Décrit ici est l'utilisation de plusieurs outils faits maison pour transférer, refroidir et tuer d'adultes Drosophila, ainsi que pour nettoyer les flacons de culture du verre et de recueillir des œufs. Ces outils sont faciles à fabriquer et sont plutôt efficaces dans la manipulation de La Drosophila.
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Article de méthode
Outils faits maison simples pour manipuler les mouches des fruits—Drosophila melanogaster
Dans cet article
Résumé
Résumé
La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est largement utilisé à la fois dans la recherche biologique et l'éducation en biologie. La manipulation des mouches adultes est courante, mais difficile dans la pratique, car les mouches adultes volent. Démontré ici est de savoir comment faire quelques outils simples et rentables pour répondre à des questions difficiles dans le traitement de Drosophila. Des trous dans les bouchons de mousse sont faits et des bouts de pipette ou des entonnoirs sont insérés dans les trous. Les mouches se déplacent alors seulement dans une direction dans l'assemblage de pointe de pipette/funnel, permettant le contrôle efficace du transfert de Drosophila adulte dans ou hors d'une fiole. Les protocoles existants ont été modifiés pour les mouches d'anesthésie fraîche en se refroidissant dans la glace concassée et en les transférant sur une surface froide et dure. Le banquise est recouvert d'un morceau de gaze médicale qui maintient les mouches immobilisées de l'eau condensée lorsqu'elles sont examinées au microscope stéréomicroscope. Les mouches sont finalement euthanasiées pour le comptage et le tri ou jetées par micro-ondes. Une cage en forme de bouteille a également été développée pour la collecte des œufs, ainsi qu'un dispositif d'économie de main-d'œuvre et un protocole d'accompagnement pour le nettoyage des flacons de culture du verre.
Introduction
La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est un organisme modèle largement utilisé dans la recherche biologique et l'éducation en biologie pour étudier un large éventail de sujets1,2. Les problèmes de base de la manipulation de Drosophila sont le transfert des adultes de flacon à flacon et l'immobilisation des mouches afin qu'ils soient plus faciles à manipuler, comme tous les adultes (sauf pour certains mutants3,4) peuvent voler.
Traditionnellement, un chercheur transfère les mouches d'une fiole à l'autre en tenant deux flacons bouche-à-bouche, en tapant sur les mouches vers le bas ou en permettant aux mouches de voler vers le haut dans une autre fiole, puis en séparant et en rebranchant les deux flacons4. Évidemment, cela exige que l'ouverture de deux flacons avec le même diamètre, et il est difficile de contrôler la quantité de mouches transférées. Pendant ce temps, cela nécessite des mains rapides pour faire le travail, et échapper aux mouches errantes peut entraîner des problèmes pour le laboratoire ou la salle de classe. L'ajout de mouches extra vierges ou de mouches mâles à une croix déjà préparée est une autre tâche de routine dans les expériences Drosophila. Traditionnellement, les mouches doivent être immobilisées dans le flacon de croix avant l'ajout de mouches supplémentaires.
Drosophila adulte sont systématiquement anesthésiés par l'éther, CO2, ou de refroidissement5. Par rapport à l'exposition à l'éther et au CO 2, le refroidissement est l'agent le plus économique pour immobiliser la drosophile adulte et le moins nocif pour les mouches et les chercheurs (surtout les jeunes étudiants)6,7. Cependant, l'eau qui se condense continuellement sur la surface froide ou la chambre mouille les mouches. Il est difficile de déterminer les phénotypes des mouches humides, et ils peuvent facilement être endommagés lors de la manipulation8,9. Cela a empêché la méthode de refroidissement de devenir plus largement acceptée.
Les outils pour le transfert de mouche et une méthode pour le refroidissement de mouche ont été précédemment décrits10. Ici, une technique modifiée d'anesthésie de refroidissement est rapportée qui est sûre, fiable, et faisable pour des expériences de Drosophila. Également décrit sa part dans ce document 1) les méthodes pour tuer les adultes pour le comptage, le tri ou le rejet, 2) les dispositifs et les protocoles d'économie de main-d'œuvre pour le nettoyage des flacons de culture du verre, et 3) une cage simple pour la collecte des œufs. Les outils faciles à concevoir et rentables décrits ici peuvent être utilisés pour répondre aux problèmes difficiles de la manipulation des mouches, et ces méthodes ont été testées et se sont avérées robustes, fiables et faciles à manipuler pour les chercheurs expérimentés et débutants.
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Protocole
1. Préparation d'outils et d'accessoires
- Arrêts tip/funnel
- Obtenir deux bouchons d'éponge (le diamètre des bouchons doit être légèrement plus grand que le diamètre interne des flacons utilisés pour transférer les mouches). Faire un trou dans les centres des bouchons d'éponge avec un fer à souder électrique chauffé.
- Obtenir deux pointes de pipette de 1 ml, couper une en deux transversalement avec un couteau pointu, et jeter l'extrémité pointue. Ensuite, couper 1,5 cm de l'extrémité pointue de la deuxième pointe de pipette. Coller les restes des deux pointes de pipette avec un adhésif tout usage pour faire une pointe allongée pipette (Figure 1A).
- Insérez un entonnoir et la pointe allongée de pipette dans les bouchons d'éponge pour faire un bouchon de pointe et d'entonnoir (ci-après désigné sous le nom de T- et F-stoppers) et plafonner la pointe de pipette avec un tube microcentrifuge de 100 L (Figure 1A).
REMARQUE: La longueur de la tige de l'entonnoir doit être supérieure à la hauteur de la prise. S'il est plus court ou égal à la hauteur de la prise, alors les mouches s'échapperont de l'ouverture de la tige. L'extrémité de la tige d'entonnoir doit être située à au moins 2 cm au-dessus de la surface du milieu de culture ou au fond d'une fiole vide. Les petits entonnoirs (p. ex., diamètre du disque et 60 mm) avec de petits diamètres internes d'ouverture de tige (5 mm) sont préférables. Un verre ou un entonnoir en plastique peut être utilisé pour faire un F-stopper. Cependant, les entonnoirs en plastique sont préférables pour les cours de biologie, car ils se cassent moins facilement que les entonnoirs en verre.
- Aiguilles microdissécation
- Obtenir des crayons mécaniques qui se sentent à l'aise dans la main et des broches d'insectes qui correspondent aux diamètres (p. ex., 0,5 mm, 0,7 mm) de leurs recharges de plomb.
- Couper les extrémités larges des broches d'insectes avec une paire de pinces et déposer la coupe à plat. Remplacer le plomb par les broches (Figure 1B). Appuyez sur le bouton clic et alimentez 0,5 à 1 cm d'une épingle pour effectuer une dissection. Nettoyez la goupille et repoussez-la complètement dans l'arbre du crayon après une activité de dissection pour la rendre sécuritaire à manipuler.
REMARQUE: Les aiguilles microdissés sont utiles non seulement dans les dissections d'organes tels que les glandes salivaires larvaires, mais aussi dans le comptage et le tri des mouches adultes mortes.
- Packs de glace durs
- Obtenir plusieurs sacs de glace durs refreezable (les packs de glace de grande taille sont préférables). La figure 1C montre un ensemble de glace qui a bien fonctionné, qui mesure 26,5 cm x 14,5 cm x 2,5 cm et a les côtés supérieurs et inférieurs qui sont complètement plats.
- Couper la gaze médicale (non stérile) en morceaux légèrement plus petits que les surfaces froides des banquises qu'elles recouvrent. Par exemple, un morceau de gaze médicale légèrement inférieur à 26,5 cm x 14,5 cm est préférable pour couvrir un sac à glace représenté à la figure 1C.
REMARQUE: Les accessoires nécessaires pour ces outils de refroidissement comprennent: une boîte à glaçons (nous avons utilisé une boîte en mousse de 25 cm x 15 cm x 15 cm pour une personne et 37 cm x 28 cm x 20 cm pour plus d'une personne), qui est utilisé pour stocker la glace concassée; une pince à épiler fine, qui sont utilisées pour attraper les mouches réfrigérées par leurs ailes et les transférer à une fiole; une paire de gants de travail de protection, qui sont utilisés pour enlever les sacs de glace réfrigérés d'un congélateur de -20 oC; et le film plastique, qui est utilisé pour couvrir la scène d'un stéréomicroscope.
- Cage de collecte d'oeufs de Drosophila
REMARQUE: Des cages de collecte d'œufs Drosophila prêtes à l'emploi sont disponibles auprès de nombreuses sociétés de biotechnologie11. Décrit ici est une petite cage de collecte d'oeufs en forme de bouteille acrylique pour 60 mm de vaisselle Petri (Figure1D à gauche; la conception de la cage est montré au milieu). Il peut être adapté pour d'autres tailles de plat Petri (par exemple, 100 mm, 35 mm). Cela permet le transfert des mouches dans ou hors de la cage avec facilité. Une cage simple peut être préparée comme suit.- Utilisez un coupe-bouchon pour couper une bouteille de boisson en plastique mou (500 ml, diamètre interne de 65 mm) en un rapport approximatif de 2:1 (extrémité pointue : extrémité émoussée) et jetez l'extrémité émoussée.
- Enveloppez une bande de papier de carte autour d'une plaque de jus de pomme (diamètre interne de 60 mm) avec du ruban adhésif [la plaque de jus de pomme est utilisée pour recueillir les œufs (figure1E, droite)].
- Conducteur de brosse de tube sans fil
- Obtenir un conducteur de forage sans fil (vitesse maximale de 500 tr/min).
- Obtenir une brosse à tube qui a des poils le long de ses côtés ainsi que son front. Idéalement, le diamètre de la brosse devrait être légèrement plus grand que le diamètre des flacons de culture qui doivent être nettoyés. Couper l'extrémité de sa poignée afin qu'elle puisse être insérée dans le mandrin de forage (Figure 1D).
REMARQUE: Les accessoires nécessaires pour ces outils de nettoyage comprennent des éponges en acier inoxydable et de longs gants en caoutchouc manchette.
2. Transfert de mouches adultes de Vial A à Vial B
REMARQUE: Le transfert de mouches adultes d'une flacon à l'autre est la pratique la plus courante menée dans les expériences Drosophila [p. ex., le transfert des mouches de la vieille culture (A) à la culture fraîche (B) ou d'une fiole croisée (A) à une fiole vide (B)] pour l'anesthésie. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour toutes les activités de transfert de mouches adultes. Sauf indication contraire, ce protocole est utilisé pour transférer les mouches de flacon A à flacon B tout au long de ce document.
- Vérifiez soigneusement la tige de l'entonnoir d'un bouchon F et la pointe d'un T-stopper, puis effacez les mouches qui restent dans les bouchons avec une souffleuse d'air en caoutchouc. Cette étape est d'une importance primordiale, surtout lorsqu'un ensemble de T- et F-stoppers est utilisé pour le transfert continu de différentes lignes Drosophila.
- Appuyez sur les mouches dans le flacon A et remplacer son bouchon par un T-stopper, puis branchez le flacon B avec un F-stopper.
- Inverser la fiole A sur flacon B, insérer l'extrémité de la pipette du T-stopper dans l'ouverture de l'entonnoir du f-stopper, frapper le bord du flacon inversé A pour permettre aux mouches de glisser hors de la pointe de la pipette et à travers la tige de l'entonnoir, et tomber dans le flacon B. Si un vieil aliment dans la fiole A devient moins compact, il peut tomber lorsque le flacon A est inversé et frappé. Dans une telle situation, inverser la fiole B sur flacon A et permettre aux mouches de ramper dans le flacon B.
- Séparez le T-stopper du F-stopper. Capde l'extrémité de l'extrémité de la pipette du T-stopper avec un tube de microcentrifuge de 200 L si les mouches restantes dans la fiole A doivent être transférées à d'autres flacons momentanément ; sinon, retirez le T-stopper et rebranchez le flacon A. Retirez le Bouchon F et rebranchez le flacon B.
3. Immobiliser les mouches par refroidissement
- Conserver les glaçons résistants au rexillée dans un congélateur de -20 oC pendant au moins 24 h avant de l'utiliser.
- Placez un glaçage dur et réfrigéré à température ambiante (RT) pendant 20 min. Légèrement humidifier un morceau de gaze médicale non aseptique avec un peu d'eau courante et lui permettre de s'accrocher étroitement à la surface de la banquise. La gaze médicale peut être réutilisée dans le prochain refroidissement de mouche. En même temps, refroidir une fiole vide dans de la glace concassée.
- Transférer les mouches adultes qui doivent être immobilisées dans le flacon vide réfrigéré (CEV). Lorsque les deux flacons de transfert sont séparés, recouvrir le CEV d'un plat Petri ou d'un bouchon et frapper le CEV contre la glace concassée pour taper toutes les mouches dans le CEV vers le bas. Répétez ce processus plusieurs fois jusqu'à ce que toutes les mouches soient immobilisées. Les mouches seront immobilisées dans les 30 s. Ensuite, placez le CEV dans la glace pendant 1 min. Il n'est pas conseillé de transférer trop de mouches en même temps pour l'anesthésie.
- Verser les mouches réfrigérées sur la gaze médicale qui recouvre la banquise. Étalez les mouches qui se chevauchent avec un pinceau et assurez-vous que chaque mouche peut être refroidie par la surface froide du banquise. Si un glaçat dur réfrigéré gonfle légèrement, placez-le sur une serviette et travaillez sur son côté plat.
- Retirez les clips scéniques du stéréomicroscope, couvrez la scène d'un morceau de film plastique et mettez le sac à glace sur scène. Allumez la lumière supérieure (une source de lumière froide est souhaitable), concentrez le stéréomicroscope et déplacez le pack de glace jusqu'à ce que les mouches réfrigérées puissent être vues clairement.
4. Tuer les mouches adultes pour compter, trier ou jeter
- Transférer les mouches adultes dans une fiole vide et la recouvrir d'un plat Petri.
- Inverser le flacon, le chauffer pendant 1 min et 20 s dans un four à micro-ondes, et laisser tomber les mouches mortes dans le plat Petri.
- Mettez des gants de travail protecteurs et sortez le flacon du four à micro-ondes. Versez les mouches mortes sur une carte de papier blanc, comptez ou examinez les mouches avec une aiguille microdisséstante sous un stéréomicroscope, et jetez les corps de mouche dans une poubelle après observation.
- Pour tuer les mouches indésirables, chauffer les mouches pendant 2 à 3 min dans un four à micro-ondes, puis tapoter les carcasses dans une poubelle.
REMARQUE: Il n'est pas conseillé de tuer certaines souches mutantes de l'aile (p. ex., les mutants de longueur d'aile) pour examen, car il est difficile de juger des carcasses si les ailes s'étendent au-delà de la pointe de l'abdomen, ce qui est vu chez les mouches de type sauvage.
5. Transfert de mouches dans / hors de la cage de collecte d'oeufs en forme de bouteille
REMARQUE: Comme mentionné ci-dessus, T- et F-stoppers sont utilisés pour transférer les mouches dans et hors de la cage de collecte des œufs. Les mouches n'ont pas besoin d'être anesthésiés tout au long de ce processus. D'autres détails, tels que la préparation du milieu de jus de pomme, la collecte d'oeufs, et la déchorionisation, peuvent être trouvés dans la littérature12.
- Insérez la cage de collecte d'œufs dans l'assiette de jus de pomme ou montez la plaque de jus de pomme à la cage faite d'une bouteille de boisson gazeuse. Sceller le joint autour des deux composants avec une bande de film de paraffine.
- Placez autant de mouches que possible dans la cage et rebranchez la cage avec un bouchon de mousse après le transfert des mouches.
- Pour changer la nourriture pour les mouches dans la cage, transférer les mouches dans la cage à un flacon vide.
- Remplacer la plaque de jus de pomme et la refermer, puis transférer les mouches de la fiole vers la cage.
- À la fin de la collecte des œufs, transférez les mouches dans un flacon vide et transférez-les dans des flacons de culture.
6. Nettoyage verre Culture Vials
REMARQUE: En général, un flacon de culture ancienne contient des mouches vivantes. Dans le protocole décrit ici, ces mouches n'ont PAS besoin d'être tuées avant de nettoyer à moins qu'il ne s'agit de mouches transgéniques.
- Retirez toute encre marqueur permanente des flacons de culture du verre avec des éponges en acier inoxydable humide.
-
Tremper les flacons de culture dans l'eau courante.
- Remplir un évier de laboratoire d'eau, ajouter du savon liquide à vaisselle dans l'eau et mélanger.
- Immerger les flacons de culture dans l'eau, puis retirer le bouchon, permettant à l'eau de courir dans le flacon. Le détergent à vaisselle dans l'eau fera couler toutes les mouches adultes restantes au fond et se noier dans l'eau.
- Tremper les fioles de la vieille culture dans l'eau pendant au moins 30 min.
- Desserrer le mandrin de la perceuse, insérer la brosse à tube à essai et resserrer le mandrin. Vérifiez la direction du sélecteur de rotation et assurez-vous que la perceuse tourne dans le sens des aiguilles d'une montre. Ajustez le déclencheur de vitesse et assurez-vous que la vitesse maximale est inférieure à 500 tr/min.
-
Nettoyer les flacons de culture.
- Nettoyer les flacons de culture à peu près.
- Placez un long gant en caoutchouc de manchette sur la main non dominante et maintenez le flacon dans l'eau.
- Tenez le conducteur de brosse de tube sans fil avec la main dominante nue, serrez la brosse dans le flacon de culture, et serrez la gâchette.
REMARQUE: Ne trempez pas la batterie dans l'eau. La brosse rotative brisera les vieux aliments, la pupa, etc., et éliminera plus de 95 % des déchets. - Verser les déchets dans une poubelle séparée. Répétez ce processus jusqu'à ce que la plupart des déchets dans chaque flacon aient été nettoyés.
- Nettoyez soigneusement les flacons de culture.
- Nettoyez la brosse à tubes, égouttez et nettoyez l'évier et remplissez-le avec de l'eau propre.
- Retirez les déchets restants de chaque flacon de culture tel que décrit à la section 6.4.1.
- Nettoyer les flacons de culture à peu près.
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Résultats
Les T- et F-stoppers ont été développés comme un ensemble d'outils simples qui peuvent être adaptés et utilisés dans toutes les activités de transfert de mouche. Transférer les mouches d'une ancienne culture à plusieurs cultures fraîches implique d'enlever les bouchons des flacons frais, de les remplacer par des bouchons F, puis de tapoter les mouches dans l'ancienne fiole, de retirer rapidement sa prise et de la remplacer par un bouchon En T. Si l'ancien aliment est compact, alors il est...
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Discussion
Certains outils faits maison pour la manipulation des activités de base impliquées dans l'élevage et l'expérimentation d'origine d'origine d'origine d'origine d'origine sont décrits dans cet article. Ces outils sont simples mais plutôt efficaces. Pratiquement, n'importe quel laboratoire peut fabriquer ces outils facilement, et un laboratoire de recherche ou un laboratoire d'enseignement n'a pas besoin de trouver une alternative prête à l'emploi qui n'est peut-être pas disponible localement.
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Déclarations de divulgation
L'auteur n'a rien à divulguer.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Une paire de pinces | |||
| Perceuse-visseuse | vitesse max : 500 tr/min | ||
| Fer | |||
| Lime | |||
| Entonnoir | diamètre du disque< | ||
| Glacière | |||
| Épingles | |||
| Thermomètre | HCIYET HT-830 | ||
| Gants | |||
| Crayons mécaniques Gaze | |||
| microcentrifugation | 100 ul | ||
| Four à micro-ondes | |||
| Parafilm | |||
| Peri dish | diamètre intérieur 60 mm | ||
| Pointes | 1 ml | ||
| Film | |||
| Peri dish | &Phi ; 36 mm utilisé pour couvrir le flacon vide | ||
| Pince à épiler | |||
| Gants | |||
| Blocs | 26,5& fois ; 14.5&fois ; 2,5 cm ou plus | ||
| d’air en caoutchouc | |||
| Coupe-pression | |||
| Bouteille de | 500 ml, diamètre intérieur env. 65 mm | ||
| Bouchon éponge | |||
| Éponges en acier inoxydable Brosse | |||
| tubulaire | |||
| Vial | & Phi; 34 mm & temps ; 90 millimètre |
Références
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Réimpressions et autorisations
