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Article de méthode

Expression et purification de nuclease-Free Oxygen Sccatechuate 3,4-Dioxygenase

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⸱

DOI :

10.3791/59599

⸱

8 novembre 2019

 ,  ,  , 
1Cancer Biology and Genetics, College of Medicine, The Ohio State University

Dans cet article

Résumé

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) peut enzymatiquement enlever l'oxygène diatomique libre d'un système aqueux utilisant son acide protocatechuic de substrat (PCA). Ce protocole décrit l'expression, la purification, et l'analyse d'activité de cette enzyme de récupération d'oxygène.

Résumé

La microscopie à molécule unique (SM) est utilisée dans l'étude des interactions moléculaires dynamiques des biomolécules étiquetées fluorophore en temps réel. Cependant, les fluorophores sont sujets à la perte de signal par photoblanchiment par l'oxygène dissous (O2). Pour prévenir le photoblanchiment et prolonger la durée de vie du fluorophore, des systèmes de récupération d'oxygène (OSS) sont utilisés pour réduire L'O2. Les OSS disponibles dans le commerce peuvent être contaminés par des nucléases qui endommagent ou dégradent les acides nucléiques, ce qui confond l'interprétation des résultats expérimentaux. Ici nous détaillons un protocole pour l'expression et la purification du protocatechuate fortement actif de Pseudomonas de Pseudomonas-3,4-dioxygenase (PCD) sans contamination détectable de nucléane. Le PCD peut éliminer efficacement les espèces réactives O2 en reconversion de l'acide protocatechuic substrat (PCA) en acide 3-carboxy-cis,cis-muconic. Cette méthode peut être utilisée dans n'importe quel système aqueux où O2 joue un rôle préjudiciable dans l'acquisition de données. Cette méthode est efficace dans la production de PCD très actif et sans nucléane par rapport au PCD disponible dans le commerce.

Introduction

La biophysique à molécule unique (SM) est un domaine en croissance rapide qui change notre façon de voir les phénomènes biologiques. Ce domaine a la capacité unique de lier les lois fondamentales de la physique et de la chimie à la biologie. La microscopie de fluorescence est une méthode biophysique qui peut atteindre la sensibilité SM. La fluorescence est utilisée pour détecter les biomolécules en les reliant à de petits fluorophores organiques ou à des points quantiques1. Ces molécules peuvent émettre des photons lorsqu'elles sont excitées par des lasers avant de photobleaching irréversiblement2. Photobleaching se produit lorsque les étiquettes fluorescentes subissent des dommages chimiques qui détruit leur capacité à exciter à la longueur d'onde désirée2,3. La présence d'espèces réactives d'oxygène (ROS) dans le tampon aqueux sont une cause primaire de photoblanchiment2,4. En outre, ROS peut endommager les biomolécules et conduire à des observations erronées dans les expériences SM5,6. Pour prévenir les dommages oxydatifs, les systèmes de récupération d'oxygène (OSS) peuvent être utilisés3,7,8. Le système d'oxydase/catalase de glucose (GODCAT) est efficace pour enlever l'oxygène8,mais il produit des peroxydes potentiellement dommageables comme intermédiaires. Ceux-ci peuvent être préjudiciables aux biomolécules d'intérêt dans les études de SM.

Alternativement, protocatechuate 3,4 dioxygenase (PCD) éliminera efficacement O2 d'une solution aqueuse utilisant son acide protocatechuic de substrat (PCA)7,9. PCD est un métalloenzyme qui utilise le fer nonheme pour coordonner PCA et catalyser la réaction d'ouverture de l'anneau catéchol en utilisant dissous O210. Cette réaction d'une étape s'est avérée être un OSS globalement meilleur pour améliorer la stabilité du fluorophore dans les expériences SM7. Malheureusement, de nombreuses enzymes OSS disponibles dans le commerce, y compris le PCD, contiennent des nucléases contaminantes11. Ces contaminants peuvent endommager les substrats à base d'acide nucléique utilisés dans les expériences SM. Ces travaux permettront d'élucider un protocole de purification à base de chromatographie pour l'utilisation de PCD recombinant dans les systèmes SM. Le PCD peut être largement appliqué à toute expérience où les ROS sont des substrats dommageables nécessaires à l'acquisition de données.

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Protocole

1. Induire l'expression PCD dans E. coli

  1. Combinez 1 plasmide d'expression PCD de l'AL pVP91A-pcaHG (20 ng/L, Figure 1A) et 20 'L d'E. coli BL21 (20 cellules disponibles commercialement, 'gt; 2 x 106 cfu/g plasmid) dans un tube. Feuilleter le tube pour mélanger. Placer le tube sur la glace 5 min.
  2. Placer la transformation à 42 oC pour 30 s. Puis glace 2 min.
  3. Ajouter 80 'L soC media (super optimal broth with catabolite repression: 2.5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2% tryptone, 0.5% extract de levure, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose). Secouer à 225 tours par min (rpm) 37 oC pour 1 h.
  4. Plaquer la réaction de transformation sur LB Amp Agar (1L Luria Broth agar: 10 g NaCl, 10 g bacto-tryptone, 5 g extrait de levure, 15 g d'agar, 50 g/mL d'ampicilline; 25 mL par plat de pétri de 10 cm de diamètre).
  5. Incuber la plaque, couvercle vers le bas, à 37 oC pendant 16-18 h.
  6. Inoculer 50 mL LB Amp (1L LB: 10 g bacto-tryptone, 10 g NaCl, 5 g d'extrait de levure, 50 'g/mL d'ampicilline) dans un flacon Erlenmeyer de 250 mL avec une colonie. Incuber à 37 oC pendant 16-18 h en secouant à 225 tr/min.
  7. Transférer la culture de 20 ml dans un flacon de 4 L avec 1 Lb Am. Secouer à 225 tr/min à 37 oC.
  8. Chaque h mesure la culture OD600 (densité optique à 600 nm). Comme la culture OD600 se rapproche de 0,5, augmenter la fréquence des mesures à toutes les 15 minutes. La densité désirée de la culture est de 0,5 OD600.
  9. Transférer le flacon de 4 L dans un bac de glace. Faites tourbillonner le flacon dans le bain de glace pour réduire la température de la culture.
    Note: Le temps sur la glace doit être réduit au minimum afin que les cellules restent métaboliquement actives. Idéalement, les cellules seront sur la glace à moins de 10 min.
  10. L'induction réussie de PCD peut être observée en dénaturant l'électrophores de gel de sulfate de dodecyl de sodium polyacrylamide (SDS-PAGE). Récolte 1 ml de la culture non induite dans un tube. Faire tourner l'échantillon 1 min à 14 000 x g dans un microfuge à température ambiante. Decant le supernatant.
    1. Solubilize les cellules granulées dans 150 L PBS (phosphate tamponné saline).
    2. Ajouter un volume égal de colorant de chargement 2X (1,2 % DeSD, 30 % de glycérol, 150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,0018 % bleu bromophénol, 15 % de mercaptoéthanol). Vortex l'échantillon à bien mélanger.
    3. Faire bouillir l'échantillon pendant 3 min et le transférer sur la glace. L'échantillon peut être conservé dans un congélateur de -20 oC pour une analyse future.
      Note: PBS est disponible dans le commerce avec ou sans CaCl2 et MgCl2. De nombreux laboratoires auront PBS sans CaCl2 et MgCl2 pour les méthodes de culture cellulaire. Nous n'avons trouvé aucune différence avec PBS avec ou sans CaCl2 et MgCl2.
  11. Transférer le flacon de 4 L dans un incubateur à 17 oC avec 180 tr/min. Continuer à surveiller l'OD600 toutes les 20 min.
  12. À 0,7 OD600 ajouter isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) à 0,5 mM concentration finale (0,25 M solution de stock) et 10 mg/L de fer ammonium (II) sulfate hexahydrate (Fe(NH4)2(SO4)2, 10 mg/mL solution de stock). Les gènes PCD pcaH et pcaG sont induits par le promoteur T5 par l'ajout de l'IPTG (Figure 1A). Le sulfate de fer est lié par PCD et nécessaire pour l'activité catalytique en coordonnant l'oxygène pendant l'ouverture de catéchol.
  13. Secouez la culture à 180 tr/min à 17 oC pendant 18 h.
  14. Placez le flacon de culture dans la glace comme dans 1.2. Récolte1 ml des cellules induites pour SDS-PAGE comme dans 1.3.
  15. Verser la culture bactérienne dans les bouteilles appropriées pour la centrifugation. Une culture de 1 L peut être centrifiée dans 4 bouteilles coniques de fond conique. Pelleter la culture à 4 oC pendant 20 min à 3000 x g. Décant les supernatants. Éliminer les déchets liquides bactériens de façon appropriée.
  16. Pipet pour resuspendre les granulés dans 25 ml de PBS froid (CaCl2 et MgCl2 sont facultatifs) par culture de 1 L.
  17. Transférer la suspension dans des tubes coniques de 50 ml (1 tube de 50 ml par culture de 1 L). Pelleter les cellules à 3000 x g pendant 20 min à 4 oC. Décantez le supernatant et disposez de manière appropriée.
  18. Resuspendre les cellules dans 10 ml de tampon de lyse (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM d'imidazole, 10 % de glycérol, 800 ng/mL de Pepstatine, 1 g/mL de leupeptin, et 87,1 g/mL de phénylmethylsulfonyl fluorure (PMSF)) par tuyauterie. Congeler la suspension avec de l'azote liquide dans un flacon Dewar. Conserver les tubes d'échantillon dans un congélateur de -80 oC. Nous avons purifié le PCD à partir de granulés stockés à -80 oC pendant un an sans perte apparente d'activité.
  19. Comparez les cellules non induites et induites par SDS-PAGE.
    Note: Nous n'avons eu aucune difficulté avec l'induction de l'hétérodime de PCD. Cependant, nous recommandons de tester l'induction avant de continuer avec la purification dans le cas où tout réactif a expiré de façon inattendue.
    1. Assembler des plaques pour SDS-PAGE (dimensions : 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm d'épaisseur). Le gel d'empilage est de 1,5 mL 6% de polyacrylamide (6% d'acrylamide, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfate, 0,001% TEMED). Le gel résolvant est 3,5 mL 12% de polyacrylamide (12% d'acrylamide, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfate, 0,001% TEMED). Insérez un peigne de 10 puits à la couche d'empilage.
    2. Chargez 10 L d'échantillons bactériens non induits et induits. Chargez 4 L de marqueurs de poids moléculaires présagés pour les protéines (Figure 1B).
    3. Électrophorese le gel à 16,5 V/cm environ 1 h. Le bleu bromophénol devrait atteindre le fond du gel.
    4. Placez le gel dans la tache bleue de Coomassie (10% d'acide acétique, 40% de méthanol, 0.1% de colorant bleu de Coomassie) dans une baignoire en plastique. La tache doit immerger complètement le gel. Tache à température ambiante pendant 20 min. La rotation douce pendant la coloration est facultative.
    5. Remplacer la solution par delatache (10% d'acide acétique, 40% de méthanol). Incuber à température ambiante avec une rotation douce en option jusqu'à ce que les bandes protéiques soient facilement visibles.
    6. Remplacer la tache par de l'eau déionisée. Parmi les protéines bactériennes, les sous-unités induites de PCD devraient être visibles dans les cellules induites. Hexahistidine marqué PCD sous-unité pcaH a un poids moléculaire de 28,3 kDa et la sous-unité pcaG est de 22,4 kDa. Si les sous-unités PCD ne sont pas apparentes, une nouvelle induction dérivée d'une nouvelle colonie doit être effectuée.

2. Purification de chromatographie d'affinité de nickel du PCD

  1. Décongeler sur la glace un tube de 50 ml de cellules induites. Il peut prendre 2-3 h pour décongeler complètement l'échantillon.
  2. Garder le tube sur la glace, sonicate l'échantillon à 30% d'amplitude pendant 1 min, vélo 1 s sur et en dehors. Utilisez un sonicateur conique (diamètre 0,125 pouces). La puissance maximale est de 400 W et la fréquence est de 20 kHz et par 1 L de granule de culture.
  3. Après la sonication, ajouter le lysozyme à une concentration finale de 0,2 mg/mL (10 mg/ml de solution de bouillon) et conserver sur la glace pendant 30 min à 4 oC.
  4. Verser le lysate bactérien dans une bouteille de polycarbonate préréfrigérée (dimensions : 25 mm x 89 mm). La bouteille doit être compatible avec un rotor d'ultracentrifuge à angle fixe. D'autres tubes et/ou rotors peuvent être remplacés, mais la force de gravitation finale doit être maintenue.
  5. Centrifugeuse de 60 min à 120 000 x g à 4 oC. Les débris cellulaires formeront une pastille. Le supernatant peut apparaître jaune.
    1. Le granule peut être inclus dans l'analyse ultérieure SDS-PAGE pour déterminer la solubilité du PCD (figure 1B). Solubiliser la pastille en vortexant dans 10 mL de PBS. Transférer 150 l dans un tube de 1,5 ml. Préparer l'échantillon pour SDS-PAGE comme dans 1.3.
  6. Verser le supernatant dans un tube conique froid de 50 ml. Notez le volume. La contamination du supernatant avec de l'ADN bactérien peut donner un échantillon visqueux. L'ADN génomique bactérien pourrait bloquer le flux de la colonne. L'étape d'ultracentrifugation 2.2 doit être répétée pour granuler l'ADN bactérien. Une pastille de cette deuxième rotation peut ne pas être facilement visible ou transparente.
  7. Faire 500 mL Ni Buffer A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, et 10% glycérol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 g/mL Leupeptin, et 87,1 g/mL PMSF) et 500 mL Ni Buffer B (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glycérol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 'g/mL Leupeptin, et 87.1 'g/mL PMSF, 250 mM imidazole, pH 8.0). Passer les deux tampons Ni à travers les filtres de 0,2 m pore.
  8. L'échantillon, les tampons et le système FPLC (chromatographie liquide à protéines rapides) sont dans une pièce réfrigérée à 4 oC. Laver la pompe A avec Ni Buffer A et la pompe B avec Ni Buffer B. Laver le système avec 20 mM d'imidazole (8 % Ni Buffer B, 92 % Ni Buffer A) jusqu'à ce que les UV et la conductivité se stabilisent. Nous écoulons régulièrement des tampons à 5 ml/min avec une limite de pression de 1,0 MPa. La limite de débit et de pression doit être déterminée par les spécifications de l'instrument FPLC utilisé.
  9. Préparer une colonne avec 1,5 ml de résine chargée de nickel (dimensions : 110 mm de long x 5 mm). La capacité de liaison de résine est de 50 mg/mL et peut tolérer une pression de 1 MPa. Une colonne peut être versée et stockée à 4 oC avant la purification.
    Note: La taille de la colonne peut être proportionnellement augmentée pour accueillir plus d'un tube de 50 ml de cellules induites si plus de protéines est nécessaire. Nous préférons une colonne fraîche pour chaque préparation pour nous assurer qu'aucune protéine résiduelle ne contamine notre protéine désirée. Toutefois, les résines de nickel peuvent être recyclées selon les instructions du fabricant.
  10. Fixez la colonne de résine chargée de nickel au FPLC. Exécuter 20 ml de 92% Ni Buffer A et 8% Ni Buffer B (20 mM imidazole) à 0,5 ml/min avec une limite de pression de 0,5 MPa à travers la colonne pour l'équilibre. En temps réel, le FPLC devrait mesurer a280 (280 nm d'absorption UV) ainsi que la conductivité. Si ces valeurs ne se sont pas stabilisées après que le volume de 20 ml a traversé la colonne, les tampons coulent jusqu'à ce qu'ils se soient stabilisés.
  11. Chargez l'échantillon à la colonne (10 ml) à 0,15 ml/min. Fixez la limite de pression à 0,5 MPa. Recueillir le flux à travers.
  12. Laver la colonne avec 20 mL Ni Buffer à 20 mM imidazole (92% Ni Buffer A et 8% Ni Buffer B). Conserver le lavage dans un tube de 50 ml pour analyse. Laver la colonne avec 15 ml de 50% Ni Buffer A et 50% Ni Buffer B (125 mM imidazole). Recueillir l'élution en 19 fractions de volume de 0,8 ml. Laver la colonne avec 15 mL 100% Ni Buffer B. Recueillir 75 fractions supplémentaires de 0,2 ml. Certains heterodimer PCD s'éliront dans le 50% Ni Tampon B lavage, mais la majorité de l'hétérodiste s'élit dans le 100% Ni Tampon B lavage.
  13. Analyser les fractions recueillies sur les gels SDS-PAGE de 12 % pour confirmer la présence de PCD. Ajoutez des volumes égaux de colorant de chargement 2X au débit, au lavage et au pic A280 fractions. Faire bouillir pendant 3 min. Transférer sur la glace. Verser deux gels SDS-PAGE de 12 % (comme à l'étape 1.7). Répétez la méthode du gel telle que décrite dans 1.7.

3. L'activité nucléase

  1. Sur la base de l'analyse SDS-PAGE, identifier les fractions d'affinité nickel qui contiennent des PCD presque pures. Combiner 5 fractions de chromatographie Ll et 500 ng 3 kb de plasmide pXbaMD dans un tampon de réaction (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT) avec un volume final de 50 l.
    1. Incuber à 37 oC pendant 1 h.
    2. Inclure un contrôle négatif (pas de protéines ajoutées) et un contrôle positif (PCD disponible dans le commerce). Arrêtez la réaction avec une solution d'arrêt de 10 l (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% de glycérol, 0,15% Orange G).
    3. Les échantillons peuvent être conservés dans un congélateur de -20 oC pour être analysés plus tard. N'importe quel plasmide supercoiled peut être employé dans un analyse de nucléase aussi longtemps que les produits supercoiled et détendus de réaction de cercle peuvent être résolus par l'électrophoresis de gel d'agarose.
  2. Verser un gel d'agarose de 120 ml 1 % dans un tampon d'éthidium 1X TAE (40 mM Tris-acétate, 1 mM EDTA, 0,5 g/mL de bromure d'étoduyium) dans un gel moulé (dimensions : 15 x 10 cm). Utilisez un peigne de 15 puits (dimensions de puits : 5 mm x 1,5 mm). Lorsque le gel a pris, plongez-le dans un tampon d'éthidium 1X TAE.
  3. Analyser 30 L des réactions par gel d'agarose. Électrophorese à 10 V/cm à température ambiante pendant environ 1 h. L'avant de teinture Orange G doit être à la fin du gel.
  4. Utilisez un scanner à fluorescence pour imager immédiatement le signal de bromure d'éthidium du gel. Si un plasmide de 3 kb a été utilisé, la bande la plus lente sera des cercles détendus à 3,5 kb, l'ADN linéaire fonctionnera à 3 kb, et le plasmide supercoiled aura la mobilité la plus rapide à 2 kb.
    1. Calculez le volume total de pixels de chaque voie avec un logiciel d'analyse d'images.
    2. Déterminez le volume de pixels des différentes espèces d'ADN, telles que les cercles supercoiled, linéaires et entaillés. Utilisez ces valeurs pour déterminer le pourcentage de chaque espèce d'ADN. Par exemple, une présence accrue de cercles entaillés associés à une fraction par rapport au contrôle négatif indique la présence de nucléase. Le volume de pixels des cercles entaillés dans une voie est divisé par la valeur pixel de l'ADN total. Déterminez un pourcentage en multipliant ce nombre par 100.
  5. Combinez les fractions du deuxième pic d'élution qui contiennent de l'hétérodiste PCD presque pur basé sur l'analyse SDS-PAGE et ont une activité nucléase minimale à indétectable. Notre volume commun typique est de 2 ml.
  6. Chargez l'échantillon à une unité de filtre centrifuge avec une coupure de poids moléculaire de 10 kDa. Centrifugeuse dans une centrifugeuse à seau oscillant à 4000 x g pendant 40 min à 4 oC. Alternativement, un rotor à angle fixe de 35 degrés peut être utilisé à 7500 x g pendant 20 min à 4 oC.
    1. Répétez la centrifugation jusqu'à ce que le volume final de la retentignite soit de 100-200 l.
    2. Inverser l'unité de filtre et récupérer le retentate par centrifugation à 1000 x g pendant 2 min à 4 oC.

4. Purification de chromatographie d'exclusion de taille de PCD

  1. Faire 250 mL de chromatographie d'exclusion de taille (SEC) en cours d'exécution (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glycérol, 0,1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 g/mL Leupeptin, et 87,1 g/mL PMSF). Passer le tampon à travers un filtre à pores de 0,2 m et le stocker à 4 oC.
    Note: Effectuer toutes les étapes dans une pièce réfrigérée à 4 oC. La purification SEC est facultative, mais la protéine doit être stockée dans le tampon de fonctionnement SEC. Si la purification SEC est omise, la retentate recueillie en 3.6.2. doit être dialysé contre 1 L de tampon SEC dans 10 kDa MWCO (poids moléculaire coupé) tube de dialyse à 4 oC pendant la nuit.
  2. Équilibrez une colonne d'agarose croisée SEC (chromatographie d'exclusion de taille) (dimesions : 10 mm x 300 mm ; volume de lit de 24 mL ; volume d'échantillon de 25 - 500 L ; limite de pression de 1,5 MPa ; limite d'exclusion de 2 x 106 limite d'exclusion de Da ; 1 à 300 kDa séparation) avec sec Buffer courant à 0.5 mL/min.
    Note: Si les colonnes SEC de taille alternative souhaitées peuvent être utilisées.
  3. Chargez les fractions concentrées sur une boucle d'injection de volume de 200 ll. Chargez l'échantillon à 0,5 ml/min à la colonne. La résolution SEC augmente avec un volume de charge plus faible. Elute avec 23 mL SEC en cours d'exécution tampon et de recueillir 94 fractions de 250 L. Le chromatogramme SEC devrait résoudre un seul A280 pic qui est l'hétérodiste PCD. Nous constatons que PCD élute 8,9 mL. Le calendrier de l'élution changera avec d'autres colonnes SEC.

5. L'oxydation de PCA et les essais d'activité de nucléane

  1. Les réactions à l'assiduation de PCA et d'activité nucléane sont exécutées dans une plaque à fond plat de 96 puits. Assembler les réactions dans une plaque de puits 96 sur la glace dans une chambre froide à 4 oC pour prévenir une catalyse prématurée. Combiner dans un volume final de 50 OL : 130 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT, 5 mM PCA, 10 ng/mL plasmide pXbaMD et 10 euros de fractions individuelles PCD SEC SEC.
    Note: Les fractions DEC SEC doivent être ajoutées en dernier et immédiatement avant l'analyse car la protéine commencera la catalyse au moment de l'ajout.
  2. L'oxydation du PCD de PCA se traduit par une absorption réduite de PCA à 290 nm (A290). Transférer la plaque de puits 96 sur le support de plaque d'un lecteur de plaque réglé à une température interne de 37 oC. Retirez le porte-plaque dans l'instrument et mesurez A290 à 20 s intervalles pendant 1 h. Demandez à l'instrument de secouer la plaque 5 s avant chaque lecture.
  3. Après 1 h, terminez les réactions en ajoutant une solution d'arrêt de 10 l (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% de glycérol, 0,15% d'Orange G).
  4. Préparer, charger et exécuter un gel d'agarose comme à l'étape 3.2.
  5. Image et analyse du gel agarose comme à l'étape 3.3.
  6. Sélectionnez les fractions ayant l'activité d'oxydation la plus importante de l'APC et aucune contamination à nucléane observée pour un stockage à long terme à -80 oC. Mesurer l'A280.
  7. Calculer la concentration totale de PCD à l'aide de l'A280 et du coefficient d'extinction(280) de 734 700 M-1cm-1.
  8. Congeler les fractions individuelles dans l'azote liquide. Conserver dans un congélateur à -80 oC. Vous pouvez également combiner des fractions actives sans nucléarité, aliquot, et congeler de la même manière. Notre rendement typique est de 1-2 mg PCD par culture L. L'utilisation typique dans une expérience SM est de 3 g PCD. Nous avons utilisé le PCD stocké à -80 oC jusqu'à 1 an sans diminution de l'activité.

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Résultats

Le PCD de récupération d'oxygène disponible dans le commerce est fréquemment contaminé par une nucléase d'ADN. La contamination de l'activité nucléase pourrait mener à de faux résultats dans des études fluorescentes, en particulier des études qui analysent l'ADN ou l'ADN interagissant protéines. Nous avons constaté que le PCD recombinant, un hétérodiste d'hexahistidine marqué pcaH et pcaG, peut être exprimé dans E. coli (Figure 1). L'hétérodiste est d'abord p...

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Discussion

Les systèmes de récupération d'oxygène sont généralement inclus dans la microscopie à fluorescence à molécule unique pour réduire le photoblanchiment3,7,8. Ces techniques de microscopie sont souvent utilisées pour observer les acides nucléiques ou les interactions protéiques avec les acides nucléiques1,13,14. La contamination des OSS pa...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par NIH GM121284 et AI126742 à KEY.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-MercaptoéthanolSigma-AldrichM3148&beta ;
ME Solution d’acrylamide et de bis-acrylamide à 30 %, 29:1Bio-Rad161-0156
Acide acétique, certifié glacial ACSFisherl ChemicalA38C-212
Agar, GranuléBD BiosciencesDF0145-17-0
AKTA FPLC SystemGE Healthcare Life SciencesAKTA Purificateur : Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900 et Frac-920
Unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-2EMD MilliporeUFC20102410 kDa MWCO Sulfate
fer (II) d’ammonium hexahydratéSigmaF-2262
Persulfate d’ammonium (APS) ComprimésAmrescoK833-100TABS
AmpicillineAmresco0339-25G
Bacto TryptoneBD BiosciencesDF0123173
BD Bacto Milieu de culture déshydraté Additif : Extrait de levure en bouteilleVWR90004-092
BIS-TRIS propane,>=99,0 % (titrage)Sigma-AldrichB6755-500G
Bleu de bromophénolSigma-AldrichB0126-25G
Coomassie Brilliant BlueAmresco0472-50G
Costar 96&ndash ; Bien plat&ndash ; Plaque inférieure EIABio-Rad2240096EDU
DTTP212121SV-DTT
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 500MLSigma-AldrichD8537-500MLPBS
Bromure d’éthidiumThermo Fisher ScientificBP1302
GlycérolFisher ScientificG37-20
Bouillon LB granulé MillerEMD Biosciences1.10285.0500
Hi-Res Standard AgaroseAGTC BioproductsAG500D1
ImidazoleSigma-AldrichI0250-250G
IPTGGoldbioI2481C25
LeupeptinRoche11017128001
Lysozyme de Blanc d’Oeuf de PouleSigma-AldrichL6876-1G
Chlorure de magnésium hexahydratéAmresco0288-1KG
Spectrophotomètre à microvolume, avec capacité cuvetteThermo FisherND-2000C
NaClP212121RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml)Qiagen30430
Novagen BL21 Competent CellsEMD Millipore69-449-3Média SOC inclus
Orange GFisher Scientific0-267
PepstatineGold BiotechnologyP-020-25
PMSF Amresco0754-25G
Acide protocatéchuiqueFisher ScientificICN15642110PCA
Dodécylsulfate de sodiumP212121CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Lecteur de microplaquesMolecular Dispositifs
Unités de filtration jetables stériles avec membrane PES > 250mLThermo Fisher Scientific09-741-04
Unités de filtration jetables stériles avec membrane PES > 500mLThermo Fisher Scientific09-741-02
Superose 12 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences17517301
TEMEDAmresco0761-25ML
Tris Ultra PureGojira Fine ChemicalsUTS1003
Typhoon 9410GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTAInvitrogen/Gibco15575
ZnCl2Sigma-Aldrich208086
de Imageur fluorescent à mode variable

Références

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Expression et purification de PCDchromatographie d affinit sur nickelchromatographie d exclusion st riquemicroscopie sur mol cule uniquesyst me de pi geage de l oxyg neprotocole de transformation plasmidiqueinduction de culture bact riennedosage de l activit nucl ase
Expression et purification de nuclease-Free Oxygen Sccatechuate 3,4-Dioxygenase
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