Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based

L'évaluation de la condition physique et de la virulence des organismes pathogènes est un aspect fondamental de la recherche en microbiologie. Il permet de faire des comparaisons entre les souches ou entre les organismes mutés, ce qui permet aux chercheurs de déterminer l'importance de certains gènes dans des conditions spécifiques. Traditionnellement, l'évaluation de la virulence utilise un modèle animal d'infection à l'aide de différentes souches bactériennes et en observant les résultats de l'animal infecté (p. ex. Dose infectieuse₅₀, Dose létale₅₀, temps de mort, sévérité des symptômes, absence de symptômes, etc.). Cette procédure fournit des descriptions précieuses de la virulence, mais elle exige des souches de causer des différences considérables dans les résultats afin de détecter les variations de type sauvage. En outre, les résultats sont semi-quantitatifs parce que si la progression de la maladie et la gravité des symptômes peuvent être subjectivement quantifiées au fil du temps, l'interprétation de la virulence par rapport au type sauvage est plus qualitative (c.-à-d. plus, moins, ou tout aussi virulente). Une alternative commune aux essais d'infectiosité animale est de générer des indices concurrentiels (CI), des valeurs qui comparent directement la forme physique ou la virulence d'une souche à une contrepartie de type sauvage dans une infection mixte¹. Cette technique présente de nombreux avantages par rapport à un modèle animal traditionnel d'infection en standardisant la virulence d'une souche de type sauvage et en déterminant une valeur quantifiable pour refléter le degré d'atténuation. Cette technique peut également être adaptée pour analyser les interactions génétiques chez les bactéries en déterminant un indice concurrentiel annulé (COI)². Le calcul d'un ICO pour un groupe d'organismes mutés permet aux chercheurs de déterminer si deux gènes contribuent indépendamment à la pathogénie ou s'ils sont impliqués dans la même voie de virulence et dépendent les uns des autres. En outre, le calcul d'un CI nécessite l'énumération des bactéries qui peuvent fournir des informations précieuses sur la pathogénie des organismes. Les IC et les IC permettent également aux chercheurs d'asses souches avirulentes qui ne causent pas de maladie clinique, mais qui ont encore des différences de condition physique. Cette technique est limitée par l'utilisation de marqueurs traditionnels de résistance aux antibiotiques pour identifier les souches, limitant ainsi le nombre de souches d'entrée à seulement une ou deux à la fois. En raison de cette limitation, un grand nombre de groupes expérimentaux et de répliques sont nécessaires, ce qui, en plus d'augmenter les coûts de main-d'œuvre et de matériaux, augmente également les possibilités de variabilité dans les conditions expérimentales et les résultats inexacts. (Pour un examen approfondi des avantages et des applications de l'utilisation d'infections mixtes pour étudier la virulence, la condition physique et les interactions génétiques, voir C.R. Beuzon et D.W. Holden ¹)

Des tentatives ont été faites pour surmonter cette limitation, comme l'utilisation de cellules fluorescentes quantifiées par cytométrie de flux^3,4,5. Cette technique quantifie les cellules à l'aide d'anticorps étiquetés 1) à des marqueurs phénotypiques ou 2) de protéines fluorescentes produites endogènement. L'utilisation d'anticorps étiquetés a une limite de détection de 1000 cellules/mL, et nécessite donc un grand nombre de cellules pour analyser³. Les cellules exprimant des protéines fluorescentes ont une physiologie altérée et sont sensibles aux changements de forme physique résultant de l'expression riche en protéines⁶. Les deux méthodes sont limitées par le nombre de marqueurs fluorescents détectables à l'aide de la cytométrie du débit. Un progrès dans la quantification moléculaire a été réalisé par le développement d'une technique de microarray qui a détecté l'atténuation dans 120 souches d'une infection mélangée initiale de plus de 1.000 souches dans un modèle de murine⁷. Cette technique a utilisé une analyse de microarray de l'ARN des souches mutées, qui mènent à la variabilité considérable dans le résultat.  Néanmoins, il a établi que de grands bassins d'infections mixtes peuvent être un outil utile et qu'en utilisant des techniques de détection sensibles, des différences dans la virulence bactérienne peuvent être identifiées. Avec le développement du séquençage de la prochaine génération, Tn-seq a élargi l'utilité des mutations transposon, permettant une méthode puissante pour quantifier les bactéries qui ont été mutées au hasard^{8,9,10, 11}. Un protocole alternatif a été récemment développé qui élimine le besoin de transposons et utilise plutôt des codes-barres d'ADN pour identifier et suivre plus facilement les changements génomiques et leur impact sur la condition physique¹². Cette technologie est un progrès majeur, mais l'insertion des codes à barres génomiques est encore un processus aléatoire. Pour surmonter le caractère aléatoire des expériences précédentes, Yoon et coll. ont mis au point une méthode pour calculer les IC des souches de Salmonella à l'aide de codes-barres d'ADN uniques insérés à des endroits précis sur les chromosomes des bactéries¹³. Des souches à code à barres uniques ont été détectées à l'aide d'une méthode qPCR avec sYBR vert et amorces spécifiques à chaque code-barres unique. La technique a été limitée par des contraintes imposées par qPCR, y compris des différences dans l'efficacité des amorces et une faible sensibilité, comme en témoigne la nécessité de l'imminance-PCR avant qPCR. Néanmoins, cette approche a démontré que des modifications génomiques ciblées pouvaient être exploitées pour détecter et quantifier potentiellement des bassins de souches bactériennes multiples.

Dans le protocole suivant, nous décrivons une nouvelle méthodologie pour effectuer des expériences de compétition bactérienne avec de grands pools d'inocula mélangés suivis d'une quantification précise à l'aide d'une technique de PCR numérique très sensible. Le protocole consiste à étiqueter génétiquement les souches bactériennes avec un code-barres unique d'ADN inséré sur une région inoffensive du chromosome. Cette modification permet aux souches d'être rapidement et avec précision quantifiées à l'aide de la technologie moléculaire moderne au lieu des dilutions en série traditionnelles, du placage de réplique et du comptage des unités de formation de colonies qui reposent sur des marqueurs phénotypiques (c.-à-d. résistance aux antibiotiques ). Les modifications permettent d'évaluer simultanément de nombreuses souches dans un seul inoculum mis en commun, réduisant considérablement la possibilité de variabilité expérimentale parce que toutes les souches sont exposées aux mêmes conditions exactes. En outre, bien que cette technique ait été développée dans Salmonella enterica serovar Typhimurium, elle est très adaptable à tout organisme génétiquement malléable et presque à toute conception expérimentale où des numérations bactériennes précises sont nécessaires, fournissant une nouvelle d'augmenter la précision et le débit dans les laboratoires de microbiologie sans les contraintes imposées par les méthodes précédentes.

1. Incorporez des codes-barres d'ADN uniques sur un Plasmide contenant les composants nécessaires à l'échange allélique

REMARQUE: Un nouveau plasmide, nommé pSKAP, avec un nombre de copies élevés et une efficacité de transformation accrue par rapport au plasmide d'échange allélique pKD13 existant a été créé. Cela est décrit dans les étapes 1.1-1.12 (figure 1). Les plasmides finalisés contenant des codes-barres et des composants uniques d'ADN pour l'échange allélique sont disponibles par l'intermédiaire d'un dépôt de plasmide (tableau des matériaux).

1. À l'aide d'un kit de miniprep plasmique commercial, purifie pKD13¹⁴ et pPCR Script Cam SK^- à partir de cultures bactériennes de nuit cultivées dans le bouillon Luria-Bertani (LB) complété par 50 g/mL de kanamycine ou 25 g/mL de chloramphenicol (pour pKD13 et pPCR Script Cam respectivement) ( Tableau1).
2. Effectuer des digestions de restriction sur les deux plasmides en utilisant des enzymes de restriction commerciale HindIII et BamHI selon les spécifications du fabricant.
3. Enlevez les enzymes de restriction et l'ADN excisé de la réaction de pPCR Script Cam SK et purifiez la paire de 3 370 bases (bp) épine dorsale plasmide à l'aide d'un kit de nettoyage de l'ADN disponible dans le commerce selon les spécifications du fabricant.
4. Séparez les fragments de la digestion de restriction de pKD13 sur un gel d'agarose de 1% utilisant une chambre d'électrophoresis.
5. Visualisez les bandes à l'aide d'un transilluminateur de lumière bleue et excisez le fragment de 1 333 pb du gel (Figure 1C).
   REMARQUE: Ce fragment contient le gène de résistance à la kanamycine frT-flanked requis pour le remplacement allélique chromosomique.
6. Purifier l'ADN excisé de l'étape 1.5 à l'aide d'un kit commercial d'extraction de gel.
7. Pour créer pSKAP, ligate le fragment purifié de pKD13 (à partir de l'étape 1.6) en pPCR Script Cam SK (à partir de l'étape 1.3) en utilisant une ligase commerciale d'ADN T4 selon les spécifications du fabricant.
8. Transformez les cellules DH5mD chimiquement compétentes avec le plasmide pSKAP ligated suivant le protocole du fabricant (tableau 1).
9. Étendre les transformants sur les plaques d'agar LB complétées par une kanamycine de 50 g/mL et incuber à 37 oC pendant la nuit.
10. Choisissez une colonie dans la plaque et étirez-la sur une nouvelle plaque d'agar LB complétée par une kanamycine de 50 g/mL et incubez-la à 37 oC pendant la nuit. Choisissez une colonie dans cette assiette et utilisez-la pour inoculer le bouillon LB complété par une kanamycine de 50 g/mL. Incuber la culture toute la nuit à 37 oC avec une agitation constante.
11. Utilisez un kit de miniprep plasmide commercial pour purifier le pSKAP de la culture bactérienne du jour au lendemain.
12. Effectuer une digestion de restriction diagnostique du plasmide à partir de l'étape 1.11 en utilisant Hind III et Bam HI selon les spécifications du fabricant. Visualisez des fragments sur un gel agarose de 1 % comme dans les étapes 1.4-1.5.
    REMARQUE: La taille totale de pSKAP devrait être de 4 703 pb. Les fragments après l'étape 1,12 devraient être de 3 370 et 1 333 pb.
13. Concevoir des amorces PCR pour la mutagénèse dirigée par site insertionnel (SDM) (tableau2 et S1) de manière à insérer une séquence unique d'ADN de 25 paires à la position 725 de pSKAP (figure 2).
    REMARQUE: L'ADN de code-barres est inséré dans le plasmide juste à l'extérieur du gène de résistance à la kanamycine flanqué de FRT, de sorte que le code-barres n'est pas perdu lors de l'enlèvement ultérieur de la cassette de résistance à la kanamycine. Si vous génèrez de nouvelles séquences de codes à barres, utilisez des outils en ligne pour vous assurer que les sondes PCR fluorescentes (ci-après appelées simplement « sondes ») se lient efficacement à la nouvelle séquence. Les séquences d'insertion conçues à ce jour, ainsi que les amorces nécessaires pour les créer, sont fournies dans les tableaux 2 et S1.
14. Préparer les réactions SDM à l'aide d'une polymérase commerciale à haute fidélité, des paires d'amorces souhaitées (tableau 2) et d'un modèle pSKAP. Définir le thermocycleur pour effectuer les étapes suivantes : 1) 98 oC pour 30 s, 2) 98 oC pour 10 s, 56 oC pour 15 s, 72 oC pour 2 min, 3) répéter les étapes 2, 24 fois, 4) 72 oC pour 5 min, 5) tenir à 4 oC.
15. Après l'achèvement de PCR, épuisez le modèle de pSKAP en ajoutant l'enzyme de restriction Dpn I à la réaction. Incuber à 37 oC pendant 20 min.
    REMARQUE: Les produits de PCR doivent être visualisés sur un gel d'agarose pour vérifier la taille et la pureté du produit. Une digestion d'I de contrôle composée du modèle non modifié de pSKAP peut être exécutée et employée dans les étapes suivantes pour s'assurer que l'ADN de modèle est complètement digéré.
16. Utilisez 5 L du produit à partir de l'étape 1,15 pour transformer 100 l de cellules DH5 commerciales chimiquement compétentes selon les recommandations du fabricant.
17. Étendre les transformants sur les plaques d'agar LB complétées par du chloramphenicol de 25 g/mL et incuber à 37 oC pendant la nuit.
18. Sélectionnez une colonie (ou colonies) à partir de plaques de nuit et stries sur des plaques d'agar LB individuelles complétées par du chloramphenicol de 25 g/mL et incubez à 37 oC pendant la nuit. Sélectionnez une colonie dans des assiettes de nuit et utilisez-la pour inoculer 5 ml de bouillon LB complété par du chloramphenicol de 25 g/mL. Incuber la culture (s) pendant la nuit à 37 oC avec une agitation constante.
19. Utilisez un kit de miniprep plasmide commercial pour purifier les plasmides de la culture de nuit.
20. Séquence de sanger plasmides purifiés à l'aide de l'amorce de séquençage vers l'avant M13 (tableau 2). Comparez la région mutée au plasmide d'origine et évaluez la précision de l'insertion SDM.
21. Après avoir confirmé l'insertion et la précision du code-barres, assignez chaque code-barres et plasmide zunauun un nom.
    REMARQUE: Les codes-barres générés à ce jour ont reçu une désignation de deux lettres : AA, AB, AC, ..., BA, BB, BC, etc. Les plasmides à code à barres sont désignés comme pSKAP-AA, pSKAP-AB, pSKAP-AC, ..., pSKAP-BA, pSKAP-BB, pSKAP-BC, etc.
22. Répétez les étapes 1.14-1.21 pour générer le nombre désiré de codes à barres d'ADN.

2. Introduire le code-barres d'ADN sur le chromosome de S. Typhimurium

REMARQUE: Insertion de codes-barres d'ADN sur le S. Typhimurium chromosome est atteint en utilisant une méthode d'échange allélique décrit par Datsenko et Wanner¹⁴ qui a été modifié pour une utilisation en S. Typhimurium.

1. Déterminer le locus sur le S. Génome du typhimurium pour insérer le code-barres de l'ADN (Figure 3).
   REMARQUE: Sélectionnez une grande région intergénique du chromosome. Évitez les régions qui produisent de l'ARN non codant. Cette étude a utilisé un locus en aval du put P entre les résidus 1 213 840 et 1 213 861 (déterminé à partir de l'assemblage du génome GCA-000022165.1). Cette région a déjà été génétiquement manipulée pour dans la complémentaration trans des gènes¹⁵. Alternativement, un code-barres d'ADN pourrait être introduit tout en perturbant simultanément un gène d'intérêt. Cela nécessiterait des modifications minimes à ce protocole et rationaliserait la création mutante.
2. Concevoir des amorces PCR pour amplifier le code-barres unique et le gène de résistance à la kanamycine à flanc de FRT du plasmide pSKAP désiré contenant du code-barres à partir de l'étape 1.21 (tableau 2). Ajouter des extensions de 40 nucléotides qui sont homologues à la région sélectionnée à l'étape 2.1 à la fin de 5' de chaque amorce (tableau 2).
3. Effectuez l'amplification à l'aide d'une polymérase commerciale haute fidélité, des amorces de l'étape 2.2 et du plasmide plasmide contenant le code-barres pSKAP souhaité comme modèle. Définir le thermocycleur pour effectuer les éléments suivants : 1) 98 oC pour 30 s, 2) 98 oC pour 10 s, 3) 56 oC pour 15 s, 4) 72 oC pour 60 s, répéter les étapes 2-4 29 fois, 5) 72 oC pour 5 min, 6) tenir à 4 oC.
4. Après l'achèvement de PCR, épuisez l'ADN de modèle utilisant DpnI comme décrit dans l'étape 1.15. Purifiez et concentrez l'ADN à l'aide d'un kit commercial de nettoyage de l'ADN selon les spécifications du fabricant.
5. Se référer au protocole précédemment publié pour générer des mutants en S. Typhimurium souche 14028s de produits PCR^14,16,17,18.
   REMARQUE: Il n'est pas essentiel que le gène de résistance à la kanamycine soit excisé du chromosome. Cependant, l'excision du gène est peu perturbatrice pour le chromosome bactérien car elle a comme conséquence une cicatrice de 129 bp qui laisserait les gènes en aval potentiels dans le cadre. Il est recommandé que la souche contenant le gène de résistance à la kanamycine soit conservée car elle peut être utilisée pour déplacer les codes-barres entre les souches par transduction à médiation P22.
6. Répétez les étapes 2.3 à 2.5 pour créer les souches désirées avec les codes à barres appropriés.
   REMARQUE: Les codes-barres peuvent être introduits dans le type sauvage S. Typhimurium qui peut ensuite être soumis à d'autres manipulations génétiques, ou codes à barres peuvent être introduits dans des souches qui ont déjà été génétiquement modifiés.

3. Conditions de croissance bactérienne et essais de concurrence in vitro

1. Du stock de bactéries, strie désirée S. Typhimurium souches qui abritent chacun un code-barres d'ADN unique sur les plaques d'agar LB. Incuber les assiettes pendant la nuit à 37 oC.
2. Sélectionnez une seule colonie de chaque souche et inoculer 5 ml de bouillon LB. Incuber pendant 20 h à 37 oC avec une agitation constante.
   REMARQUE: En utilisant la culture du jour au lendemain, passez à l'étape 3.5 pour recueillir l'ADN génomique pur (GDNA) de chaque souche codée à barres. Ceci est nécessaire pour les expériences ultérieures de validation et de contrôle de la section 6.
3. Pour chaque essai de compétition, transférez un volume égal de chaque culture de nuit dans un tube stérile de taille appropriée. Mélanger soigneusement les souches ensemble en vortexant vigoureusement pendant au moins 5 s.
   REMARQUE: Le volume de chaque culture de nuit à transférer devrait être suffisant pour chaque condition et de reproduire, ainsi que pour isoler l'ADN gpour quantifier l'entrée. Bien qu'il ne soit pas tout à fait nécessaire de mesurer les densités optiques des cultures parce que le nombre absolu de micro-organismes d'entrée sera quantifié à l'aide de PCR numérique, le nombre de bactéries d'entrée pour chaque souche devrait être à peu près égal pour éviter les goulots d'étranglement ou concurrence inégale au début de l'expérience. Les tests de concurrence représentatifs dans ce protocole ont comparé simultanément les taux de croissance de 8 souches. Des souches supplémentaires ou moins nombreuses peuvent être nécessaires pour des conceptions expérimentales individuelles.
4. Transférer 100 l de l'inoculum mélangé dans un bouillon LB stérile de 4,9 ml. Incuber à 37 oC pour le temps désiré ou à une densité optique désirée.
5. Récolte de 500 l'inoculum par centrifugation à 12 000 x g pendant 1 min. Retirez et jetez le supernatant. Passez immédiatement à la section 4 avec les cellules.
6. Aux moments désirés, retirez 500 aliquots de culture et récoltez les cellules par centrifugation à 12 000 x g pendant 1 min. Retirez et jetez le supernatant.
   REMARQUE: Si vous collectez des aliquots à plusieurs points de temps, congelez les granulés à -20 oC ou passez immédiatement à l'étape 4.1 après chaque collecte.

4. Collecte et quantification de l'ADN g de S. Typhimurium (à partir des étapes 3.5 et 3.6)

1. Récoltez l'ADNc à partir de cellules à l'aide d'un kit commercial de purification de l'ADNc. Si disponible, effectuez l'étape facultative d'épuisement d'ARN.
   REMARQUE: L'épuisement de l'ARN n'est pas nécessaire; cependant, la présence d'ARN augmentera artificiellement la concentration d'ADN, menant aux calculs aberrants dans les étapes suivantes. Si vous utilisez un kit commercial de purification de l'ADNc, suivez les recommandations du fabricant pour vous assurer que la colonne n'est pas surchargée d'ADN. Il n'y a pas de concentration minimale d'ADN requise si l'échantillon est quantifiable dans les étapes suivantes.
2. Utilisez un spectrophotomètre pour quantifier l'ADN dans chaque échantillon.
   REMARQUE: L'ADN peut être quantifié à l'aide de n'importe quelle méthode fiable.
3. Calculer le nombre de copies d'ADNc en fonction de la taille du génome bactérien en utilisant l'équation suivante où: X est la quantité d'ADN en ng et N est la longueur d'une molécule d'ADN à double brin (la taille du génome).
   
   REMARQUE : 660 g/taupe est utilisée comme masse moyenne de 1 ADN bp. De petites variations peuvent exister selon la composition du nucléotide de l'organisme. De nombreuses calculatrices sont disponibles en ligne pour effectuer le calcul.

5. Concevoir des amorces et des sondes pour la détection quantitative des codes à barres d'ADN par l'intermédiaire de PCR dDigital

1. Concevoir des amorces pour amplifier la région codée à barres du S. Chromosome typhimurium en aval du putP (Figure 3C et tableau 2).
   REMARQUE: Les conceptions d'apprêt et de sonde peuvent être facilitées par de nombreux programmes en ligne (tableaudes matériaux). Si les codes-barres sont tous insérés au même loci, un seul ensemble d'amorces d'amplification est universel pour tous les codes à barres.
2. Concevoir des sondes à base de 6 carboxyfluorescein (FAM) et/ou hexachlorofluorescein (HEX) spécifiques à chaque code-barres (tableau2 et S1).
   REMARQUE: Le lecteur de gouttelettes utilisé dans cette expérience est capable de détecter simultanément les sondes BASÉES sur FAM et HEX dans une réaction multiplexe. Concevoir la demi-partie des sondes pour utiliser FAM et 1/2 pour utiliser HEX. Il ne s'agit pas d'une étape nécessaire, mais elle réduira l'utilisation du réactif et les coûts expérimentaux s'ils sont mis en œuvre.
3. Faire 20x mélanges maître d'amorce-probe contenant 1) 20 mm de chaque amorce d'amplification vers l'avant et inverse, 2) 10 mm d'une seule sonde FAM, et 3) 10 mM d'une seule sonde HEX (si multiplexage).

6. Valider la sensibilité et la spécificité de chaque ensemble de sondes Pprimer pour chaque code à barres génomique à l'aide de PCR numérique

REMARQUE: Ce protocole utilise la validation de huit codes à barres uniques avec huit sondes uniques à titre d'exemple. Le nombre de codes-barres utilisés peut être augmenté ou diminué pour accueillir diverses conceptions expérimentales.

1. Créez un pool de gDNA qui contient tous les codes à barres sauf un. Utilisez ce pool comme diluant pour effectuer une série de dilution avec de l'ADN g contenant le seul code à barres restant (le schéma de dilution de l'échantillon est fourni à la figure 4).
   REMARQUE: L'utilisation de l'ADG mise en commun comme diluant assure un arrière-plan cohérent tout en vérifiant la sensibilité. À l'aide des numéros de copie déterminés à l'étape 4.3, diluer l'ADGn à un numéro de copie dans la plage pcR numérique recommandée (1 à 100 000 exemplaires par réaction de 20 L). Gardez à l'esprit que la plage est fixée pour chaque cible unique (code à barres), pas l'ADN total.
2. Préparer les réactions pour PCR numérique en double selon les recommandations du fabricant pour l'utilisation d'un supermix PCR numérique conçu pour la chimie basée sur la sonde. Utilisez les mélanges de l'étape 6.1 comme modèle d'ADN. Utilisez le mix maître 20x primer-probe de l'étape 5.3 qui contient la sonde pour le code à barres dilué dans l'étape 6.1.
3. Préparer les réactions de contrôle de répétition pour PCR numérique selon les recommandations du fabricant pour l'utilisation d'un supermix PCR numérique conçu pour la chimie basée sur la sonde. Les réactions de contrôle pour chaque mélange de sonde doivent consister en 1) aucun modèle de contrôle (CNT), 2) de contrôles négatifs et 3) de contrôles positifs.
   REMARQUE: Le nombre minimum de réactions de contrôle de repli est de deux. Cet exemple de protocole utilise quatre CNT, six contrôles négatifs et six contrôles positifs pour chaque code à barres. Les contrôles négatifs doivent contenir de l'ADN g avec chaque code à barres, à l'exception du code-barres correspondant à la sonde testée. Cela permettra de valider la spécificité de chaque sonde.
4. Répétez les étapes 6.1-6.3 pour créer des réactions PCR numériques pour chaque échantillon de gDNA codé à barres. Un arrangement de plaque d'échantillon est présenté à la figure 5.
   REMARQUE: Cette étape et les étapes suivantes sont décrites sur la base d'une plate-forme PCR numérique spécifique qui utilise des gouttelettes et une technologie basée sur le flux. D'autres plates-formes PCR numériques qui utilisent la technologie à puce peuvent facilement être remplacées par de légères modifications à ce protocole. L'étape 6.4 peut nécessiter plus d'une plaque de 96 puits pour valider tous les ensembles d'amorces. Contrairement au qPCR, les plaques séparées analysées par PCR numérique peuvent être facilement comparées sans avoir besoin de puits de référence normalisés entre les plaques.
5. Générer des gouttelettes pour chaque condition de réaction à l'aide d'un générateur de gouttelettes selon les instructions du fabricant.
6. Transférer les gouttelettes nouvellement créées dans la plaque appropriée de 96 puits. Utilisez des pointes de pipette de 200 l sur une pipette multicanal de 5 à 50 l.
   REMARQUE: Lorsque pipetting gouttelettes, pipette lentement et en douceur! Le fabricant d'équipement sp. numérique recommande d'utiliser uniquement des pipettes et des conseils de pipette s'il n'y a pas de fabricants particuliers (p. ex. Ranin). Ces pointes de pipette ont une ouverture lisse sans fragments de plastique microscopiques qui peuvent détruire des gouttelettes ou endommager les microfluidiques du lecteur de gouttelettes. De nombreuses marques de conseils ont été examinées et observées pour avoir un spectre de qualité de fabrication. Des résultats équivalents ont été obtenus à l'aide d'alternatives à la pointe de pipette; toutefois, il faut faire preuve de prudence lorsqu'il s'écarte des recommandations du fabricant.
7. Une fois que toutes les gouttelettes ont été générées et transférées, scellez la plaque à l'arme à l'eau.
8. Utiliser le thermocycleur recommandé par le fabricant pour effectuer les conditions de cycle suivantes : 1) 94 oC pendant 10 min; 2) 94 oC pour 1 min, taux de rampe fixé à 1 oC/s; 3) 55 oC pendant 2 min, taux de rampe fixé à 1 oC/s; 4) répéter les étapes 2 et 3 49 fois; 5) 98 oC pendant 10 min; 6) tenir à 4 oC jusqu'à 24 h.
   REMARQUE: Le transfert thermique dans une réaction de gouttelette n'est pas le même que PCR standard. Les conditions de réaction peuvent nécessiter des modifications.
9. Pendant que le thermocyclisme est effectué, programmez le logiciel d'analyse de données avec les informations de configuration de plaque telles que le nom de l'échantillon, le type d'expérience (quantification absolue), le supermix utilisé, le nom cible 1 (nom de code-barres FAM), le type de cible 1 (NTC, contrôle positif, contrôle négatif, ou inconnu), nom cible 2 (nom de code à barres HEX), type cible 2 (blanc, contrôle positif, contrôle négatif ou inconnu). Les informations de configuration de la plaque finale sont affichées à la figure 5.
10. Une fois le thermocycle terminé, transférez les réactions terminées au lecteur de gouttelettes et commencez le processus de lecture selon les instructions du fabricant.

7. Quantifier le nombre de bactéries dans une expérience d'indice concurrentiel

1. Diluer l'ADN g isolé et quantifié de la section 4 à une concentration appropriée comme décrit ci-dessus.
2. Préparer les réactions pour PCR numérique selon les recommandations du fabricant pour l'utilisation du supermix approprié. Utilisez l'ADN de l'étape 7.1 comme modèle. Utilisez un mélange maître 20x primer-probe qui contient la sonde (ou les sondes si la détection à la fois FAM et HEX) pour les codes à barres possibles présents dans l'expérience.
3. Préparer des réactions PCR numériques supplémentaires comme à l'étape 7.2 en utilisant différents mélanges 20x primer-probe maître jusqu'à ce que tous les codes-barres utilisés dans la conception expérimentale peut être détecté.
4. Inclure des contrôles pour chaque condition décrite dans 6.3. Cela comprend 1) aucun modèle de contrôle (CNT), 2) les contrôles négatifs et 3) les contrôles positifs.
5. Continuer avec le protocole tel que décrit dans les étapes 6.5-6.10.

8. Analyser les données PCR numériques et calculer les numéros de copie absolue

1. Lorsque tous les puits ont été lus et que l'exécution est terminée, ouvrez le fichier de données .qlp à l'aide du logiciel d'analyse de données.
   REMARQUE: Les types de fichiers et les procédures d'analyse de données décrites ici sont spécifiques à un fabricant de PCR numérique. Si l'utilisation d'autres plates-formes PCR numériques, les types de fichiers et les procédures d'analyse de données seront spécifiques à la plate-forme utilisée et doivent être effectuées selon les spécifications recommandées par le fabricant.
2. Sélectionnez tous les puits qui utilisent le même mélange maître amorce-probe.
3. Sur l'onglet Droplets, examinez le nombre de gouttelettes analysées dans chaque puits (gouttelettes positives et négatives). Exclure de l'analyse tout puits qui a moins de 10.000 gouttelettes totales.
4. Déplacez-vous vers l'onglet Amplitude 1D et examinez les amplitudes des gouttelettes positives et négatives. Assurez-vous qu'ils comprennent deux populations distinctes.
5. Dans le logiciel, utilisez la fonction de seuil pour faire une coupure entre les gouttelettes positives et négatives pour chaque sonde qui a été utilisée (Figure 6).
   REMARQUE: Tous les puits qui utilisent le même mélange maître amorce-probe de l'étape 5.3 devraient avoir les mêmes seuils.
6. Une fois que des seuils appropriés ont été appliqués à tous les puits, le logiciel calculera le nombre de copies d'ADN dans chaque réaction. Exporter des données vers une feuille de calcul pour faciliter une analyse plus approfondie.
   REMARQUE: Le logiciel d'analyse de données utilise le nombre de gouttelettes positives et négatives qui sont adaptées à une distribution Poisson pour déterminer le numéro de copie.
7. À l'aide des valeurs de l'étape 8.6, calculez le numéro de copie initial de chaque code à barres génomique unique de l'échantillon. Déterminez le taux moyen de faux positifs à partir des réactions de contrôle négatives et soustrayez cette valeur des valeurs obtenues dans les réactions expérimentales. Multipliez les valeurs au besoin en fonction des dilutions qui ont été effectuées lors de la mise en place de chaque expérience (tableau 3).

9. Déterminer l'aptitude relative d'un organisme en calculant l'IC ou l'ICO à partir de quantification numérique à base de PCR des souches à codes à barres

1. Calculer l'IC d'une souche codée à barres en utilisant les formules suivantes où: A_Output est la quantification absolue de la souche codée à barres à un point de temps donné, WT_Output est la quantification absolue des bactéries de type sauvage codées à barres en même temps timepoint, A_Input est la quantification absolue de l'inoculum d'entrée de la souche codée à barres, WT_Input est la quantification absolue de l'inoculum d'entrée des bactéries de type sauvage codées à barres, X_Output est la synthèse de toutes les souches à le même point de temps, X_Input est la somme de l'inoculum d'entrée totale de toutes les souches codées à barres.

REMARQUE: Voir la discussion pour les avantages, les inconvénients, et l'utilisation la plus appropriée de chaque formule.

2. Répétez l'étape 9.1 pour chaque souche codée à barres à tous les moments.
3. Le cas échéant, calculer l'ICO à l'aide des formules suivantes où : Une_sortie est la quantification absolue d'une souche codée à barres avec le gène Muté A à un point de temps donné, AB_Output est la quantification absolue d'une souche codée à barres avec les gènes mutés A et B en même temps, A_Input est la quantification absolue de l'inoculum d'entrée de la souche à code à barres avec le gène muté A, AB_Input est la quantification absolue de l'inoculum d'entrée de la souche codée à barres avec les gènes mutés A et B, B_{La production} est la quantification absolue d'une souche codée à barres avec le gène B muté à un point de temps donné, et B_Input est la quantification absolue de l'entrée inoculum de la souche à code à barres avec le gène muté B.

ET/OU

L'utilisation de cette méthodologie exige que des réactions de contrôle appropriées soient effectuées pour valider la sensibilité et la spécificité de chaque sonde utilisée pour identifier l'ADN cible. Dans cette expérience représentative, nous avons validé huit codes-barres d'ADN uniques avec les huit sondes correspondantes pour identification. Les huit sondes avaient un faible taux de faux positifs dans les réactions de contrôle du CNT et négatives (tableau 3), soulignant leur spécificité même parmi les séquences d'ADN très similaires. Pour évaluer la sensibilité de chaque condition, l'ADNc contenant un code-barres unique a été dilué en série dans un fond constant de gDNA contenant chacune des sept séquences restantes de code à barres. Avec l'approche décrite ci-dessus, PCR numérique pourrait distinguer aussi peu que 2 copies de gDNA dans un fond de près de 2.000.000 séquences d'ADN similaires (tableau 3).

En plus de déterminer la sensibilité et la spécificité de chaque séquence de code-barres de sonde et d'ADN, les dilutions effectuées dans l'étude de validation nous ont permis de calculer un indice concurrentiel simulé à partir des données résultantes. Bien qu'il n'y ait pas eu d'entrée ou de sortie réelle pour cette expérience, les données peuvent être analysées comme si une expérience de compétition avait été effectuée. Pour ce faire, nous considérons chaque mélange dans la dilution en série comme une sortie (AOutput) pour le code à barres dilué, tandis que la sortie totale (XOutput), entrée (AInput), et l'entrée totale (XInput) de chaque souche est calculée à partir de la quantification dans les contrôles positifs où tous les codes-barres sont inclus. En utilisant le facteur de dilution pour chaque mélange, l'IC théorique a été déterminé et est rapporté dans le tableau 3. Dans chacune des séries de dilution exécutées pour chaque code à barres, l'IC simulé moyen est signalé avec les écarts types pour chaque série de dilution en double. Dans tous les cas, l'IC simulé qui a été calculé est similaire à l'IC théorique. La majorité des CI calculées s'écartent des CI théoriques de moins de 25 %. Dans les cas de CI théoriques inférieurs, l'écart de la valeur calculée était multiplié par plus de 2. Par exemple, il s'agissait d'un changement d'UN IC théorique de 0,000625 à un IC calculé de 0,001220. Ces données soulignent que la méthode décrite est à la fois très précise et très précise. La combinaison d'une sensibilité élevée, de la spécificité, de la précision et de la précision permet à ce système de détecter de façon fiable les différences de condition physique qui pourraient autrement passer inaperçues.

Après avoir validé que les codes à barres génomiques pouvaient être détectés et quantifiés avec précision, nous avons effectué des expériences de compétition in vitro (tableau4). La première expérience de compétition a utilisé huit sauvages de type S. Des souches de typhimurium qui contenaient chacune un code-barres d'ADN unique. Chaque souche a été cultivée du jour au lendemain, et les huit cultures ont été mélangées en quantités égales. 100 L de cet inoculum mélangé ont été utilisés pour inoculer 4,9 ml de bouillon de LB stérile et la culture qui en a résulté a été incubée à 37 oC avec une agitation constante. gDNA a été récolté à partir de l'inoculum pour calculer l'entrée exacte de chaque souche. La croissance de la culture a été surveillée en mesurant l'absorption à 600 nm (OD600). À l'OD600 et 0,5 (phase logarithmique), un échantillon a été prélevé dans chaque culture et l'ADNc g a été prélevé. La culture restante a été retournée à 37 oC avec une agitation constante jusqu'à 8 heures après l'inoculation lorsqu'un échantillon final a été prélevé et que l'ADN g a été prélevé (stationnaire). Les résultats ont été calculés à l'aide de la formule CI modifiée pour les infections mises en commun. Comme prévu, toutes les souches de type sauvage avaient des valeurs CI presque égales à 1 (tableau 4). Une expérience de compétition similaire a été réalisée à l'aide de huit mutants S. Les souches de Typhimurium qui avaient chacune des codes-barres uniques en plus d'une carence en une seule, double ou triple transketolase18. Comme indiqué précédemment, les souches ont toutes augmenté de la même façon dans le bouillon LB, avec seulement un léger décalage observé dans la souche triple-transketolase-déficiente. Cependant, lorsque la croissance de chaque souche a été évaluée en analysant l'IC, un défaut beaucoup plus profond a été observé pour la souche transketolase-déficiente (CI a été comparé aux courbes de croissance dans Shaw et al.18). En outre, cette expérience nous a permis d'attribuer une valeur quantifiable aux caractéristiques de croissance de chaque souche au lieu de simplement décrire qualitativement les modèles de croissance. Les CI pour chaque souche ont été calculées à l'aide de la formule traditionnelle où chaque souche n'était comparée qu'à la formule sauvage et de la formule modifiée où toutes les souches d'entrée étaient prises en considération. Bien que les changements aient été faibles, l'IC de la souche triple-transketolase-déficiente était artificiellement faible dans la formule traditionnelle parce qu'elle ne tient pas compte des six autres souches concurrentes qui présentaient toutes une forme physique de type quasi sauvage.

Tableau 1 : Souches et plasmides utilisés dans cette étude.

Tableau 2 : Amorces et sondes utilisées dans cette étude.

Tableau 3 : Quantification absolue et calcul simulé de l'IC.

Tableau 4 : Résultats représentatifs de la compétition in vitro entre S. Typhimurium souches.

Tableau S1. Amorces facultatives pour créer des séquences de codes à barres supplémentaires et des sondes fluorescentes correspondantes pour leur détection. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 1. Génération de pSKAP. (A) Purified pKD13 a été soumis à la digestion de restriction avec HindIII et BamHI. (B, C) Le fragment d'intérêt de 1 333 pb contenant un gène de résistance à la kanamycine à flanc de FRT a été purifié. (D) pPCR Script Cam SKA a également été digéré avec HindIII et BamHI et le fragment de pKD13 (B) a été ligated dedans pour générer (E) pSKAP. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Mutagénèse dirigée par site insertionnel à pSKAP. (A) L'insertion de codes-barres d'ADN de 25 pb à la position 725 a été effectuée à l'aide de PCR. Les amorces avant et inversées spécifiques à cet emplacement ont été conçues avec des extensions complémentaires de 25 nucléotides 5' (indiquées dans l'amorce comme minuscules "a"). (B) Un plasmide générique pSKAP-Barcode résultant de SDM est montré avec l'emplacement du code à barres d'ADN inséré mis en évidence orange. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Réarrangement chromosomique en aval du putP. (A) Après une recombinaison médiée par le rouge, le gène de résistance à la kanamycine sélectionnable (violet foncé) flanqué de sites FRT (gris) est inséré sur le chromosome entre les loci indiqués (Site de recombinaison chromosomique, rouge). Le code-barres ADN unique (orange) est inséré juste à l'extérieur du site FRT. (B) Le gène de résistance à la kanamycine est enlevé par excision médiée par frEt, laissant un reste d'ADN inséré sur le chromosome (ADN inséré total, bleu) composé du code-barres d'ADN et d'une cicatrice FRT. (C) La séquence d'ADN chromosomique modifiée entourant l'ADN inséré est montrée, ainsi que les sites d'amorçage d'amplification (violet clair) utilisés pour le PCR numérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Système de dilution pour valider la sensibilité et la spécificité de la sonde fluorescente. (A) L'ADNc purifié de sept souches codées à barres est mélangée en quantités égales pour créer le diluant pour diluer l'ADG codé à barres omis (AX dans l'exemple ci-dessus). (B) Effectuer une dilution en série de l'ADNc à code à barres omis (AX dans l'exemple ci-dessus) à l'aide du diluant préparé décrit précédemment. Mélanger soigneusement le contenu de chaque tube avant de le transférer au tube suivant. Figure 4 a été créé avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Disposition des plaques pour l'analyse de la sensibilité et de la spécificité des ensembles 1 et 2 de la sonde d'amorce. L'expérience PCR numérique comprend des CNT, des contrôles positifs, des contrôles négatifs et les systèmes de dilution pour chacun des codes à barres testés. La plaque pour valider les ensembles de sonde d'apprêt 3 et 4 est disposée dans le même modèle en utilisant l'ADNc à code à barres approprié. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Résultats PCR numériques représentatifs de l'AA-coded gDNA dilué AA. gDNA contenant le code-barres AA a été dilué dans un arrière-plan de tous les autres aDNc à code à barres tels que décrits dans la figure 4. Le canal 1 représente la sonde FAM pour le code à barres AA (panneaux supérieurs) tandis que le canal 2 représente la sonde HEX pour le code à barres AO (panneaux inférieurs). Les résultats de chaque sonde sont présentés à la fois sous forme d'amplitude fluorescente individuelle (panneaux gauches) et d'un histogramme représentant la fréquence de l'intensité fluorescente de toutes les gouttelettes dans les puits sélectionnés (panneaux droits). Pour chaque condition, les gouttelettes positives (fluorescence élevée) et négatives (faible fluorescence) devraient former deux populations distinctes. Dans le cas des AA qui ont été dilués, et la plupart des gouttelettes étaient négatives, l'histogramme (panneau supérieur droit) semble représenter seulement une seule population. C'est parce que les gouttelettes positives sont largement plus nombreuses que les gouttelettes négatives; cependant, deux populations distinctes sont encore visibles en examinant l'amplitude fluorescente des gouttelettes dans les panneaux gauches.  Les populations doivent être séparées en utilisant la fonction de seuil pour définir les gouttelettes positives et négatives (visualisées par la ligne rose). Les valeurs de seuil varient en fonction des sondes qui ont été utilisées, mais tous les puits qui utilisent le même mélange de sondes devraient avoir des seuils identiques. Comme l'AA-barcoded gDNA a été dilué, il ya une diminution des gouttelettes positives (haute fluorescente) tandis que le nombre de gouttelettes AO positives reste constante en arrière-plan. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs n'ont rien à révéler.