enclin à la pathologie. En outre, la possibilité de répéter la biopsie de peau au cours du suivi du même patient permet d'étudier la corrélation longitudinale avec la progression de la maladie. Nous avons mis en place un protocole fiable normalisé pour étudier la présence des agrégats de Syn dans les fibres nerveuses de peau du patient de. Ce protocole implique peu d'étapes courtes de fixation, une section cryotome et puis une double coloration d'immunofluorescence flottante avec deux anticorps spécifiques : anti-produit de gène de protéine 9.5 (PGP9.5) pour marquer les fibres cutanées de nerf et anti 5G4 pour détecter Agrégats Syn. Il s'agit d'un protocole polyvalent, sensible et facile à exécuter qui peut également être appliqué pour cibler d'autres protéines d'intérêt dans les nerfs de la peau. La capacité de marquer les agrégats de Syn est un autre pas en avant à l'utilisation de la biopsie de peau comme outil pour établir un diagnostic histopathologique pré-mortem de.

Introduction

La biopsie de la peau a acquis une grande importance en tant qu'outil de diagnostic et de recherche dans le domaine des troubles neurologiques¹. En effet, l'épiderme et le derme contiennent d'abondantes fibres nerveuses sensorielles somatiques (myélinisés et non myélinistielles), des terminaisons nerveuses sans nociceptive, des récepteurs sensoriels et une innervation autonome des glandes sudoripares, des vaisseaux, des glandes sébacées et des pilorum ^{d'arrector musculaires. 2}.

Au milieu du XXe siècle, la configuration de l'immunohistochimie de l'anticorps PGP9.5 a permis l'évidence....

Protocole

Le protocole a été approuvé par le Comité cantonal d'éthique et tous les sujets inscrits ont donné leur consentement éclairé écrit à l'étude.

1. Collection de biopsie de peau

1. Laissez un médecin qualifié effectuer la biopsie de la peau dans un cadre clinique approprié.
2. Choisissez la zone pour effectuer la biopsie de la peau et nettoyez-la avec un écouvillon d'alcool.
3. Préparer la solution anesthésique avec 1 cc de lidocaïne 2%.
4. Avec l'aiguille parallèle à la région, injecter sous-cutanée l'anesthésie locale.
5. Après avoir vérifié l'effet de l'anesthésie, prendre le poinçon jetable de 3 mm et app....

Résultats

Après la procédure décrite (Figure 1), nous avons détecté des agrégats de Syn, étiquetés avec l'anticorps 5G4, dans les fascicles de nerf dermique intériorisant des structures autonomes des patients de. La morphologie des dépôts d'alpha-synucléine apparaît comme un signal pointillé le long des axones des nerfs dermiques (Figure 2). En effet, en exploitant ce protocole dans 19 patients de et 17 contrôles dans des biopsies de peau à trois emplacement anatomique (c.......

Discussion

Nous décrivons un analyse d'immunofluorescence flottante pour des biopsies de peau pour le diagnostic de : il exploite l'immunostaining double avec l'anticorps anti-PGP9.5, un marqueur panaxonal, et anti-5G4, un anticorps spécifique de conformation qui reconnaît la forme agrégée de Syn.

Les grands avantages de la biopsie de peau pour le but diagnostique dans la MP et probablement dans d'autres désordres conformationnels de protéine sont : 1) l'accès direct au tissu nerveux enclin à la maladie .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5G4 (anti humain &alpha ; Syneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Souris monoclonale  ;
AlexaFluor 488 Chèvre anti Lapin IgG  ;	Invitrogen	1971418	2 mg/mL
AlexaFluor 594 Chèvre anti IgG de souris  ;	Invitrogen	1922849	2 mg/mL
d’hydrogénophosphate disodique	Merk Millipore	106586
Éthylène glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycérol	Sigma-Aldrich	G7757
Monochlorhydrate de L-lysine	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldéhyde	Aldrich Chimie
PGP9.5	Abcam	ab15503	Chlorure de sodium polyclonal
	de lapin Sigma  ;	S3014
Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté	Merck Millipore	106346
(méta)periodate de sodium  ;	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma  ;	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield  ;	Vector Laboratories	H-1000	Support de montage

Solution 441244