Utilisation de Microtiter Dish Radiolabeling pour plusieurs mesures in vivo d'Escherichia coli (p)ppGpp Suivi par thin Layer Chromatography

Résumé

La croissance des cultures bactériennes radio-étiquetées dans les plats de microtiter facilite l'échantillonnage à haut débit qui permet de multiples essais techniques et biologiques de répétition de l'abondance des piscines de nucléotides, y compris celle de (p)ppGpp. Les effets des transitions de croissance provoquées par les sources de stress physiologique ainsi que la récupération du stress peuvent être surveillés.

Résumé

Le (p)ppGpp nucléotide fonctionne comme un régulateur mondial dans les bactéries en réponse à une variété de stress physique et nutritionnel. Il a un début rapide, en secondes, ce qui conduit à l'accumulation de niveaux qui approchent ou dépassent ceux des piscines GTP. L'inversion du stress entraîne une disparition rapide de (p)ppGpp, souvent avec une demi-vie de moins d'une minute. La présence de (p)ppGpp entraîne des altérations de l'expression et du métabolisme des gènes cellulaires qui contrecarrent les effets néfastes du stress. Les bactéries Gram-négatives et Gram-positives ont des mécanismes de réponse différents, mais les deux dépendent de la concentration (p)ppGpp. Quoi qu'il en soit, il est nécessaire de surveiller simultanément de nombreuses cultures bactériennes radio-étiquetées à intervalles de temps qui peuvent varier de 10 secondes à des heures pendant les périodes critiques de transition du stress. Ce protocole répond à ce défi technique. La méthode tire parti des incubateurs de microtiter à température et à shaker qui permettent une surveillance parallèle de la croissance (absorption) et un échantillonnage rapide des cultures uniformément étiquetées au phosphate pour résoudre et quantifier les piscines de nucléotides par chromatographie à couches minces sur la cellulose de l'Ile-du-Prince-Édouard. De petites quantités d'échantillons sont nécessaires pour de multiples répliques techniques et biologiques d'analyses. Les transitions de croissance complexes, telles que la croissance diauxic et les taux de rotation rapides (p)ppGpp peuvent être quantitativement évaluées par cette méthode.

Introduction

Le (p)ppGpp second messenger est un régulateur mondial qui module l'expression d'un grand nombre de gènes, y compris les gènes pour synthétiser les ribosomes et les acides aminés^1,2. Bien que initialement découvert dans Escherichia coli³, (p)ppGpp peut être trouvé à la fois gram positive et Gram bactéries négatives ainsi que dans les chloroplastes végétaux^4,5. Pour E. coli et d'autres bactéries Gram-négatives, (p)ppGpp interagit directement avec la polymérase d'ARN à deux sites différents⁶

Protocole

1. Préparation des médias

1. Pour moPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acide) media²⁵, utiliser 1/10 volume de sels MOPS 10x, 1/100 volume de solution de micronutriments 100x, 3 mM de phosphate de sodium pour les cultures du jour au lendemain ou 0,2 mM de phosphate de sodium pour l'étiquetage uniforme avec ³²P, 0,2 % de glucose et 1 thiamine g/mL (vitamine B1). Ajouter les acides aminés à 40 g/mL si nécessaire.
   1. Pour les sels MOPS, utilisez 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO₄, 95 mM NH₄Cl, 2,6 mM K₂SO₄, 5 M CaCl₂, 10,56 mM MgCl₂,....

Résultats

Dans les souches E. coli K-12, l'ajout de valine provoque une famine endogène de l'isoleucine, ce qui entraîne une augmentation des niveaux de ppGpp après 5 min³. Les cellules cultivées en MOPS contenant tous les acides aminés à l'exception de l'ILV ont été étiquetées avec ³²P comme indiqué à la figure 1. Une fois étiquetés, 6 l de 10 mg/mL de L-valine (concentration finale de 100 g/mL) ont été ajoutés pour produire la famine d'isoleucine. D.......

Discussion

La réalisation d'un étiquetage presque uniforme des cellules est une étape critique pour ce protocole. Par conséquent, l'utilisation de médias définis, tels que moPS ou Tris media, est cruciale pour permettre la variation des concentrations de phosphate porteur et de l'activité spécifique. Les supports tampons de phosphate, tels que M9 ou le média A, ne peuvent pas être utilisés. La plupart des médias non définis contiennent des quantités variables de phosphate, comme la LB, le tryptone et les acides casamino. L'isotope .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(NH4)6(MO7)24	Fisher Scientifics	A-674
Film d’autoradiographie	Denville scientific inc.	E3218
CaCl2	J.T.Baker	1-1309
Chloramphénicol	RPI	C61000-25.0
CoCl2	Fisher Scientifics	C-371
CuSO4	J.T.Baker	1843
FeSO4	Fisher Scientifics	I-146
Acide formique	Fisher Biotech	BP1215-500
Glucose	Macron	4912-12
H3BO4	Macron	2549-04
H3PO4	J.T.Baker	0260-02
K2SO4	Sigma	P9458-250G
KH2PO4	Fisher Biotech	BP362-500
L-Valine	Sigma	V-6504
MgCl2	Fisher Scientifics	FL-06-0303
Lecteur de microplaques Synergy HT	Biotek	Synergy HT
MnCl2	Sigma	M-9522
MOPS	Sigma	M1254-1KG
Na2HPO4	Mallinckrodt	7892
NaCl	J.T.Baker	3624-01
NaH2PO4	Mallinckrodt	7917
NH4Cl	Sigma	A0171-500G
Radionucléide P-32, acide orthophosphorique dans 1 mL d’eau (5 mCi)	Perkin Elmer	NEX053005MC
Écran de stockage au phosphore	Kodak	So230
Thermomixeur	Eppendorf	5382000015
Thiamine	Sigma	T-4625
TLC PEI Cellulose F	Merk-Millipore	1.05579.0001
Imageur Tricine	RPI	T2400-500.0
Typhoon 9400	GE Healthcare
ZnSO4	Fisher Scientifics	Z-68