Article de méthode

Détermination de la densité de duct biliaire dans le foie de souris

DOI :

10.3791/59587

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30 avril 2019

 , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons une méthode assez simple et sensible pour la quantification précise de la densité de conduit biliaire dans le foie de souris. Cette méthode peut aider à déterminer les effets des modificateurs génétiques et environnementaux et l'efficacité des thérapies potentielles dans les modèles murins des maladies biliaires.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La souris est largement utilisée comme organisme modèle pour étudier les maladies biliaires. Pour évaluer le développement et la fonction du système biliaire, diverses techniques sont utilisées, y compris la chimie du sérum, l'analyse histologique et l'immunostaining pour des marqueurs spécifiques. Bien que ces techniques puissent fournir des informations importantes sur le système biliaire, elles ne présentent souvent pas une image complète des défauts développementaux du canal biliaire (BD) sur l'ensemble du foie. Cela est dû en partie à la capacité robuste du foie de souris à drainer la bile, même chez les animaux ayant une déficience significative dans le développement biliaire. Ici, nous présentons une méthode simple pour calculer le nombre moyen de BD associés à chaque veine de portail (PV) dans les sections couvrant tous les lobes des souris mutantes/transgéniques. Dans cette méthode, les foies sont montés et sectionnés d'une manière stéréotypée pour faciliter la comparaison entre divers génotypes et conditions expérimentales. Les BD sont identifiés par microscopie légère des cholangiocytes teintés de cytokératine, puis comptés et divisés par le nombre total de PV présents dans la section de foie. À titre d'exemple, nous montrons comment cette méthode peut clairement distinguer entre les souris de type sauvage et un modèle de souris du syndrome d'Alagille. La méthode présentée ici ne peut se substituer aux techniques qui visualisent la structure tridimensionnelle de l'arbre biliaire. Cependant, il offre un moyen facile et direct d'évaluer quantitativement le développement de la BD et le degré de formation de réaction ductulaire chez la souris.

Introduction

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L'arbre biliaire est une partie critique du foie des mammifères, permettant le passage de la bile des hépatocytes dans l'intestin. Les canaux biliaires intrahépatiques (BD) sont formés par des cholangiocytes, qui se différencient des hépatoblastes bipotentiels par Notch et TGFMD signalant1,2. La spécification et l'engagement appropriés des cholangiocytes et de leur assemblage dans les BD mûrs sont essentiels pour le développement de l'arbre biliaire intrahépatique. Comme le foie se développe pendant le développement ou lors de la régénération des organes, le système biliaire doit se développer le long du foie pour assurer un drainage biliaire approprié. En outre, un certain nombre de maladies syndromicmiques et non-syndromamiques ont comme conséquence le manque de BDs intrahépatiques3. En outre, un certain nombre de maladies hépatiques aigues et chroniques donnent lieu à des réactions dites canalulaires dans le foie, qui sont définies comme la présence d'un nombre important de cellules qui expriment des marqueurs biliaires, mais ne proviennent pas nécessairement de cellules biliaires ou de la forme brevet BDs4. Dans le désordre multisystème syndrome d'Alagille (ALGS), haploinsufficiency de la ligand de Notch degged1 (JAG1) a comme conséquence la formation pauvre de BD et la cholestasis5,6. Notre laboratoire a récemment démontré qu'une ligne de souris Heterozygous Jag1 déjà générée7 est un modèle animal de paucité BD dans ALGS8. Dans ce modèle de souris d'ALGS, les cholangiocytes sont toujours présents. Cependant, ils ne s'engagent pas à l'incorporation dans les BD de brevet mûrs8. Par conséquent, l'analyse du foie dans un modèle de manque de BD exige plus que la présence apparente ou l'absence des cholangiocytes. Il est important d'évaluer avec précision la mesure dans laquelle les BD matures sont présents dans le foie.

Dans la pathologie anatomique, il existe des méthodes quantitatives acceptées pour évaluer si le manque de BD existe9. Par exemple, les études sur l'ALGS chez les patients humains quantifient souvent le rapport BD à veine portail (PV) en analysant au moins 10 vaisseaux portailpar biopsie du foie9,10. L'analyse de la forme et de la présence globale ou de l'absence de BD de brevet, combinée avec la chimie de sérum, peut fournir l'information valable au sujet du développement de BD chez les souris11,12,13. Cependant, les souris peuvent perdre un nombre significatif de BD avec seulement une augmentation modeste du niveaudebilirubine de sérum 8. En conséquence, une méthode quantitative qui évalue le nombre de BD présents par PV peut fournir une mesure plus directe du degré de manque de BD chez les souris. Dans un rapport récent, nous avons quantifié le nombre de BD par PV sur tous les lobes dufoie et signalé une diminution significative du rapport BD/PV chez les animaux Jag1MD/8 . Au cours de notre analyse, nous avons remarqué que, malgré la variation significative du degré de réponse inflammatoire et des réactions ductulaires, le rapport BD/PV ne montre pas beaucoup de variabilité8. De plus, la quantification du ratio BD/PV nous a permis de démontrer que la suppression d'une copie du gène de glycosyltransferase Poglut1 chez les animaux Jag1MD/MD peut améliorer considérablement leur paucity BD8. Dans un contexte Jag1/ MD, la perte conditionnelle de Poglut1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires entraîne une augmentation progressive du nombre de BD, qui est modeste (20-30%) à P7, mais devient important chez les adultes8. Encore une fois, cette technique nous a permis de montrer que même à P7, l'augmentation de la densité de BD chez ces animaux est statistiquement significative. Il convient de noter que l'augmentation de la densité de BD dans ce génotype à l'âge de quatre mois a été validée par l'analyse de fonte de résine aussi bien. 8 Ces observations et d'autres rapports qui ont mesuré la densité de BD dans différents modèles de souris d'ALGS14,15 nous ont incités à incorporer cette méthode dans notre stratégie globale pour analyser des défauts biliaires dans divers mutants et les souris transgéniques.

Ici, nous détaillons une technique simple qui peut être utilisée pour examiner le degré de manque de BD dans les modèles murins de maladie du foie (Figure 1). Dans cette méthode, la co-coloration avec des marqueurs de cholangiocyte cytokatin (CK) 8 et CK19 (ci-après à large spectre CK, wsCK) est employée pour visualiser BDs et cholangiocytes non incorporés dans le foie de souris. Un anticorps contre l'actine musculaire alpha-lisse est ajouté à la coloration pour étiqueter les vaisseaux. L'analyse systématique du rapport BD/PV dans une section couvrant tous les lobes du foie garantit qu'un grand nombre de PV sont analysés pour chaque génotype. Étant donné que notre méthode repose sur la quantification des BD et des PV en images 2D, elle n'est pas adaptée pour étudier les effets d'une mutation donnée sur la structure 3D de l'arbre biliaire ou l'intégrité des petits conduits biliaires. Néanmoins, il fournit une stratégie simple et objective pour les chercheurs d'évaluer le développement biliaire chez la souris.

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Protocole

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Tous les animaux ont été logés dans un établissement pour animaux de barrière au Baylor College of Medicine selon les lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux et en vertu de protocoles approuvés pour les animaux.

1. Collection de tissu de foie de souris

  1. Préparation de la souris pour la récolte du foie
    1. Euthanasier la souris à l'aide d'isoflurane.
    2. Effectuer la dislocation cervicale de la souris pour assurer la mort.
    3. Faire une incision transversale d'environ un pouce sous la cage thoracique.
    4. Exposer toute la surface ventrale du foie.
  2. Collection du foie de souris
    1. Soigneusement, avec de petits ciseaux, couper à travers les ligaments reliant le foie à d'autres organes de l'abdomen.
    2. Couper à travers le BD commun pour détacher le foie de l'intestin.
    3. Retirez soigneusement le foie en s'accrochant à la vésicule biliaire et placez-le immédiatement dans un tube de 50 ml rempli à trois quarts par 4 % de paraformaldéhyde (PFA).

2. Fixation et intégration du foie dans la paraffine

  1. fixation
    1. Fixer le tissu hépatique pendant 48 h dans 4% de PFA à 4 oC.
    2. Laver le tissu à l'etohetOH à 70 % pendant 1 h à 4 oC.
    3. Laver le tissu deux fois avec 95% EtOH pendant 1 h chacun à 4 oC.
    4. Laver le tissu deux fois avec 100% EtOH pendant 1 h chacun à 4 oC.
  2. clairière
    1. Laver le tissu hépatique avec l'agent de compensation (Table des matériaux) trois fois pendant 30 min chacun à température ambiante.
      REMARQUE: Le foie doit se sentir rigide après le troisième lavage.
  3. Intégration dans la paraffine
    1. Placer la cassette de tissu dans un moule de tissu dans la cire de paraffine pendant 3 lavages, 30 min chacun. La cire doit être préchauffée à 60 oC.
    2. Remplir le moule de tissu de cire de paraffine à trois quarts de hauteur et de garder sur un bloc de chauffage à 60 oC.
    3. Placez le foie dans le moule avec le côté ventral vers le haut.
    4. Retirez soigneusement le moule du bloc chauffant.
    5. Placer le dessus de la cassette sur le moule et garnir de paraffine liquide chaude.
    6. Laisser refroidir le moule et le bloc à température ambiante pendant la nuit.
      REMARQUE: Les blocs de tissus peuvent maintenant être stockés à température ambiante.

3. Sectiondure le tissu hépatique

  1. Préparation du bloc pour la sectionnement
    1. Placer le moule sur la glace pendant 5 min avant de retirer le bloc du moule.
    2. Placez le bloc sur la glace avec un papier de tissu de laboratoire présent entre le bloc et la glace.
    3. Gardez le bloc sur la glace lorsqu'il n'est pas sectionné pour obtenir les meilleurs résultats de découpe des tissus.
  2. Sectiondes des blocs de foie
    1. À l'aide d'un microtome, commencez par sectionner à travers le côté superficiel et dorsal du foie. Les sections doivent être de 5 m.
    2. Vérifiez les sections superficielles sous un microscope de dissection pour s'assurer que les sections ne sont pas cisaises ou pliées.
    3. Prenez une section du foie qui comprend le lobe caudate.
      REMARQUE: Pour certains blocs, vous aurez la gauche, médial, droit et lobes caudate sur la même tranche de tissu.
    4. Pour les blocs où les quatre lobes ne sont pas présents sur la même diapositive, continuer à trancher jusqu'à ce que les lobes gauche, médial et droit sont présents sur la même diapositive.

4. Immunohistochimie pour wsCK et SMA

  1. Traitement des diapositives pour immunohistochimie
    1. Sélectionnez une diapositive par génotype à analyser.
    2. Laver la glissière pendant 15 min en xylène, 100% EtOH, 95% EtOH et enfin 70% EtOH (3 x 5 min dans chaque solution).
    3. Laver la glissière pendant 5 min en H2O déionisée.
    4. Immerger la diapositive dans la solution de récupération d'antigène (tris à base, pH élevé).
    5. Chauffer sous pression dans un autocuiseur pendant 3 min à 10 psi.
    6. Laisser refroidir la glissière à température ambiante (environ 35 min).
  2. Blocage des sections tissulaires
    1. À l'aide d'un stylo Pap, esquissez les sections de la diapositive.
    2. Appliquer la saline tamponnée en phosphate (PBS) à 0,1 % de tween pour couvrir la section deux fois, 5 min chacune.
    3. Faire tampon de blocage en mélangeant normal sérum de chèvre (NGS) à 1:50 dans PBS - 0,3% Triton. Pour avoir suffisamment de tampon pour bloquer et l'application d'anticorps primaires, 100 L par section est suffisant.
    4. Appliquer 100 ll de solution de blocage par section.
    5. Incuber les glissières recouvertes de la solution de blocage à 4 oC pendant 1 h.
  3. Coloration pour wsCK et SMA
    1. Diluer les anticorps anti-CK8 et anti-CK1916 (Developmental Studies Hybridoma Bank, TROMA-I et TROMA-III, respectivement) 1:20 en bloquant le tampon à tacher pour wsCK. Diluer l'anticorps anti-SMA17 (Tableau des Matériaux) à 1:200 dans le même tampon.
    2. Appliquer 100 l de la solution d'anticorps dilué contenant les trois anticorps à chaque section.
    3. Incuber les lames recouvertes de la solution d'anticorps à 4 oC pendant la nuit.
    4. Laver les diapositives avec PBS - 0,1% Triton trois fois, 5 min chacun.
    5. Diluer les anticorps secondaires (anti-rat-Alexa488 et anti-souris-Cy5) 1:200 dans PBS - 0,3% Triton.
    6. Appliquer 100 l de la solution d'anticorps secondaire contenant les deux anticorps secondaires sur les diapositives.
    7. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
  4. DAPI coloration nucléaire et le montage
    1. Laver les toboggans trois fois, 5 min chacun.
    2. Appliquer 100 l de DAPI (1:3000) sur chaque section pendant 10 min.
    3. Appliquer Antifade Mounting Medium (Table of Materials) sur les diapositives et placer une feuille de verre sur les sections de tissu. Laisser les toboggans à 4 oC toute la nuit. Scellez les diapositives le lendemain.
    4. Conserver les diapositives à 4 oC et l'image dans la semaine suivant le montage.

5. Imagerie et quantification des BD

  1. Imagerie des sections du foie
    1. Avant l'imagerie, aveuglez-vous au génotype de l'échantillon avec l'aide d'un membre du laboratoire. Assurez-vous que tous les fichiers d'imagerie sont dépourvus de génotype ou d'autres informations d'identification spécifiques en plus d'un numéro animal/échantillon.
    2. À l'aide d'un microscope fluorescent, prendre des images 20x à 1x zoom de chaque section et s'assurer que chaque PV à travers le foie est image. Inclure les lobes gauche, médial, droit et caudate.
      REMARQUE: Nous trouvons habituellement 60-90 voies de portail par animal selon la taille du foie.
    3. Pour identifier les PV, recherchez la coloration de l'ASSa et de la wsCK. Les structures qui sont positives à l'ASM mais qui manquent de coloration wsCK ne sont pas des structures de portail.
  2. Identification et comptage des BD
    1. Créez une feuille de calcul avec les colonnes suivantes : Numéro animal/échantillon, Numéro d'image, Nombre de PV et Nombre de BD.
    2. En parcourant chaque image, identifiez et enregistrez le nombre de PV par image.
    3. Identifiez les BD brevetés dans chaque image par la présence de cholangiocytes (wsCKMD) entourant un lumen définissable. Les structures doivent être distinctes et séparées par le mésenchyme des autres cellules wsCKMD.
    4. Comptez chaque brevet BD et placez-le dans la même colonne que le numéro d'image.
    5. Faites ceci pour chaque image prise d'un PV.
    6. Calculez la somme de tous les PV et de tous les BD de l'échantillon de foie.
    7. Calculer le rapport BD/PV pour l'échantillon de foie.

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Résultats

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Nous avons précédemment documenté des défauts biliaires chez les animaux Jag1MD/ , un modèle de souris d'ALGS8. Pour déterminer le rapport BD/PV, nous avons sectionné les foies de souris P30 et les avons tachés pour CK8 et CK19 (wsCK) avec le marqueur vasculaire 'SMA. Nous avons ensuite photographié tous les PV dans chacun des lobes du foie. Comme le montre la figure 2A, nous avons défini les PV comme des navires tachés de SMA...

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Discussion

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L'analyse du développement et de la réparation de BD chez les souris est un outil important en étudiant la pathogénie et le mécanisme des désordres cholestatic. En outre, le développement de nouvelles thérapies dépend en partie de l'établissement d'un phénotype reproductible et de préférence quantifiable. Le phénotypage actuel dans les modèles de souris implique habituellement la chimie de sérum, l'histologie de foie et l'immunostaining pour des marqueurs spécifiques de cellules-type. Bien que ces techniques génèrent des...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

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Les auteurs reconnaissent le soutien des National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 et R01 DK109982), un Prix pilote/faisabilité du Texas Medical Center Digestive Disease Center sous NIH P30 DK56338, et un Alagille Syndrome Accelerator Award de La Fondation Médicale.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Isothésie (Isoflurane)Henry Schein11695-6776-2
DessiccateurBel-Art16-800-552
10 % PFAMicroscopie électronique Sciences15712
Tube de 50 mLThermoScientific339653
70 % d’éthanolDecon Laboratories2401
Ethanol 95 % Decon Laboratoires2801
100 % éthanolDecon Laboratories2701
HistoChoiceVWR Life SciencesH103-4Lagent nettoyant
Omnisette Tissue CassetteFisher HealthCare15-197-710E
MacrosetteSimportM512
Paraplast X-TRAMcCormick Scientific39503002
Moule tissulaireFisher Scientific62528-32
MicrotomeMicromHM 325
Superfrost Plus Lames de microscopeFisher Scientific12-550-15
XyleneFisher ScientificC8H10
Tris-Based AntigenVector LaboratoriesH-3301
Pression CuiseurInstant PotLux Mini
Mini Pap PenLife Technologies8877
Polyoxyéthylène 20 Monolaurate de sorbitan (Tween-20)J.T. BakerX251-07
Éthoxylate d’octylphénol (Triton-X-100)J.T. BakerX198-07
Sérum de chèvre normalJackson Immunoresearch005-000-121
anti-CK8Études développementales Hybridoma BankTROMA-IAnticorps ID AB531826
anti-CK19Études développementales Hybridoma BankTROMA-IIIAnticorps ID AB2133570
anti-&alpha ;SMASigma AldrichA2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488ThermoFisherA21208
anti-souris-Cy5Jackson Immunoresearch715-175-151
DAPIVector LaboratoriesH-1000
22 x 50 mm2 micro verrede protection VWR Life Sciences48393 059
Microscope à fluorescenceLeicaDMI6000 B
KimwipesKimtech Science05511
VECTASHIELDVector LaboratoriesH-1000Support de montage anti-effusion
Parrafin

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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