Article de méthode

Utilisation de Microtiter Dish Radiolabeling pour plusieurs mesures in vivo d'Escherichia coli (p)ppGpp Suivi par thin Layer Chromatography

DOI :

10.3791/59595

⸱

4 juin 2019

 , 
1Intramural Research Program, Eunice Kennedy Shriver NICHD, NIH

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La croissance des cultures bactériennes radio-étiquetées dans les plats de microtiter facilite l'échantillonnage à haut débit qui permet de multiples essais techniques et biologiques de répétition de l'abondance des piscines de nucléotides, y compris celle de (p)ppGpp. Les effets des transitions de croissance provoquées par les sources de stress physiologique ainsi que la récupération du stress peuvent être surveillés.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le (p)ppGpp nucléotide fonctionne comme un régulateur mondial dans les bactéries en réponse à une variété de stress physique et nutritionnel. Il a un début rapide, en secondes, ce qui conduit à l'accumulation de niveaux qui approchent ou dépassent ceux des piscines GTP. L'inversion du stress entraîne une disparition rapide de (p)ppGpp, souvent avec une demi-vie de moins d'une minute. La présence de (p)ppGpp entraîne des altérations de l'expression et du métabolisme des gènes cellulaires qui contrecarrent les effets néfastes du stress. Les bactéries Gram-négatives et Gram-positives ont des mécanismes de réponse différents, mais les deux dépendent de la concentration (p)ppGpp. Quoi qu'il en soit, il est nécessaire de surveiller simultanément de nombreuses cultures bactériennes radio-étiquetées à intervalles de temps qui peuvent varier de 10 secondes à des heures pendant les périodes critiques de transition du stress. Ce protocole répond à ce défi technique. La méthode tire parti des incubateurs de microtiter à température et à shaker qui permettent une surveillance parallèle de la croissance (absorption) et un échantillonnage rapide des cultures uniformément étiquetées au phosphate pour résoudre et quantifier les piscines de nucléotides par chromatographie à couches minces sur la cellulose de l'Ile-du-Prince-Édouard. De petites quantités d'échantillons sont nécessaires pour de multiples répliques techniques et biologiques d'analyses. Les transitions de croissance complexes, telles que la croissance diauxic et les taux de rotation rapides (p)ppGpp peuvent être quantitativement évaluées par cette méthode.

Introduction

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Le (p)ppGpp second messenger est un régulateur mondial qui module l'expression d'un grand nombre de gènes, y compris les gènes pour synthétiser les ribosomes et les acides aminés1,2. Bien que initialement découvert dans Escherichia coli3, (p)ppGpp peut être trouvé à la fois gram positive et Gram bactéries négatives ainsi que dans les chloroplastes végétaux4,5. Pour E. coli et d'autres bactéries Gram-négatives, (p)ppGpp interagit directement avec la polymérase d'ARN à deux sites différents6,7,8. Dans Gram positive, (p)ppGpp inhibe l'abondance du GTP, qui est sentie par CodY, une protéine liant GTP avec des motifs de reconnaissance de l'ADN spécifiques aux gènes qui conduisent à la régulation9,10. (p)ppGpp s'accumule en réponse à la famine pour différents nutriments et conditions de stress, résultant en une croissance lente et des ajustements de l'expression des gènes pour permettre l'adaptation au stress11,12.

La quantité nette de ppGpp accumulée reflète un équilibre entre les activités de syntase et d'hydrolase. Dans E. coli RelA est une synthétase forte et SpoT est bifonctionnel, avec une forte hydrolase et une faible synthèse, dont chacun pourrait être réglementé différemment d'une manière dépendante du stress. La forte synthétase RelA est activée lorsque la disponibilité de l'ARNt chargé codon spécifié lié au site ribosomal A quand il ne parvient pas à suivre les exigences de synthèse des protéines13,14,15. La faible synthétase SpoT (p)ppGpp est activée tandis que l'hydrolase forte (p)ppGpp est inhibée en réponse à d'autres conditions de stress et par d'autres mécanismes. Dans certaines conditions, les protéines telles que ACP ou Rsd peuvent se lier à SpoT, qui modifient également l'équilibre entre l'hydrolyse et la synthèse16,17. Dans Gram positifs, la synthèse et l'hydrolyse reflètent un équilibre plus complexe entre une seule protéine relA SpoT homolog (RSH) avec de fortes activités de synthèse et d'hydrolyse ainsi que de plus petites hydrolases et/ou des synthèses12.

Les nucléotides (p)ppGpp ont d'abord été découverts comme des taches inhabituelles étiquetées 32P qui sont apparues sur les autoradiogrammes des chromatogrammes à couches minces (TLC) lors d'une réponse rigoureuse induite par la famine d'acides aminés3. Des protocoles d'étiquetage plus détaillés ont été examinés 18. Le protocole décrit ici (figure 1) est une modification de ces protocoles qui permet de surveiller la croissance de plusieurs échantillons sur des plaques de microtiter. Cela facilite de multiples estimations biologiques et techniques des changements d'abondance (p)ppGpp et a été initialement développé pour des études de décalages diauxic19. L'étiquetage de (p)ppGpp avec 32P et la détection par TLC permet également de mesurer les taux de dégradation (p)ppGpp. Des méthodes alternatives ont été développées pour déterminer (p)ppGpp niveaux tels que la spectrométrie de masse, HPLC20, chimiocapteurs fluorescents21,22, et les fusions de gènes GFP aux promoteurs touchés par ppGpp23, 24. Les chimiosenseurs fluorescents ont actuellement une utilisation limitée en raison de petits décalages spectrals après la liaison ppGpp ainsi que des problèmes de distinction entre ppGpp et pppGpp21. Cette méthode est efficace pour détecter (p)ppGpp in vitro, mais pas dans les extraits cellulaires. Les méthodes impliquant HPLC ont été améliorées20, mais nécessitent un équipement coûteux et ne sont pas bien adaptés à la haute débit. Enfin, les fusions GFP peuvent donner une estimation de l'activation ou de l'inhibition dépendante de ppGpp, mais ne mesurent pas ppGpp lui-même. Bien que chacune de ces méthodes alternatives soit utile, elle nécessite un équipement coûteux ou un temps pratique important, ou elles ne sont pas autrement propices à l'échantillonnage cinétique multiple et au traitement ultérieur. Avec la méthode décrite ici, 96 échantillons peuvent être appliqués à six plaques TLC dans environ 20 min (18 échantillons par plaque), résolus par le développement de TLC en moins de quelques heures, avec des données quantitatives obtenues après plusieurs heures ou pendant la nuit, selon l'étiquetage intensité.

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Protocole

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1. Préparation des médias

  1. Pour moPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acide) media25, utiliser 1/10 volume de sels MOPS 10x, 1/100 volume de solution de micronutriments 100x, 3 mM de phosphate de sodium pour les cultures du jour au lendemain ou 0,2 mM de phosphate de sodium pour l'étiquetage uniforme avec 32P, 0,2 % de glucose et 1 thiamine g/mL (vitamine B1). Ajouter les acides aminés à 40 g/mL si nécessaire.
    1. Pour les sels MOPS, utilisez 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4, 95 mM NH4Cl, 2,6 mM K2SO4, 5 M CaCl2, 10,56 mM MgCl2, et 500 mM NaCl. Ajouter les différents composants dans l'ordre écrit pour éviter les précipitations. Ajuster au pH 7.4 avec KOH et stériliser par filtration.
    2. Pour la solution de micronutriments 100x, utilisez 3 M (NH4)6(MO7)24, 0,4 m M H3BO4, 30 M CoCl2, 10 M CuSO4, 80 M MNCl2, et 10 M ZnSO4. Stériliser en autoclant.
    3. Pour le glucose (20%) et les solutions de phosphate de sodium (300 mM), stériliser en 100x stocks distincts par autoclacage. Stériliser les stocks de 100x de mélanges de thiamine et d'acides aminés par filtration. Préparez des supports frais à partir de solutions de stock stériles pour chaque expérience.

2. Étiquetage avec 32P

  1. Cultivez des cultures du jour au lendemain dans les médias MOPS avec 3 mm de phosphate de sodium.
  2. Dans une plaque de 24 puits, ajouter 550 oL de support MOPS contenant 0,2 mM de phosphate de sodium et 30 l de chaque inoculum bactérien (dilution 1/20). Cela produira un inoculum initial de OD600nm 0.1. Utilisez un puits avec des médias frais comme un contrôle de stérilité.
  3. Placer la plaque sur un incubateur secouant à 37 oC en secouant à 900 tr/min pendant 30 min. Les cultures sont chauffées d'en bas et les secousses procurent l'aération. Fixez fermement la plaque avec du ruban adhésif pour éviter les inclinaisons ou les déversements. La croissance peut être surveillée avec une plaque de repli en parallèle dans les médias manquant 32P à l'aide d'un lecteur de plaque et d'incubation dans les mêmes conditions.
  4. Ajouter 100 'Ci à chaque puits d'orthophosphate de 32P (20 oL à partir d'un stock de 5 mCi/mL).
    REMARQUE: La quantité de radioactivité peut également être ajustée pour répondre aux besoins expérimentaux. Pour les faibles niveaux basaux 100 'Ci avec 0.2 mM de phosphate porteur fonctionne bien, mais pour mesurer (p)ppGpp niveaux qui devraient devenir équivalents aux piscines GTP, l'étiquette peut être chuté à 25 ou 50 'Ci. Il n'est pas recommandé d'abaisser le phosphate porte-bébé en dessous de 0,2 mM pour éviter que les niveaux de phosphate ne se limitent à la croissance.
    CAUTION: 32P est un isotope émettant de l'énonciation, donc utilisez un blindage approprié spécifié pour la sécurité. Toutes les matières radioactives doivent être correctement éliminées en prenant toutes les précautions possibles.
  5. Cultivez en secouant l'incubateur pendant 1 à 2 doublons (1 h ou plus) pour permettre à l'étiquette externe d'équilibrer en grande partie avec des piscines de nucléotides intracellulaires avant d'induire un stress.

3. Induction du stress ou de la famine

  1. Induire le stress en utilisant une méthode de votre choix, en fonction du type de stress étudié, par exemple l'ajout d'inhibiteurs de la voie métabolique, l'évolution de la température, l'épuisement des nutriments nécessaires, les changements d'osmolarité, induisant le stress oxydatif, l'ajout de toxines, etc.
    1. Par exemple, ajoutez 100 g/mL de L-valine pour induire la famine d'isoleucine dans les souches d'E. coli K-12. Des niveaux accrus de ppGpp seront observés après 5 minutes d'induction.

4. Échantillonnage et extraction ppGpp

  1. Ajouter 20 l de chaque échantillon de cellules étiquetés à un tube PCR de 0,2 ml contenant 20 l d'acide formique froid de glace 6 M.
  2. Placer immédiatement les échantillons dans de la glace sèche.
  3. Améliorer l'efficacité de l'extraction cellulaire par 3 cycles de congélation et de décongélation.
  4. Juste avant de repérer les chromatogrammes à couches minces de cellulose de l'Ile-du-Prince-Édouard, des échantillons de centrifugeuses pendant 1 min à vitesse maximale pour les débris de cellules à granulés afin d'éviter de les repérer sur des chromatogrammes.

5. Chromatographie à couches minces

  1. À l'aide d'un crayon souple, marquez une ligne d'origine à 1 cm du bord de la plaque TLC de 20 cm x 20 cm de l'Ile-du-Prince-Édouard qui a été retirée de 5 cm du haut à l'aide de ciseaux. Appliquer 5 ll comme gouttelette dans la surface de l'Ile-du-Prince-Édouard pour chaque échantillon. Commencez le développement ascendant sans permettre à cet endroit de sécher, ce qui améliore la résolution en minimisant les stries.
  2. Faites le développement ascendant dans un réservoir avec une couche de 1,5 M KH2PO4 (pH 3.4) solution assez peu profonde pour que le liquide ne touche pas la tache de l'échantillon d'origine. Couvrir le réservoir d'un joint hermétique et laisser le liquide s'enclenchejusqu le dessus de la feuille taillée, 15 cm. Pour obtenir un pH 3,4 pour une solution de 1,5 M KH2PO4, il est nécessaire d'ajuster le pH en additionner H3PO4.
  3. Retirer le chromatogramme entièrement développé et sécher à l'air à température ambiante.
  4. Couper et jeter la partie supérieure (pH avant) du chromatogramme contenant les 32P libres en déchets radioactifs. Cette partie est représentée en couleur jaune dans la figure 2 et facilement visualisée sous la lumière UV. Si l'on ne mesure que les nucléotides (p)ppGpp qui migrent plus lentement que le GTP, il est recommandé d'exécuter une norme GTP visible par les UV, puis de couper et de jeter une plus grande partie supérieure (tout ce qui est au-dessus du GTP, comme le montre la figure 2).
  5. Exposer les films autoradiographiques du jour au lendemain avec un écran de phosphore.
  6. Développer le film. Capturez et quantitez le signal d'écran de phosphore avec un phosphoimager.

6. Quantitation de (p)ppGpp

  1. Quantitate taches radioactives avec Image J26,27.
    REMARQUE: La quantité de (p)ppGpp peut être normalisée à la quantité totale de nucléotides G observées dans chaque échantillon (figure 2). Si la quantité de fond est homogène, un seul blanc (encadré 4 de la figure 2) peut être soustrait pour corriger l'arrière-plan. Total G est la somme de GTP ppGpp et pppGpp détectée. Cette normalisation suppose que les niveaux de GMP et de PIB sont négligeables, ce qui est vrai pour E. coli. Le rapport d'un nucléotide donné au g total fournit un moyen important de corriger les variations du volume de l'échantillon appliqué.

7. Mesure du taux de décroissance ppGpp

REMARQUE: Une modification de ce protocole permet de mesurer les taux de désintégration ppGpp.

  1. Après avoir provoqué le stress ou la famine pendant un temps suffisant pour permettre l'accumulation de ppGpp (étape 3), inverser le stress afin de bloquer la synthèse ppGpp continue, ce qui permet la détection des taux hydrolytiques. La procédure d'inversion dépendra du stress. Par exemple, ajoutez 200 g/mL de chloramphenicol pour inverser toute famine d'acide aminé.
  2. Les taux de désintégration sont généralement rapides, mais peuvent varier, alors prenez des échantillons tous les 20-30 s jusqu'à 2 min. Traiter les échantillons comme à l'étape 4.
  3. Une fois que le TLC est développé (comme à l'étape 5) et les niveaux de ppGpp obtenus au cours du cours du temps, tracer le contenu résiduel ppGpp sur une parcelle semi-logarithmique vs temps pour permettre la visualisation des taux d'ordre zéro de décomposition, comme une ligne droite, et l'estimation de la demi-vie ppGpp.

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Résultats

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Dans les souches E. coli K-12, l'ajout de valine provoque une famine endogène de l'isoleucine, ce qui entraîne une augmentation des niveaux de ppGpp après 5 min3. Les cellules cultivées en MOPS contenant tous les acides aminés à l'exception de l'ILV ont été étiquetées avec 32P comme indiqué à la figure 1. Une fois étiquetés, 6 l de 10 mg/mL de L-valine (concentration finale de 100 g/mL) ont été ajoutés pour produire la famine d'isoleucine. D...

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Discussion

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La réalisation d'un étiquetage presque uniforme des cellules est une étape critique pour ce protocole. Par conséquent, l'utilisation de médias définis, tels que moPS ou Tris media, est cruciale pour permettre la variation des concentrations de phosphate porteur et de l'activité spécifique. Les supports tampons de phosphate, tels que M9 ou le média A, ne peuvent pas être utilisés. La plupart des médias non définis contiennent des quantités variables de phosphate, comme la LB, le tryptone et les acides casamino. L'isotope ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche intra-muros, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
(NH4)6(MO7)24Fisher ScientificsA-674
Film d’autoradiographieDenville scientific inc.E3218
CaCl2J.T.Baker1-1309
ChloramphénicolRPIC61000-25.0
CoCl2Fisher ScientificsC-371
CuSO4J.T.Baker1843
FeSO4Fisher ScientificsI-146
Acide formiqueFisher BiotechBP1215-500
GlucoseMacron4912-12
H3BO4Macron2549-04
H3PO4J.T.Baker0260-02
K2SO4SigmaP9458-250G
KH2PO4Fisher BiotechBP362-500
L-ValineSigmaV-6504
MgCl2Fisher ScientificsFL-06-0303
Lecteur de microplaques Synergy HTBiotekSynergy HT
MnCl2SigmaM-9522
MOPSSigmaM1254-1KG
Na2HPO4Mallinckrodt7892
NaClJ.T.Baker3624-01
NaH2PO4Mallinckrodt7917
NH4ClSigmaA0171-500G
Radionucléide P-32, acide orthophosphorique dans 1 mL d’eau (5 mCi)Perkin ElmerNEX053005MC
Écran de stockage au phosphoreKodakSo230
ThermomixeurEppendorf5382000015
ThiamineSigmaT-4625
TLC PEI Cellulose FMerk-Millipore1.05579.0001
Imageur TricineRPIT2400-500.0
Typhoon 9400GE Healthcare
ZnSO4Fisher ScientificsZ-68

Références

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Mots-clés

Mesure du ppGppMarquage radioactif au phosphateAnalyse du pool de nucl otidesSuivi de la r ponse au stressCCM sur cellulose PEITraitement d chantillons radioactifsAnalyse des conditions de croissance

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