Ce protocole utilise une réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) basée sur la sonde, un prédisme de sulforhodamine B (SRB), 3' régions non traduites (3' UTR) et un résultat de luciferase pour vérifier les gènes cibles d'un miRNA d'intérêt et pour comprendre les fonctions des miRNAs.
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Article de méthode
Un protocole in vitro pour évaluer les niveaux de microARN, les fonctions et les gènes cibles associés dans les cellules tumorales
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les microARN (miARN) sont de petits ARN régulateurs qui sont reconnus pour moduler de nombreuses voies de signalisation intracellulaire dans plusieurs maladies, y compris les cancers. Ces petits ARN régulateurs interagissent principalement avec les 3' régions non traduites (3' UTR) de leurs ARN messagers cibles (ARNM) aboutissant finalement à l'inhibition des processus de décodage des ARNm et à l'augmentation des dégradations de l'ARNm cible. Basé sur les niveaux d'expression et les fonctions intracellulaires, les miRNAs peuvent servir de facteurs régulateurs des ARNm oncogènes et suppresseurs de tumeurs. L'identification des gènes cibles de bonne foi d'un miRNA parmi des centaines, voire des milliers de cibles prédites par le calcul est une étape cruciale pour discerner les rôles et les mécanismes moléculaires de base d'un miRNA d'intérêt. Divers programmes de prédiction cible miRNA sont disponibles pour rechercher les interactions possibles miRNA-mRNA. Cependant, la question la plus difficile est de savoir comment valider les gènes cibles directs d'un miRNA d'intérêt. Ce protocole décrit une stratégie reproductible des méthodes clés sur la façon d'identifier les cibles miRNA liées à la fonction d'un miRNA. Ce protocole présente un guide pratique sur les procédures étape par étape pour découvrir les niveaux de miRNA, les fonctions et les ARNc cibles connexes à l'aide de la réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) à base de sonde, d'un test de sulforhodamine B (SRB) à la suite d'une transfétion miRNA imitant la transfection , génération de courbe dose-réponse, et test de luciferase avec le clonage de 3' UTR d'un gène, qui est nécessaire pour une bonne compréhension des rôles des miRNAs individuels.
Introduction
Les microARN (miARN) sont les petites ARN réglementaires qui modulent principalement le processus de traduction et de dégradation des ARN messagers (ARM) en réagissant aux 3' régions non traduites (3' UTR) dans les gènes cibles de bonne foi1. L'expression des miARN peut être réglée par des mécanismes transcriptionnels et post-transcriptionnels. Le déséquilibre de ces mécanismes de réglementation apporte des niveaux d'expression miRNAs incontrôlés et distinctifs dans de nombreuses maladies, y compris les cancers2. Un seul miRNA peut avoir de multiples interactions avec divers ARNm. En conséquence, un ARNm individuel peut ....
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Protocole
1. Analyse d'expression de MicroRNA mature (miRNA)
-
Synthèse d'ADN complémentaire de miRNA mûr (cDNA)
- Ajouter 254 ng d'ARN total et 4,5 l de mélanges de désoxyribonuclease I (DNase I), puis ajouter de l'eau ultrapure dans des tubes à bande PCR pour faire jusqu'à 18 l (Figure 2A). Préparer la réaction pour chaque échantillon total d'ARN purifié à partir de plusieurs lignées cellulaires en utilisant une quantité suffisante de mélanges DNase I basé sur le nombre total de réactions.
REMARQUE: Les mélanges DNase I sont composés de DNase I (1,8 l), d'inhibiteur de la ribonuclène (0,3 l) e....
- Ajouter 254 ng d'ARN total et 4,5 l de mélanges de désoxyribonuclease I (DNase I), puis ajouter de l'eau ultrapure dans des tubes à bande PCR pour faire jusqu'à 18 l (Figure 2A). Préparer la réaction pour chaque échantillon total d'ARN purifié à partir de plusieurs lignées cellulaires en utilisant une quantité suffisante de mélanges DNase I basé sur le nombre total de réactions.
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Résultats
La confirmation réussie et précise des niveaux de miRNA est importante pour l'interprétation des données par lesquelles la classification des miARN est possible basée sur les rôles prévus des miRNAs dans le développement et la progression d'une maladie. Les niveaux de miRNA-107 et de miRNA-301 ont été mesurés dans trois lignes de cellules de pancréas utilisant le PCR quantitatif basé sur sonde. La synthèse des ADNC d'un miRNA spécifique et d'un gène de référence dans la même réaction peut augmenter la reproductibilité de.......
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Discussion
Les stratégies pour la détermination des cibles de miRNA de bonne foi avec les fonctions d'un miRNA d'intérêt sont indispensables pour la compréhension des rôles multiples des miRNAs. L'identification des gènes cibles miRNA peut être une ligne directrice pour interpréter les événements de signalisation cellulaire modulées par des miARN dans une cellule. Un dévoilement des gènes cibles fonctionnellement importants des miARN peut fournir les connaissances fondamentales pour développer une thérapie miRNA-basée dans le cance.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Cette étude a été soutenue par le Programme de recherche en sciences fondamentales par l'intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le ministère de l'Éducation (2017R1D1A3B03035662); et le Fonds de recherche universitaire Hallym, 2017 (HRF-201703-003).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube conique de 15 mL | SPL Life Sciences | 50015 | |
| Plaque à 24 puits | Thermo Scientific | 142475 | |
| Tube conique de 50 mL | SPL Life Sciences | 50050 | |
| Plaque à 6 puits | Falcon | 353046 | |
| 6x Colorant de chargement d’ADN | Real Biotech Corporation | RD006 | Bande de 1 mL |
| 8 capuchons | Appliqué Biosystems | N8010535 | Pour la synthèse de l’ADNc |
| Bande de 8 tubes | Applied Biosystems | N8010580 | Pour la synthèse de l’ADNc |
| Plaque à 96 puits | Falcon | 353072 | |
| Acide acétique | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Phosphatase alcaline | New England Biolabs | M0290S | 10 000 U/mL |
| Ampicilline | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 Bandelettes de tubes | Agilent Technologies | 401493 | Pour PCR en temps réel |
| Système de PCR en temps réel AriaMx | Agilent Technologies | G8830A | qPCR Amplification, détection et analyse de données |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10 000 unités/ml |
| Cellules CAPAN-1 | ATCC | HTB-79 | |
| Hotte de culture cellulaire | Labtech | Modèle : LCB-1203B-A2 | |
| Chambres de comptage avec barre oblique en V | Paul Marienfeld | 650010 | Compteur de cellules |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Concentration 10X |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| Kit d’extraction de gel d’ADN | Bionics | DN30200 | 200 échelle |
| d’ADN | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb échelle |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 unités |
| Système de dosage à rapporteur de luciférase double Promega | E1910 | 100 dosages | |
| Sérum de veau fœtal | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT cellules compétentes | Real Biotech Corporation (RBC) | RH617 | Cellules |
| compétentes Cellules HNE | ATCC | CRL-4023 | |
| LB Bouillon de gélose | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0,75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0,75 mL |
| Luminomètre | Promega | Modèle : E5311 | |
| Tube de microcentrifugation | Eppendorf | 22431021 | |
| Lecteur de microplaques | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (système d’électrophorèse) | TaKaRa | Modèle : AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20 000 unités/mL |
| Programme d’exploration Oligo | GeneLink | Pour la conception d’amorces | |
| Capuchons de bandelettes de tube optique (8x Strip) | Agilent Technologies | 401425 | Pour la PCR en temps réel |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cellules | ATCC | CRL-1469 | |
| Pénicilline/streptomycine | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Tampon phosphate salin | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmidide DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymérase | TaKaRa | R050A | 250 unités |
| Shaker | TECAN | Plate-forme de secouage | |
| Incubateur de secousses | Labtech | Modèle : LSI-3016A | |
| Logiciel Sigmaplot 14 | Systat Software Inc | Pour la génération de courbes dose-réponse | |
| Poudre de sulforhodamine B | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Colorant fluorescent de liaison pour dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 réactions, pas de |
| test de microARN AmpErase UNG TaqMan (has-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID : 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| Test de microARN TaqMan (has-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID : 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1 000 réactions |
| Thermo CO2 incubateur (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 ° ; C et 5 % CO2 incubation | |
| Acide trichloracétique | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Base Trizma | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Eau ultrapure | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Thermocycleur Veriti 96 puits | Applied Biosystems | Pour l’amplification de l’ADN (ou de l’ADNc) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20 000 unités/ml |
Références
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Mole....
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Réimpressions et autorisations
