Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

Yanfang  Peipei Zhu; Lindsey Padgett; Huy  Q. Dinh; Paola Marcovecchio; Runpei Wu; Denise Hinz; Cheryl Kim; Catherine  C. Hedrick

doi:10.3791/59617

Method Article

Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

DOI:

10.3791/59617

⸱

June 19th, 2019

Yanfang Peipei Zhu¹ , Lindsey Padgett¹ , Huy Q. Dinh¹ , Paola Marcovecchio¹ , Runpei Wu¹ , Denise Hinz² , Cheryl Kim² , Catherine C. Hedrick¹

¹Division of Inflammation Biology, La Jolla Institute for Immunology, ²Flow Cytometry Core Facility, La Jolla Institute for Immunology

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole pour traiter la moelle osseuse fraîche (BM) isolée de la souris ou de l'homme pour la cytométrie de masse de haute dimension (Cytométrie par Time-Of-Flight, CyTOF) analyse des cellules de neutrophile-lignée.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cet article, nous présentons un protocole qui est optimisé pour préserver des cellules de neutrophile-ligne dans BM frais pour l'analyse entière de CyTOF de BM. Nous avons utilisé un panneau CyTOF de 39 anticorps myéloïde-biaisé pour évaluer le système hématopoïétique avec un foyer sur les cellules de neutrophile-ligne en utilisant ce protocole. Le résultat de CyTOF a été analysé avec un algorithme de réduction dimensionnelle à ressources ouvertes, viSNE, et les données ont été présentées pour démontrer les résultats de ce protocole. Nous avons découvert de nouvelles populations de cellules de neutrophile basées sur ce protocole. Ce protocole de préparation bM entière fraîche peut être employé pour 1), analyse de CyTOF pour découvrir des populations non identifiées de cellules de BM entière, 2), étudiant des défauts entiers de BM pour des patients présentant des désordres de sang tels que la leucémie, 3), aidant l'optimisation de protocoles de cytométrie de débit fluorescence activés qui utilisent BM entier frais.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au cours des dernières décennies, les méthodes de cytométrie ont été un outil puissant pour étudier le système hématopoïétique dans le BM. Ces méthodes comprennent la cytométrie d'écoulement activée par la fluorescence et la nouvelle méthode de CyTOF utilisant des anticorps étiquetés métal lourd. Ils ont mené à la découverte de nombreux types de cellules dans un spécimen biologique hétérogène en identérant leurs profils uniques d'expression de marqueurde de surface. L'augmentation des chevauchements de spectre associés à un plus grand nombre de canaux entraîne une inexactitude accrue des données dans les applications de cytométrie de débit activée par la fluorescence.....

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Protocol

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Toutes les expériences ont suivi les directives approuvées du Comité d'allergie et d'immunologie des animaux de l'Institut La Jolla pour l'allergie et l'immunologie, et l'approbation de l'utilisation des rongeurs a été obtenue de l'Institut La Jolla pour l'allergie et l'immunologie selon les critères décrits dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health.

1. Récolte de la moelle osseuse de souris (BM)

Achetez des souris C57BL/6J auprès d'un fournisseur commercial. Nourrir le régime standard de chow de rongeur et la maison dans des cages de microisolateur dans une installation exempte d'a....

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Results

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La figure 1 est présentée comme un exemple résultant d'expériences CyTOF. Sur cette parcelle tSNE les cellules à travers plusieurs tissus de souris ont été regroupés en sous-ensembles basés sur la similitude de leurs profils d'expression de marqueur de surface mesurés par un panneau CyTOF de 33 paramètres. Les cellules avec des propriétés plus semblables ont été automatiquement regroupées comme les neutrophiles, les macrophages, ou les DC s'appuyant sur l'expression des 33 marqueurs sur chaq.......

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Discussion

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Au cours des dernières décennies, la cytométrie à base de fluorescence a été utilisée comme méthode principale pour étudier les lignées cellulaires et l'hétérogénéité¹^,²^,³. Bien que la cytométrie de flux ait fourni des données multidimensionnelles, cette méthode est limitée par des choix de paramètres et de chevauchement spectral. Pour surmonter la faiblesse de la cytométrie d'écoulement, nous avons profité de CyTOF, qui utilise.......

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Disclosures

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgements

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Nous tenons à remercier le noyau de cytométrie de flux de LJI pour l'aide avec la procédure de cytométrie de masse. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R01HL134236, P01HL136275, et R01CA202987 (tous à C.C.H) et ADA7-12-MN-31 (04) (à C.C.H. et Y.P.Z).

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
CyTOF Antibodies (souris)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y	Fluidigm	Cat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb	Fluidigm	Cat# 3176002B
Anti-souris CD105 (Clone MJ7/18)-Purified	Biolegend	Cat# 120402 ; RRID :AB_961070
Anti-souris CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purifié	Biolegend	Cat# 135502 ; RRID :AB_1937293
Anti-Souris CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er	Fluidigm	Cat# 3166004B
Anti-souris CD11a (Clone M17/4)-Purifié	Biolegend	Cat# 101101 ; RRID :AB_312774
Anti-Souris CD11B (Clone M1/70)-148Nd	Fluidigm	Cat# 3148003B
Anti-Souris CD11C (Clone N418)-142Nd	Fluidigm	Cat# 3142003B
Anti-souris CD127 (IL-7R&alpha ;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 133919 ; RRID :AB_2565433
Anti-souris CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er	Fluidigm	Cat# 3167004B
Anti-souris CD16.2 (Fc&gamma ; RIV) (Clone 9E9)-Purifié	Biolegend	Cat# 149502 ; RRID :AB_2565302
Anti-souris CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purifié	BD Biosciences	Cat# 557787 ; RRID :AB_647340
Anti-souris CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purifié	Biolegend	Cat# 142402 ; RRID :AB_10916523
Anti-souris CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purifié	Biolegend	Cat# 149302 ; RRID :AB_2565277
Anti-souris CD183 (clone CXCR3-173)-Purifié	Biolegend	Cat# 126502 ; RRID :AB_1027635
Anti-souris CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 137625 ; RRID :AB_2563744
Anti-souris CD34 (clone MEC14.7)-Purifié	Biolegend	Cat# 119302 ; RRID :AB_345280
Anti-souris CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 133919 ; RRID :AB_2565433
Anti-souris CD43 (Clone S11)-146Nd	Fluidigm	Cat# 3146009B
Anti-souris CD48 (Clone HM48.1)-156Gd	Fluidigm	Cat# 3156012B
Anti-souris CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready	ThermoFisher	Cat# 14-1351-82 ; RRID :AB_467481
Anti-souris CD71 (clone RI7217)-Purifié	Biolegend	Cat# 113802 ; RRID :AB_313563
Anti-souris CD90 (Clone G7)-Purifié	Biolegend	Cat# 105202 ; RRID :AB_313169
Anti-Souris F4/80 (Clone BM8)-159Tb	Fluidigm	Cat# 3159009B
Anti-souris Fc&epsilon ; RI&alpha ; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 134321 ; RRID :AB_2563768
Anti-souris GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purifié	BD Biosciences	Cat# 554404 ; RRID :AB_395370
Anti-souris I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb	Fluidigm	Cat# 3174003B
Anti-Souris Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purifié	BD Biosciences	Cat# 556003 ; RRID :AB_396287
Anti-souris Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm	Fluidigm	Cat# 3169015B
Anti-souris Ly6B (Clone 7/4)-Abcam Purifié		Cat# ab53457 ; RRID :AB_881409
Anti-souris Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 127637 ; RRID :AB_2563784
Anti-souris NK1.1 (Clone PK136)-165Ho	Fluidigm	Cat# 3165018B
Anti-souris Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purifié	BD Biosciences	Cat# 552125 ; RRID :AB_394340
Anti-souris TCR&beta ; (Clone H57-597)-143Nd	Fluidigm	(Clone H57-597)-143Nd
Anti-souris TER-119/Cellules érythroïdes (Clone TER-119)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 116241 ; RRID :AB_2563789
Chemicals, peptides and recombinant Proteins
Antibody Stabilizer	CANDOR Bioscience	Cat# 130050
Bovin Serum Albumin	Sigma-Aldrich	Cat# A4503
Cisplatine-194Pt	Fluidigm	Cat# 201194
eBioscience 1x Tampon	de lyse RBCThermoFisher	Cat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	Cat# 00-4333-57
EQ Perles d’étalonnage à quatre éléments	Fluidigm	Cat# 201078
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	ThermoFisher	Cat# AM9260G
Sérum bovin fœtal	Omega Scientific	Cat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Solution Saline	GE Lifesciences	Cat#SH30256.01
Intercalator-Ir	Fluidigm	Cat# 201192B
MAXPAR Kits de marquage d’anticorps	Fluidigm	http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	Cat# 158127
Azoture de	sodiumSigma-Aldrich	Cat# S2002
Triton ; X-100	Sigma-Aldrich	Cat# X100
Trypsine EDTA 1x	Corning	Cat# 25-053-Cl
Modèle expérimental : Organisme/Souches
souris : C57BL/6J	The Jackson Laboratory	Code n° : 000664
Software Alogrithm
Normalisateur basé sur les billes	Finck et al., 2013	https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
	Cytobank Cytobank	https://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0	Chen et al., 2016	https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNE	van der Maaten et Hinton, 2008	https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26....

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