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Article de méthode

Mesures par caméra de [Na+] intracellulaire dans des myocytes auriculaires murins

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DOI :

10.3791/59600

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27 mai 2022

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1Center for Biomedical Engineering and Technology and Department of Physiology, University of Maryland School of Medicine, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

Dans cet article

Résumé

La concentration intracellulaire de Na+ ([Na+]i) dans les myocytes cardiaques est altérée au cours des maladies cardiaques. [Na+]i est un régulateur important du Ca2+ intracellulaire. Nous introduisons une nouvelle approche pour mesurer [Na+]i dans des myocytes auriculaires murins fraîchement isolés à l’aide d’une caméra EMCCD (Electroplying Pliplying Charge Coupled Device) et d’un illuminateur rapide et contrôlable.

Résumé

La concentration intracellulaire de sodium ([Na+]i) est un régulateur important du Ca2+ intracellulaire. Son étude donne un aperçu de l’activation de l’échangeur sarcolemmal Na+/Ca2+ , du comportement des canaux Na+ voltage-dépendants et de la Na+,K+-ATPase. La signalisation intracellulaire Ca2+ est altérée dans les maladies auriculaires telles que la fibrillation auriculaire. Alors que de nombreux mécanismes sous-jacents à l’homéostasie intracellulaire altérée du Ca2+ sont caractérisés, le rôle du [Na+]i et de sa dérégulation dans les pathologies auriculaires est mal compris. [Na+]I dans les myocytes auriculaires augmente en réponse à l’augmentation des taux de stimulation. La réactivité à la stimulation du champ externe est donc cruciale pour les mesures de [Na+]i dans ces cellules. De plus, la longue préparation (chargement du colorant) et la durée de l’expérience (étalonnage) nécessitent un protocole d’isolement qui permet d’obtenir des myocytes auriculaires d’une qualité exceptionnelle. En raison de la petite taille des oreillettes de souris et de la composition de la matrice intercellulaire, l’isolement de myocytes auriculaires murins adultes de haute qualité est difficile. Ici, nous décrivons un protocole d’isolement optimisé basé sur la perfusion de Langendorff qui fournit constamment un rendement élevé de myocytes murins auriculaires de haute qualité.

L’isophtalate de benzofurane se liant au sodium (SBFI) est l’indicateur fluorescent Na+ le plus couramment utilisé. Le SBFI peut être chargé dans le myocyte cardiaque, soit sous sa forme saline, à l’aide d’une pipette en verre, soit sous forme d’ester acétoxyméthylique (AM) qui peut pénétrer dans la membrane sarcolemmale du myocyte. Intracellulairement, le SBFI-AM est désestérifié par des estérases cytosoliques. En raison des variabilités de pénétration membranaire et de désestérification cytosolique, chaque cellule doit être calibrée in situ. En règle générale, les mesures de [Na+]i à l’aide de l’épifluorescence de cellules entières SBFI sont effectuées à l’aide d’un tube photomultiplicateur (PMT). Ce dispositif expérimental permet de ne mesurer qu’une seule cellule à la fois. En raison de la longueur de chargement du colorant des myocytes et de l’étalonnage après chaque expérience, le rendement des données est faible. Nous avons donc développé une technique basée sur une caméra EMCCD pour mesurer le [Na+]i. Cette approche permet des mesures simultanées de [Na+]i dans plusieurs myocytes, augmentant ainsi considérablement le rendement expérimental.

Introduction

Dans les maladies auriculaires (par exemple, la fibrillation auriculaire [FA]), la signalisation intracellulaire Ca2+ est profondément altérée1. Bien que de nombreux mécanismes sous-jacents de la signalisation intracellulaire Ca2+ « remodelée » dans la FA aient été bien caractérisés 2,3, le rôle qu’une concentration intracellulaire modifiée de sodium ([Na+]i peut jouer est mal compris. [Na+]i est un régulateur important du Ca2+ intracellulaire. L’étude de [Na+]i peut fournir des informations sur l’activation de l’échangeur sarcolemmal Na+/Ca2+ (NCX), le comportement des canaux Na+ et de la Na+,K+-ATPase (NKA)4. Nous avons précédemment montré que des taux d’activation auriculaire élevés, comme c’est le cas lors de la FA, entraînent une réduction significative de [Na+]i 1. Des travaux antérieurs ont montré une augmentation de la densité de courant NCX (INCX) et des niveaux d’expression des protéines dans AF3. Une augmentation de la composante tardive du courant Na+ voltage-dépendant (INa, tardif) dans les myocytes auriculaires isolés de patients atteints de FA a également étésignalée 5. Ainsi, il existe des preuves de changements profonds dans l’homéostasie intracellulaire Na+ dans la FA. Des mesures fiables et reproductibles de [Na+]i dans des myocytes auriculaires isolés sont donc nécessaires pour approfondir notre compréhension de la pathologie de la FA. Ici, nous montrons comment isoler de manière reproductible des myocytes auriculaires murins de haute qualité qui conviennent aux mesures de [Na+]i. Nous avons concentré notre protocole optimisé d’isolement de cellules auriculaires sur des myocytes auriculaires murins, car les modèles murins transgéniques (TG) de fibrillation auriculaire sont devenus un élément essentiel de la recherche sur la FA6. Ces souris ne sont souvent disponibles qu’en nombre limité et les oreillettes sont souvent fibreuses, ce qui pose des problèmes d’isolement cellulaire.

En général, le [Na+]i dans les cellules viables peut être mesuré à l’aide d’indicateurs fluorescents 7,8, ou à l’aide de différents types de microélectrodes9. Les techniques à base de microélectrodes nécessitent la pénétration de la membrane sarcolemmale. Cette technique est donc limitée aux cellules plus grandes et ne convient pas aux myocytes auriculaires petits et étroits dont l’intégrité cellulaire est facilement compromise.

L’isophtalate de benzofurane se liant au sodium (SBFI) est un indicateur fluorescent qui subit un grand décalage de longueur d’onde lors de la liaison au Na+ 7. Le SBFI est excité alternativement à 340 nm et 380 nm et la fluorescence émise est collectée après avoir traversé un filtre d’émission (510 nm). Les rapports des signaux aux deux longueurs d’onde d’excitation (F340/380) peuvent annuler la longueur du trajet local, la concentration du colorant et les variations indépendantes de la longueur d’onde de l’intensité de l’éclairage et de l’efficacité de détection. Lorsqu’un étalonnage in situ à l’aide de solutions dont la concentration en sodium ([Na+]) est connue dans chaque cellule, le rapport F340/380 obtenu au cours de l’expérience permet d’obtenir des mesures précises et sensibles de [Na+]i. Comme tous les indicateurs Na+ , SBFI affiche également une certaine affinité pour K+. L’utilisation de la méthode d’étalonnage présentée ici permet de « fixer » de manière fiable la concentration de [Na+]i et de potassium intracellulaire ([K+]i) pendant le processus d’étalonnage, de sorte que [Na+]i peut être étalonné de manière fiable même lorsqu’il est <10 % de [K+]i 10.

Nous introduisons une nouvelle technique basée sur une caméra EMCCD pour les mesures ratiométriques de [Na+]i à l’aide de SBFI. La caméra EMCCD permet, pour la première fois, des mesures (et un étalonnage) simultanés de [Na+]i dans plusieurs cellules. Ceci est particulièrement bénéfique dans un cadre expérimental où le nombre d’animaux est limité (par exemple, des modèles de souris transgéniques). En règle générale, les mesures de [Na+]i à l’aide de SBFI sont effectuées à l’aide d’un tube photomultiplicateur (PMT) pour recueillir l’épifluorescence de cellules entières 1,11. Alors que les PMT offrent une très bonne résolution temporelle du signal de fluorescence, la résolution spatiale est très faible et les expériences sont limitées à une cellule à la fois.

Notre nouveau protocole facilite des mesures hautement reproductibles et sensibles de [Na+]i. Il est optimisé pour l’acquisition simultanée de modifications de [Na+]i dans plusieurs myocytes auriculaires murins, mais est adaptable à de nombreux autres types de cellules.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Maryland, à Baltimore.

1. Isolement des myocytes auriculaires à partir de cœurs murins adultes

  1. Placez chaque souris dans un vaporisateur de précision et une chambre d’induction gazée à l’isoflurane dans 100 % d’oxygène.
  2. Réglez le débit d’isoflurane à 1 % jusqu’à ce que l’animal ne réponde plus avant d’administrer une injection intrapéritonéale d’héparine (1-1,25 U/g) 15 minutes avant l’euthanasie.
  3. Anesthésie en profondeur la souris en augmentant l’anesthésie à l’isoflurane à 5 % et confirme le plan profond de l’anesthésie par pincement du pied.
  4. Effectuer l’euthanasie en pratiquant une thoracotomie rapide12 ; Utilisez des pinces à motif standard et des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir le thorax. Mobilisez passivement le cœur et les poumons, isolez l’arc aortique, maintenez avec des pinces et coupez l’aorte pour retirer le cœur.
  5. Placez le cœur dans un tampon d’isolement de cellules libres Ca2+ froid (CIB, tableau 1).
  6. Canuler l’aorte à l’aide d’une canule de 22 G et l’attacher à l’aide d’une suture en soie au microscope optique avec un grossissement de 3x dans une solution de CIB (Figure 1A,B).
  7. Confirmez que la canule se trouve bien au-dessus des sinus aortiques en délivrant la solution CIB à travers la canule reliée à une seringue et confirmez la perfusion de l’artère coronaire au microscope.
    REMARQUE : Cette étape est importante pour assurer une bonne perfusion du tissu auriculaire car il a été démontré que l’anatomie de l’artère coronaire est très variable chez la souris13.
  8. Montez le cœur sur un dispositif de Langendorff par gravité et perfuser avec la solution de CIB sans Ca2+ pendant 5 min à 37 °C pour éliminer le sang restant jusqu’à ce que l’éluat soit clair (Figure 1C).
  9. Passer à la solution enzymatique (tableau 2) et perfuser pendant 3 à 5 minutes à 37 °C jusqu’à ce que le tissu auriculaire soit mou et flasque.
  10. Exciser les oreillettes droite et gauche à l’aide d’une pince à super-préhension et de petits ciseaux à ressort et transférer dans une petite boîte de culture contenant la solution enzymatique CIB utilisée à l’étape 1.8 mais avec 0,15 mM de CaCl2 et placer dans un incubateur à 37 °C pendant 5 à 8 min (figure 1D).
  11. Transvaser les oreillettes dans une boîte de culture cellulaire contenant 4 mL de solution de conservation préchauffée (37 °C) (solution de Tyrode modifiée (tableau 3) contenant 15 mM d’albumine sérique bovine et 30 mM de monoxyde de 2,3-butanedione).
  12. Coupez les oreillettes en petites bandes de tissu (10 à 20, selon la taille de l’oreillette) à l’aide de petits ciseaux à ressort et d’une pince à super prise.
  13. Pour la dissociation mécanique, aspirez doucement la suspension tissulaire à l’aide de différentes pipettes Pasteur en verre poli au feu avec des ouvertures comprises entre 2 et 5 mm. Commencez par la plus grande pointe de pipette et passez à la plus petite pointe de pipette, en aspirant 5 à 10 fois par pipette.
  14. Filtrez la suspension cellulaire à travers un filtre de 200 μm et ajoutez du CaCl2 trois fois toutes les 10 min pour obtenir une concentration finale de 0,3 mM.

2. Évaluation de la qualité des cellules

  1. Placez 200 μL de la suspension cellulaire contenant les myocytes auriculaires fraîchement isolés sur une lamelle en verre.
  2. Utilisez un objectif 10x pour compter toutes les cellules dans le champ de vision et classez-les comme arrondies ou en forme de bâtonnet. Déterminez combien de cellules en forme de bâtonnet présentent une striation transversale claire (passez à l’objectif 25x si cela est difficile à déterminer, voir Figure 2C).
  3. Répétez les étapes 2.1 et 2.2.
  4. Calculez les pourcentages de cellules arrondies, en forme de bâtonnet et en forme de bâtonnet avec des cellules de striation transversale claires.
  5. Modifiez la procédure d’isolement cellulaire jusqu’à ce que 80 % des cellules soient en forme de bâtonnet avec une striation transversale claire.
  6. Placez 500 μL de suspension cellulaire auriculaire sur une lamelle en verre recouverte de laminine et placez la chambre cellulaire sur le microscope inversé. Laissez les cellules se déstabiliser pendant 5 min. Perfuser avec la solution de Tyrode contenant 1,8 mM de Ca2+.
  7. À l’aide d’un système de stimulation cellulaire, démarrez la stimulation du champ électrique (impulsion bipolaire de 2 ms, 30 V) à 0,5 Hz et comptez le nombre de cellules qui se contractent dans le champ de vision d’un objectif 10x.
  8. Répétez l’opération avec une stimulation du champ externe à 3 Hz.
  9. Calculez le pourcentage de cellules répondant à des taux de stimulation de 0,5 et 3 Hz (voir Figure 2B). Affinez le protocole d’isolement cellulaire jusqu’à ce que 50 % des cellules répondent à une stimulation de champ de 3 Hz.

3. Charge indicatrice Na+ de myocytes auriculaires murins fraîchement isolés

  1. Utilisez l’ester acétoxyméthylique (AM) perméable à la cellule de l’indicateur fluorescent de l’isophtalate de benzofurane liant le sodium (SBFI-AM).
  2. Pour faciliter la dispersion du colorant et obtenir une charge cellulaire homogène, dissoudre le SBFI dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) et les polyols tensioactifs appropriés (par exemple, pluronique) pour atteindre une concentration finale de 10 μM SBFI dans la suspension cellulaire.
  3. Chargez les cellules avec SBFI pendant 60 min à l’abri de la lumière sur une bascule à température ambiante.
  4. Laissez les cellules se déstabiliser pendant 30 min, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans une solution de stockage (1 à 2 ml).
    REMARQUE : Les expériences doivent être effectuées dans les 4 heures suivant l’isolement de la cellule. Le BDM est éliminé par perfusion avec la solution de Tyrode avant le début des expériences14.

4. Instrumentation, mesures de [Na+]i et étalonnage de [Na+]i

REMARQUE : La figure 3 illustre le schéma du trajet de la lumière pour l’instrumentation expérimentale.

  1. Préparez des solutions d’étalonnage avec des concentrations croissantes de Na+ comme décrit dans les Tableaux 4 à 6.
  2. Ajouter l’agent perméabilisant gramicidine D (10 μM ; à partir d’une solution mère conservée à -20 °C) et l’inhibiteur de l’ATPase Na+, K+ , strophanthidine (100 μM, à partir d’une solution mère conservée à -20 °C) dans chaque solution d’étalonnage. Vortex bien, ou utilisez un sonicateur pour vous assurer que la gramicidine et la strophantidine sont complètement dissoutes.
  3. Remplir un système de perfusion à barils multiples avec les solutions d’étalonnage contenant l’augmentation du [Na+]o préparées aux étapes 4.1 et 4.2. Connectez-vous à une chambre cellulaire en utilisant des vitesses de perfusion lentes (~1 mL/min ; les vitesses de perfusion peuvent varier en fonction du volume de la chambre cellulaire).
  4. Raccordez l’aspiration à la chambre cellulaire et recueillez le perfusat dans un récipient (en verre) approprié sur le sol.
  5. Arrêtez la perfusion et l’aspiration.
  6. Après avoir pris en compte 30 min de désestérification SBFI, placez 100 μL de la suspension cellulaire concentrée (étape 3.5) chargée de colorant sur une lamine de recouvrement en verre recouverte de laminine au-dessus du champ de vision de l’objectif 40x du microscope inversé.
  7. Utilisez un illuminateur à commutation rapide avec une source lumineuse au xénon de 300 W. Obtenez une imagerie à grand champ avec deux longueurs d’onde d’excitation (340 nm et 380 nm) à l’aide de miroirs de balayage à commutation rapide et de filtres d’excitation à bande passante étroite (340 nm ± 10 nm ; 380 nm ± 10 nm).
  8. Optimiser le champ de vision de la caméra EMCCD. Une zone d’observation plus grande nécessite des temps d’image plus longs. Des temps de trame plus longs entraînent plus de blanchiment de l’indicateur. Ainsi, équilibrez la taille du champ de vision et le temps de trame afin qu’aucun blanchiment notable de la sonde ne se produise.
  9. Déterminez qu’il n’y a qu’une fluorescence intrinsèque minimale dans un sous-ensemble de cellules auriculaires qui ne sont pas chargées en SBFI en vous assurant que la fluorescence intrinsèque des cellules est similaire à la fluorescence de fond (comme le montre la figure 4).
  10. Déterminer la fréquence d’échantillonnage appropriée en fonction du plan d’expérience (les fréquences d’échantillonnage peuvent être faibles car les variations de [Na+]i sont relativement lentes (par exemple, un point de données acquis toutes les 10 à 20 s).
  11. Atténuez la lumière d’excitation à l’aide de filtres à densité neutre (ND) appropriés et en réduisant de manière appropriée l’intensité de la source lumineuse (par exemple, en modifiant l’intensité dans le logiciel d’exploitation).
  12. Collecter la lumière d’émission à 510 ± 40 nm à l’aide de filtres appropriés avec une caméra EMCCD connectée au microscope inversé.
  13. Définissez une zone d’intérêt (ROI) pour chaque cellule et un ROI d’arrière-plan (voir Figure 4). Soustrayez l’arrière-plan des signaux F340 et F380 enregistrés (en ligne ou pendant l’analyse des données).
  14. Lancez l’acquisition des données.
  15. Redémarrer la perfusion et l’aspiration. Perfuser pendant 10 à 15 minutes avec la solution de Tyrode contenant 1,8 mM de Ca2+ et enregistrer une ligne de base stable de F340/380 avant de commencer l’expérience.
    REMARQUE : Assurez-vous d’enregistrer une base stable pendant 10 à 15 min. En cas de blanchiment (par exemple, réduction de la valeur de référence F340/380 ), visez à atténuer davantage l’intensité de l’éclairage en augmentant la densité du filtre ND, en diminuant l’intensité du signal lumineux d’excitation et/ou le temps d’acquisition de l’image (voir étapes 4.10 à 4.11).
  16. Démarrez la mesure de [Na+]i en fonction de la question de recherche.

5. Étalonnage [Na+]i

  1. Après la conclusion de l’expérience (étape 4.16), effectuez un étalonnage du signal F340/380 dans chaque cellule in situ.
  2. Étalonnez le signal F340/380 en perfusant les myocytes chargés de SBFI avec les solutions d’étalonnage (préparées aux étapes 4.1 à 4.3).
  3. Perfuser par étapes pour élever [Na+]o de 0 à 20 mM. Attendez un signal F340/380 stable avant de passer à la concentration suivante (~5 min selon le débit ; voir Figure 3B et Figure 5A).
    REMARQUE : La relation entre le signal F340/380 et le [Na+] des solutions d’étalonnage doit être linéaire pour un étalonnage valide du signal F340/380 (Figure 5 et Figure 6).

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Résultats

Évaluation de la qualité des cellules auriculaires
Des myocytes auriculaires fraîchement isolés ont été évalués en fonction de la morphologie cellulaire et de la réponse à la stimulation de terrain, comme indiqué dans le protocole, dans six isolements consécutifs de cellules auriculaires. Les données présentées dans la figure 2 montrent un pourcentage très élevé de myocytes auriculaires en forme de bâtonnets qui conservent une striation tr...

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Discussion

Ici, nous présentons une nouvelle technique basée sur une caméra EMCCD pour la mesure quantitative simultanée de [Na+]i dans plusieurs myocytes auriculaires viables à l’aide de l’isophtalate de benzofurane se liant au sodium (SBFI). L’approche décrite ici est la première à permettre la mesure simultanée de [Na+]i dans plusieurs cellules. Les principaux avantages de ce nouveau protocole sont (i) l’augmentation significative du rendement expérime...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention de développement scientifique de l’American Heart Association (14SDG20110054) à MG ; la subvention de formation interdisciplinaire des NIH en biologie musculaire (T32 AR007592) et la subvention de formation sur les maladies cardiovasculaires des NIH (2T32HL007698-22A1) à LG ; une subvention de développement scientifique de l’American Heart Association (15SDG22100002) à LB et des subventions R01 HL106056, R01 HL105239 et U01 HL116321 à WJL par les NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Monxime 2,3-butanedione (BDM)Sigma-AldrichB0753
340 Filtred’excitation ChromaET40X25 mm
380 Filtred’excitation ChromaET80X25 mm
510 Filtre d’émissionChromaET510/80m25 mm
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA7906
Piège à bullesBD Medical Technologies904477Fabriqué sur mesure à partir d’une seringue Luer Lok de 5 ml, qui se trouve dans le trajet du tube de la solution perfusante à la solution de canule
CaCl2Sigma-Aldrich21115
CanuleBD Medical Technologies305167fabriquée sur mesure à partir d’une aiguille de 22 G x 1 1/2 pouce. Coupez à 1 pouce et poncez l’extrémité distale de 1 mm.
Chambreusinée sur mesure avec une ouverture qui peut maintenir en toute sécurité un couvercle en verre de 25 mm et avec un couvercle doté d’un orifice d’entrée et d’un orifice de sortie pour la perfusion.
Bain-marie à circulationVWR
Collagenase IIWorthingtonLS004176Activité spécifique 290 U/g
CréatinineSigma-AldrichC0780
DG5-plus illuminateurSutter Instrument LambdaDG-4/DG-5 Plus
DMSOThermo FischerBP231
EGTASigma-AldrichE4378
Caméra EMCCDPrinceton InstrumentsProEM-HS
Hémostats finsOutils scientifiques fins130-20
Ciseaux finsOutils scientifiquesfins 14060-10
Pince SupergripOutils scientifiques fins00632-11
Couvercles en verre glissesVWR4838089cercle de 25 mm
GlucoseSigma-AldrichG7528
Gramicidin DSigma-AldrichG5002
HEPES Sigma-AldrichH3375
Tube intérieur en silicone VWRVWRselect marque tube en silicone
Microscope inverséNikon InstrumentsNikonTE 2000 U
Outils
K GluconateSigma-AldrichP1847
KCISigma-AldrichP5405
KH2PO4Calbiochem529568
Langendorff Appareil
MgCl2.6H2O *Sigma-AldrichM0250
Stimulateur cellulaireIonOptix
Na GluconateSigma-AldrichS2054
NaClSigma-AldrichS9888
NaH2PO4Sigma-AldrichS9390
Natural Mouse LamininThermo Fischer230170150.5-2.0 mg/ml
Tube extérieurVWR
Boîte de Pétri 35X10 mmFalcon351008
PowerLoadThermo FischerP10020
Protéase XXIVSigma-AldrichP8038
SBFI-AMThermo FischerS1264
Suture en soieFine Science Tools18020-50Diamètre 0,12 mm
Petits ciseaux à ressortFine Science Tools15000-03
Pince à motif standardOutils de science fine11000-12
StrophanthidinSigma-AldrichG5884
Ciseaux chirurgicaux Tough CutFine Science Tools14054-13
Pince de serrage de sutureOutils de science fine00272-13
TaurineSigma-AldrichT0625
TrisbaseSigma-AldrichTRIS-RO
TrypsineSigma-AldrichT0303
UVFS Réfléchissant 0.1 Filtre NDThorlabsNDUV01B25 mm
UVFS Réfléchissant 0.2 Filtre NDThorlabsNDUV02B25 mm
UVFS Réfléchissant 0.3 Filtre NDThorlabsNDUV03B25 mm
UVFS Réfléchissant 0.5 ND FiltreThorlabsNDUV05B25 mm
UVFS Réfléchissant 1 Filtre NDThorlabsNDUV010B25 mm
cellulaire d’isolationde perfusion

Références

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