Fonctionnalisation des cantilevers de microscope de force atomique avec des cellules simples-T ou une seule particule pour la spectroscopie immunologique de force unicellulaire

Summary

Nous présentons un protocole pour fonctionnaliser le microscope de force atomique (AFM) cantilevers avec une seule cellule T et particule de perle pour des études immunologiques. Des procédures pour sonder la liaison de cellule T-dendritic à paire simple par AFM et pour surveiller la réponse cellulaire en temps réel des macrophages à une seule particule solide par AFM avec la formation image de fluorescence sont montrées.

Abstract

La spectroscopie à force atomique à base de force monocellulaire (AFM-SCFS) est un outil puissant pour étudier les propriétés biophysiques des cellules vivantes. Cette technique permet de sonder les forces d'interaction et la dynamique sur une membrane cellulaire vivante, y compris celles entre les cellules, les récepteurs et les ligands, et aux côtés de nombreuses autres variations. Il fonctionne également comme un mécanisme pour fournir un stimulus physique ou biochimique sur les cellules simples d'une manière spatiotemporellement contrôlée, permettant ainsi l'activation cellulaire spécifique et les événements cellulaires suivants à surveiller en temps réel lorsqu'il est combiné avec la cellule vivante l'imagerie par fluorescence. L'étape clé de ces mesures AFM-SCFS est la fonctionnalisation en porte-à-faux AFM, ou en d'autres termes, l'attachement d'un sujet d'intérêt au porte-à-faux. Ici, nous présentons des méthodes pour modifier des cantilevers d'AFM avec une seule cellule T et une perle de polystyrène simple respectivement pour des études immunologiques. Le premier implique une colle biocompatible qui associe les lymphocytes T simples à la pointe d'un porte-à-faux plat dans une solution, tandis que le second s'appuie sur une colle époxy pour l'adhérence à perles simples dans l'environnement de l'air. Deux applications immunologiques associées à chaque modification de porte-à-faux sont également fournies. Les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptées à différents types de cellules et de particules solides.

Introduction

La microscopie de force atomique (AFM), un outil polyvalent, a trouvé de nombreuses applications dans la recherche en biologie cellulaire^1,2,3,4,5. Outre sa capacité d'imagerie à haute résolution, la fonction de recherche de force native permet d'étudier directement in situ les propriétés biophysiques des cellules vivantes au niveau unicellulaire^6,7. Il s'agit notamment des rigidités des structures subcellulaires ou même des cellules entières

Protocol

Le protocole d'expérience de la souris suit les directives de soins aux animaux de l'Université de Tsinghua

1. Fonctionnalisation en porte-à-faux avec des lymphocytes T simples

1. Préparation des cellules de la rate de souris
   1. Sacrifiez la souris (8-16 semaines d'âge (soit sexe); par exemple, c57BL/6 souche) en utilisant le dioxyde de carbone, suivie d'une luxation cervicale.
   2. Nettoyez la souris avec 75% d'éthanol et faites une incision cutanée médiane suivie d'une splenectomy.
   3. Homogérisez la rate dans 4 ml de PBS contenant 2 % de sérum bovin fœtal (FBS) à l'aide de lames de verre et retirez les agrégats e....

Results

La figure 4A montre les courbes de force-distance typiques de l'interaction de liaison entre la cellule simple-T et le seul DC dans un cycle d'approche-rétractation. La courbe rouge clair est la courbe d'extension et la courbe rouge foncé est la courbe de rétraction. Puisque la courbe d'extension est généralement utilisée pour l'indentation ou l'analyse de rigidité, ici seulement la courbe de rétraction est concernée pour l'adhérence cellulaire. La valeur min.......

Discussion

La spectroscopie à force unicellulaire à base d'AFM a évolué pour devenir un outil puissant pour aborder les propriétés biophysiques des cellules vivantes. Pour ces applications, le porte-à-faux doit être fonctionnalisé correctement afin de sonder des interactions ou des propriétés spécifiques sur les cellules d'intérêt. Ici, les méthodes pour coucoupler la cellule T simple et la perle de micron simple-classée au porte-à-faux tip-less sont décrites respectivement. Pour attacher une seule cellule T au porte-à-faux, une co.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matériel
10 &mu ; l pointe de pipette	Thermo Fisher	104-Q
Tube de 15 ml	Corning	430791
plat de culture de 6 cm de diamètre	NALGENE nunc	150462
plaque de culture 6 puits	JET	TCP011006
AFM Cantilever	NanoWorld	Arrow-TL1-50	cantilever sans pointe
&beta ;-Mercaptoethanol	Sigma	7604
Colle biocompatible	BD Cell-Tak	354240
Isolement des lymphocytes T CD4+ Cocktail	STEMCELL	19852C.1
Lignée cellulaire DC2.4	Un don de K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Particules magnétiques recouvertes de dextor	STEMCELL	SV30010
EDTA	GENEray	Generay-E1101-500 ml
Epoxy	ERGO	7100
Ethanol	twbio	00019
FBS	Ex Cell Bio	FSP500
FcR blocker	STEMCELL	18731
Plaque de recouvrement en verre	vendeur local (Hai Men Lian Sheng)	HX-E37	24mm de diamètre, 0,17mm d’épaisseur
Lames de	verreDépartement de gestion de laboratoire et d’équipement de JinTong, Haimen  ;	N/A
personnalisé H2O2 (30 %)	Sino pharm	10011218
H2SO4	Sino pharm	80120892
HEPES	Sigma	51558
Magnet	STEMCELL	18000
Mesh nylon strainer	BD Falcon	REF 352350
Moesin-EGFP	N/A		cloné en laboratoire
Souris CD25 Kit d’isolement positif des cellules Treg	STEMCELL	18782	Composant : Bloqueur FcR, Cocktail de sélection positive des cellules T régulatrices, Cocktail de sélection PE, Dextran RapidSpheres,
Souris CD4+ Kit d’isolement des cellules Tcell	STEMCELL	19852	Composant : Cocktail d’isolement des cellules CD4+T, Streptavidine RapidSpheres, Rat Serum
NaOH	Lanyi chemical products co., LTD ? Pékin	1310-73-2
PBS	Solarbio	P1022-500
PE selection cocktail	STEMCELL	18151
Pénicilline-Streptomycine	Hyclone	SV30010
PLC&delta ;-PH-mCherry	Addgene	36075
Microsphères de polystyrène 6.0&mu ; m	Polysciences	07312-5
polystyrène tube à fond rond	BD Falcon	352054
Sérum de rat	STEMCELL	13551
RAW264.7	; ATCC
Interleukine humaine recombinante-2	Peprotech	Peprotech, 200-02-1000
Tampon de lyse des globules rouges	Beyotime	C3702
Cocktail de sélection positive des lymphocytes T régulateurs	STEMCELL	18782C
RPMI 1640	Life	C11875500BT
Chambre d’échantillonnage	Fait maison
Particules magnétiques enrobées de streptavidine	STEMCELL	50001
Kit de transfection	Clontech	631318
Trypsine 0,25 % EDTA	Life	25200114
Pince à épiler	JD	N/A
Name	Company	Numéro de catalogue	< strong>Comments
Equipment
20x objectif NA 0.8	Zeiss	420650-9901	Plan-Apochromat
Microscope à force atomique	JPK	cellHesion200
Centrifugeuse	Beckman coulter	Allegra X-12R
Imagerie	par fluorescencemicroscope à fluorescence à fluorescence à réflexion interne totale de type objectif fait maison sur support de microscope
Incubateur CO2 humidifié	Thermo Fisher	HERACELL 150i
Microscope à lumière inversée	Zeiss	Observer A1 manuel