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Article de méthode

In vitro transcrit le test de reporter de luciférase basé sur l’ARN pour étudier la régulation de la traduction dans les cellules infectées par le poxvirus

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DOI :

10.3791/59626

⸱

1 mai 2019

 ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour étudier la régulation de la traduction des mRNA dans les cellules infectées par le poxvirus à l’aide du test de reporter de luciférase basé sur l’ARN transcrit in vitro. Le dosage peut être utilisé pour étudier la régulation de la traduction par les éléments CISd’un mRNA, y compris la région 5 '-non traduite (UTR) et 3 '-UTR. Différents modes d’initiation de traduction peuvent également être examinés à l’aide de cette méthode.

Résumé

Chaque mRNA poxvirus transcrit après la réplication de l’ADN viral a un leader évolutif, non-basé sur le modèle 5 '-poly (A) dans le 5 '-UTR. Pour disséquer le rôle du 5 '-poly (A) chef de file dans la traduction d’ARNm pendant l’infection de poxvirus nous avons développé un essai in vitro transcrit de journaliste de luciférase basé sur l’ARN. Ce test de reporter comprend quatre étapes principales: (1) PCR pour amplifier le gabarit d’ADN pour la transcription in vitro; (2) transcription in vitro pour générer de l’ARNm à l’aide de l’ARN polymérase T7; (3) transfection pour introduire dans les cellules une ARNm transcrite in vitro; (4) détection de l’activité de la luciférase comme indicateur de la traduction. Le test de reporter de luciférase basé sur l’ARN décrit ici contourne les problèmes de réplication plasmidique dans les cellules infectées par le poxvirus et la transcription cryptique du plasmide. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer la régulation de la traduction par des éléments CISdans un mRNA comprenant 5 '-UTR et 3 '-UTR dans des systèmes autres que les cellules infectées par le poxvirus. De plus, il est possible d’étudier différents modes d’initiation de la traduction, tels que le Cap-dépendant, le Cap-indépendant, la réinitiation et l’initiation interne à l’aide de cette méthode.

Introduction

Selon le dogme central, l’information génétique circule de l’ADN à l’ARN, puis finalement vers la protéine1,2. Ce flux d’information génétique est très réglementé à de nombreux niveaux, y compris la traduction de mRNA3,4. La mise au point de tests rapporteurs pour mesurer la régulation de l’expression génique facilitera la compréhension des mécanismes de réglementation impliqués dans ce processus. Nous décrivons ici un protocole pour étudier la traduction de l’ARNm à l’aide d’un test de transcription in vitro de la luciférase basée sur l’ARN dans les cellules infectées par le poxvirus.

Les poxvirus comprennent de nombreux agents pathogènes humains et animaux très dangereux5. Comme tous les autres virus, les poxvirus dépendent exclusivement des cellules hôtes pour la synthèse protéique6,7,8. Pour synthétiser efficacement les protéines virales, les virus ont évolué de nombreuses stratégies pour détourner les machines cellulaires translationnelles pour les rediriger vers la traduction des mRNAs viraux7,8. Un mécanisme couramment utilisé par les virus est d’utiliser des éléments d’action CISdans leurs transcriptions. Parmi les exemples notables, citons le site interne d’entrée de ribosome (IRES) et l’activateur de traduction indépendant du Cap (cite)9,10,11. Ces éléments CISrendent les transcriptions virales un avantage translationnel en attirant des machines translationnelles par divers mécanismes12,13,14. Plus de 100 mRNA de poxvirus ont un élément d’action CISévolutivement conservé dans la région 5 '-non traduite (5 '-UTR): un dirigeant de 5 '-poly (a) aux cinq extrémités de ces mRNAs15,16. Les longueurs de ces 5 '-poly (A) leaders sont hétérogènes et sont générées par le glissement de l’ARN polymérase encodée par le poxvirus pendant la transcription17,18. Nous, et d’autres, avons récemment découvert que le 5 '-poly (A) leader confère un avantage de traduction à un mRNA dans les cellules infectées par le virus de la vaccine (vacv), le membre prototypique des poxvirus19,20.

Le test de transcription de luciférase à base d’ARN transcrit in vitro a été initialement développé pour comprendre le rôle du 5 '-poly (A) leader dans la traduction d’ARNm au cours de l’infection par le poxvirus19,21. Bien que les tests de journaliste de luciférase basés sur l’ADN de plasmide aient été largement utilisés, il y a plusieurs inconvénients qui compliqueront l’interprétation des résultats dans les cellules infectées par le poxvirus. Premièrement, les plasmides sont capables de se reproduire dans les cellules infectées par le VACV22. Deuxièmement, la transcription cryptique se produit souvent à partir de l’ADN plasmide18,23,24. Troisièmement, la transcription pilotée par le promoteur VACV génère des poly (A)-leader de longueurs hétérogènes rendant ainsi difficile le contrôle de la longueur de leader poly (A) dans certaines expériences18. Un essai in vitro de transcription de luciférase basé sur l’ARN contourne ces questions et l’interprétation des données est simple.

Il y a quatre étapes clés dans cette méthode: (1) la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour générer le modèle d’ADN pour la transcription in vitro; (2) transcription in vitro pour générer de l’ARNm; (3) transfection pour délivrer l’ARNm dans les cellules; et (4) la détection de l’activité de la luciférase comme indicateur de la traduction (figure 1). L’amplicon PCR qui en résulte contient les éléments suivants dans la direction 5 'à 3 ': T7-promoteur, leader poly (A) ou séquence 5 '-UTR souhaitée, cadre de lecture ouvert luciférase Firefly (ORF) suivi d’une queue poly (A). L’amplicon PCR est utilisé comme modèle pour synthétiser l’ARNm par transcription in vitro à l’aide de la T7 polymérase. Pendant la transcription in vitro, m7G Cap ou autre analogue de Cap est incorporé dans l’ARNm nouvellement synthétisé. Les transcriptions plafonnées sont transfectées en cellules infectées ou non infectées par le VACV. Le lysat cellulaire est recueilli au moment désiré après la transfection pour mesurer les activités de luciférase qui indiquent la production de protéines à partir de l’ARNm transfecté. Ce test reporter peut être utilisé pour étudier la régulation de la traduction par élément CISprésent dans 5 '-UTR, 3 '-UTR ou d’autres régions d’un ARNm. En outre, l’analyse in vitro transcrite à base d’ARN peut être utilisée pour étudier différents mécanismes d’initiation de la traduction, y compris l’initiation au Cap, l’initiation indépendante du capuchon, la réinitiation et l’initiation interne comme IRES.

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Protocole

1. préparation du modèle d’ADN par PCR pour la transcription in vitro

  1. Pour préparer le modèle d’ADN par PCR, amorces de conception. Lors de la conception des amorces considèrent des caractéristiques cruciales comme la longueur de l’amorce, la température de recuit (Tm), le contenu GC, 3 'fin avec G ou C etc.
    Remarque: Discutés en détail dans ces ouvrages25,26,27.
  2. Les amorces de conception pour produire l’amplicon de PCR contenant les éléments suivants dans la direction de 5 'à 3 ': T7-promoteur, chef de poly (a), luciférase d’Firefly ORF et une queue de poly (a) référée ci-après comme T7_12A-Fluc. Amorces de conception (avant et arrière) pour englober tous les éléments supplémentaires qui ne sont pas présents dans l’ADN du gabarit (figure 2a).
    Remarque: La séquence de tous les éléments se trouve dans le tableau 1.
  3. Inclure plusieurs nucléotides supplémentaires dans l’amorce avant (5 '-3 ')28, suivi par le promoteur T7, le dirigeant poly (A) ou la séquence 5 '-UTR souhaitée et environ 20 nucléotides, ajuster sur la base de Tm, correspondant à l’extrémité 5 'du gène reporter Orf. Assurez-vous que la région correspondante dans l’amorce est identique au brin de sens (+ brin) du gène.
    Remarque: Pour les longs 5 '-UTR, synthétiser deux fragments d’ADN: un avec le promoteur T7 suivi d’un long 5 '-UTR et d’une seconde avec l’ORF du gène reporter. Joignez ces deux fragments en utilisant l’extension de chevauchement PCR29.
  4. Concevoir l’apprêt inversé (5 '-3 ') pour inclure la queue poly (A) et environ 20 nucléotides, ajuster sur la base de Tm, correspondant à l’extrémité 3 'de l’ORF du gène reporter. Assurez-vous que la région correspondante dans l’amorce est identique au brin anti-sens (-brin) du gène et qu’un codon d’arrêt in-frame est présent avant la queue poly (A).
    Remarque: La longueur désirée de A dans un chef poly (A) ou une queue poly (A) peut être personnalisée dans les amorces. Par exemple, pour ajouter 50 A dans la queue poly (A), l’amorce inversée devrait comporter 50 T. De même, pour ajouter 20 A dans le leader poly (A), l’amorce avant devrait comporter 20 A.
  5. Pour le contrôle interne, concevoir un autre ensemble d’amorces contenant les éléments suivants dans la direction 5 'à 3 ': T7 promoter, une séquence de codage aléatoire de 5 '-UTR contenant la séquence de Kozak, la Renilla luciférase ORF et la queue poly (a) référée ci-après comme T7_ Kozak-Rluc.
  6. Dans un tube PCR, ajouter les réactifs dans l’ordre suivant: eau libre de DNase, 2x ADN polymérase haute fidélité, amorces, et ADN de modèle de luciférase confirmée par séquence (tableau 2).
    Remarque: Les quantités de composants individuels dans le mélange doivent être ajustées en fonction du volume de réaction.
  7. Utilisez un cycle de PCR standard en 3 étapes (dénaturation, recuit, extension) pour générer un modèle d’ADN comme illustré dans le tableau 3.
    Remarque: La température de recuit X ° c dépend du jeu d’amorces utilisé et le temps d’extension T min dépend de la taille de l’amplicon PCR et de l’ADN polymérase utilisée.
  8. Détectez le produit PCR en exécutant 5-10% de la réaction PCR dans l’électrophorèse sur gel de tris-acétate-EDTA (TAE) de 1% d’d’agarose (contenant 0,1 μg/ml de bromure d’éthidium) ainsi que la norme de poids moléculaire disponible dans le commerce. Visualisez le gel sous un illuminateur UV pour déterminer la taille du produit PCR.
  9. Après avoir déterminé la taille correcte du produit PCR, ~ 1,7 KB pour T7_12A-Fluc et ~ 1,0 KB pour T7_Kozak-Rluc, le purifier en utilisant un kit de purification de PCR disponible dans le commerce. Éluer l’ADN à l’aide de 100 μL d’eau libre de nucléase (figure 2b).
  10. Une fois purifiés, vérifier la concentration de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre et déterminer le rapport A260/A280 (~ 1,8-2,0 est acceptable).
  11. Conserver l’ADN purifié à-20 ° c ou l’utiliser immédiatement pour la transcription in vitro.

2. générer l’ARNm par transcription in vitro

  1. Synthétiser l’ARN du produit PCR in vitro, en utilisant un kit de transcription in vitro (figure 3A).
    Remarque:     les modèles d’ADN T7_12A-Fluc et T7_Kozak-rluc sont utilisés pour synthétiser les mRNA 12a-Fluc et Kozak-rluc, respectivement.
    1. Pour ce faire, prendre un tube de microcentrifugation et ajouter les réactifs dans l’ordre suivant: DNase-RNase eau libre, NTP buffer Mix, Cap ANALOG, modèle PCR Product, T7-RNA polymérase Mix (tableau 4).
      Remarque: D’autres systèmes de capsulage peuvent également être utilisés pour plafonner l’ARN séquentiellement après une transcription in vitro suivant les instructions du fabricant.
    2. Mélanger soigneusement et incuber à 37 ° c pendant 2 h.
    3. Procéder à la purification de l’ARN synthétisé à l’aide d’un kit de purification d’ARN.
  2. Exécutez l’ARN purifié dans 1,5% de gel d’d’agarose tris-borate-EDTA (TBE) (contenant 0,5 μg/mL de bromure d’éthidium) pour vérifier l’ARN. Visualisez le gel sous un illuminateur UV (figure 3b).
  3. Vérifier la concentration de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre et déterminer le rapport A260/A280 (~ 1,8-2,0 est acceptable).
  4. Aliquot l’ARN purifié et stocker à-80 ° c.

3. transfect mRNA aux cellules

  1. Cellules HeLa de graine dans une plaque de 24 puits (à environ ~ 80-90% anastomosé le lendemain) et incuber pendant la nuit dans un incubateur à 37 ° c avec 5% co2.
  2. Infecter les cellules HeLa avec le virus de la vaccine (vacv) à une multiplicité d’infection (moi) de 5 ou garder les cellules HeLa non infectées pour comparaison.
    Remarque: MOI est le nombre de particules virales infectieuses par cellule.
  3. MOI de X = {[(nombre de cellules * X)/titer de virus] * 1000} μl de virus par milieu de 1 mL.
  4. Après l’infection post-h souhaitée (HPI) (dans cette expérience à 10-12 HPI), transfecter de l’ARNm (500 ng de l’ARNm total par puits de plaques de 24 puits) en utilisant un réactif de transfection lipidique cationique comme illustré à la figure 3C.
    1. Pour un puits d’une plaque de 24 puits, mélanger 480 ng de l’ARNm de la séquence 12a portant la luciférase (12a-Fluc) et 20 ng de la séquence de Kozak portant Renilla luciférase (Kozak-rluc) mRNA dans un tube de microcentrifugation. Dans un autre tube de microcentrifugation, ajouter 1,1 μL de réactif de transfection lipidique cationique.
    2. Ajouter 55 μL de milieu sérique réduit dans les deux tubes. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min.
    3. Après 5 min d’incubation, ajouter 55 μL de réactif de transfection lipidique cationique contenant un milieu sérique réduit dans le tube contenant de l’ARNm.
    4. Mélanger doucement mais soigneusement, et incuber à température ambiante pendant 15 min.
    5. Pendant l’incubation, retirer le milieu de culture cellulaire et ajouter 400 μL de milieu sérique réduit par puits de plaques de 24 puits.
    6. Après incubation, ajouter 100 μL du mélange à l’abandon et uniformément à un puits de plaques de 24 puits.

4. Mesurez les activités de luciférase

  1. Cinq heures après la co-transfection de l’ARNm 12A-Fluc et Kozak-Rluc, mesurer l’activité de la luciférase à l’aide d’un système de dosage de la luciférase capable d’effectuer deux essais de reporter (p. ex., trousse de dosage du double luciférase reporter).
  2. Retirer le milieu sérique réduit et lyser les cellules en ajoutant 150 μL de tampon de lyse, un composant du kit de dosage de la luciférase.
  3. Après 10 min d’incubation à la température ambiante, prélever le lysat en déchirant les cellules et en les transvaser dans un tube à microcentrifugation.
  4. Centrifuger le lysat à 12 000 x g pendant 10 min à 4 ° c pour les débris de cellules de pellets.
  5. Ajouter 30 μL de surnageant dans une plaque d’essai à paroi opaque 96 bien blanche avec un fond solide.
  6. Mesurez la double luminescence à l’aide du kit de dosage de la luciférase et d’un luminomètre multimode pour lecteur de plaques.
  7. Effectuer la mesure en utilisant la fonction cinétique (sur une base par puits) en utilisant les paramètres décrits dans le tableau 5.
    Remarque: La lecture peut également être prise à l’aide d’un luminomètre manuel. Ajouter un volume égal de lysat et de substrat pour Fluc dans une cuvette. Attendre 2 s et mesurer pendant 10 s à l’aide du luminomètre. Après la mesure Fluc, sortez rapidement la cuvette du luminomètre et ajoutez un volume égal du substrat pour Rluc manuellement. Encore une fois, attendre 2 s et mesurer pendant 10 s à l’aide du luminomètre.
  8. Exportez les données de lecture de luminescence dans un format de fichier souhaitable.
  9. Déterminer le taux de traduction relatif de l’ARNm 12A-Fluc dans les cellules HeLa infectées non infectées et VACV en divisant la valeur de Fluc par le contrôle interne Rluc valeur.
    Remarque: La figure 1 supplémentaire montre l’analyse étape par étape des données brutes pour obtenir une activité Fluc relative.

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Résultats

Les quatre étapes de l’analyse in vitro de la luciférase à base d’ARN transcrit: PCR pour générer un modèle d’ADN pour la transcription in vitro, la transcription in vitro pour générer l’ARNm, la transfection de l’ARNm et la mesure de la luciférase, peuvent être observées dans le diagramme schématique ( Figure 1). La conception des amorces pour les deux modèles d’ADN (Fluc et Rluc) et le schéma général de l’extension de surplomb PCR est illustrée dans le sché...

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Discussion

Toutes les étapes à quatre cœurs sont cruciales pour le succès de l’essai in vitro transcrit de la luciférase à base d’ARN. Une attention particulière doit être accordée à la conception des amorces, en particulier pour la séquence de promoteur T7. T7 RNA polymérase commence la transcription à partir du premier G souligné (gGG-5 '-UTR-Aug-) dans le promoteur T7 ajouté avant la séquence 5 '-UTR. Bien que le site de début de transcription (TSS) commence à partir du premier G à l’extrémité 5 ', la diminution du nombre...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs aimeraient ne déclarer aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Le projet a été financé par les instituts nationaux de la santé (AI128406 www.nih.gov) à ZY et en partie par le centre de recherche sur le cancer Johnson (http://cancer.k-state.edu) sous la forme de la bourse d’été étudiants diplômés à la police.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2X-Q5 Master mixNew England BiolabsM0492ADN polymérase haute fidélité utilisée en PCR
3´ ;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G Structure du capuchon d’ARN analogiqueNew England BiolabsS1411LCapuchon anti-retour analogique ou ARCA
Corning 96 Well Half-Area blanc à fond plat microplaque en polystyrèneCorning3693Opaque à paroi opaque 96 well white plate plate avec fond solide
Système de dosage Dual-Luciferase ReporterPromegaE1960Kit de dosage Dual-Luciferase (DLAK)
E.Z.N.A. Cycle Pure KitOMEGA BIO-TEKD6492Kit de purification PCR
GloMax Navigator Luminomètre sur microplaquesPromegaGM2010Luminomètre à lecteur de plaques multimode
HiScribe T7 Kit de synthèse d’ARN rapide à haut rendementNew England BiolabsE2050SIn Kit de transcription vitro
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Réactif de transfection lipidique cationique
NanoDrop2000Thermo Fisher ScientificND-2000Utilisé pour mesurer la concentration d’ADN et d’ARN
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070Milieu sérique réduit
Purelink RNA Mini KitThermo Fisher Scientific12183018AKit de purification de l’ARN
Système de coiffagede la vaccine New England BiolabsM2080Système de coiffage

Références

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