Method Article

Isolement et quantification du virus Zika à partir de plusieurs organes dans une souris

DOI:

10.3791/59632

⸱

August 15th, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Saint Louis University, 2School of Veterinary Medicine University of California Davis

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'objectif du protocole est de démontrer les techniques utilisées pour étudier les maladies virales en isolant et en quantifiant le virus Zika, à partir de plusieurs organes d'une souris après l'infection.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les méthodes présentées démontrent les procédures de laboratoire pour l'isolement des organes des animaux infectés par le virus Zika et la quantification de la charge virale. Le but de la procédure est de quantifier les titreleurs viraux dans les zones périphériques et du SNC de la souris à différents moments après l'infection ou dans des conditions expérimentales différentes afin d'identifier les facteurs virologiques et immunologiques qui régulent l'infection par le virus Zika. Les procédures d'isolement d'organe démontrées permettent à la fois la formation de mise au point quantification et l'évaluation quantitative de PCR des titers viraux. Les techniques d'isolation rapide des organes sont conçues pour la préservation du téter antivirus. La quantification virale des titers par la mise au point de formation d'analyse permet l'évaluation rapide du débit du virus Zika. L'avantage de l'analyse de formation de mise au point est l'évaluation du virus infectieux, la limitation de cet analyse est le potentiel de toxicité des organes réduisant la limite de détection. L'évaluation virale de la térade est combinée avec le PCR quantitatif, et l'utilisation d'un numéro de copie virale recombinante de copie de copie de copie d'ARN dans l'organe est évaluée avec la limite basse de la détection. Dans l'ensemble, ces techniques fournissent une méthode de débit rapide précise pour l'analyse des titers viraux Zika dans la périphérie et le SNC des animaux infectés par le virus Zika et peuvent être appliquées à l'évaluation des titreleurs viraux dans les organes des animaux infectés par la plupart des pathogènes pathogènes, y compris le virus de la dengue.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le virus Zika (ZIKV) est un arbovirus qui appartient à la famille des flaviviridae, qui comprend d'importants pathogènes humains neuro-invasifs tels que le virus Powassan (POWV), le virus de l'encéphalite japonaise (JEV) et le virus du Nil occidental (VNO)1. Suite à son isolement et à son identification, il y a eu des rapports périodiques d'infections humaines de ZIKV en Afrique et en Asie2,3,4,5, et des épidémies en Amérique centrale et du Sud (revue en référence6). Cependant, ce n'est que récemment que le ZIKV a été pensé pour causer la maladie grave7. Maintenant, il ya des milliers de cas de maladies neurologiques et des malformations congénitales liées à des infections ZIKV. L'émergence rapide de ZIKV a suscité de nombreuses questions concernant: pourquoi il ya une augmentation de la gravité de la maladie, quelle est la réponse immunologique à l'infection ZIKV et y at-il des pathologies virales et / ou immunitaires à médiation liée à l'augmentation des troubles neurologiques manifestations et malformations congénitales. Il y a maintenant une ruée pour comprendre la maladie liée au système nerveux central (SNC) associée au ZIKV ainsi que la nécessité de tester rapidement l'efficacité des antiviraux et des vaccins contre le ZIKV. C'est dans ce contexte que nous avons développé des méthodes pour l'analyse rapide des titers ZIKV dans la périphérie et le SNC à l'aide d'un focus spécifique à ZIKV formant des essais (FFA).

Les modèles de petits animaux sont importants pour comprendre la progression de la maladie et pour l'évaluation précoce des vaccins, des traitements et des antiviraux. Nous avons établi de petits modèles animaux pour l'étude de la maladie d'arbovirus en utilisant diverses souches de souris pour modéliser l'infection humaine et la protection contre les agents pathogènes viraux8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. En utilisant cette expérience antérieure, nous avons commencé à modifier les techniques utilisées pour l'évaluation du VNO et du virus de la dengue, un flavivirus connexe pour l'évaluation de la ture ZIKV dans les deux organes périphériques ainsi que le CNS21,23, 24. Les avantages de ces méthodes par rapport à d'autres essais sont les : 1) qu'elles combinent la capacité de récolter des organes périphériques et du SNC pour l'analyse; 2) les méthodes sont adaptables pour la cytométrie de flux, pour des mesures des réponses immunitaires innées et adaptatives, avec des titers viraux sur le même animal dans le même organe ; 3) la technique de récolte est adaptable pour l'analyse histologique ; 4) le FFA de ZIKV est une méthode rapide de haut débit pour l'analyse virale de titer ; et 5) ces méthodes peuvent être appliquées à l'évaluation des titreleurs viraux dans les organes des animaux infectés par la plupart des agents pathogènes25.

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Protocol

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Toutes les procédures de la présente étude sont conformes aux lignes directrices du Comité de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de St. Louis. SLU est entièrement accrédité par l'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC).

1. Isolement d'organe

REMARQUE: Le virus n'étant pas stable à température ambiante (RT), le nombre d'animaux récoltés en même temps doit être planifié avec soin pour préserver les titres viraux.

  1. Infecter les souris en utilisant la dose et l'itinéraire choisis, en fonction du phénotype requis. Pour ce protocole, infecter les souris de 8 à 10 semaines de type I de récepteur d'interféron (Ifnar1-/)C57BL/6.
    1. Anesthésiez ifnar1-/- souris avec un cocktail de kétamine (90 mg/kg) et de Xylazine (10 mg/kg). Testez le réflexe de pédale par une pincée ferme d'orteil pour confirmer l'anesthésie. Administrer 1 x 105 unités de formation de mise au point (FFU) de ZIKV dans 50 L sous-cutané (SC) via le pied.
  2. Préparer tous les matériaux nécessaires à la récolte la veille : 2 ciseaux, des forceps et 20 ml d'éthanol à 70 % (EtOH) dans un conique de 50 ml pour la désinfection des outils.
    1. Préparer les seringues et les aiguilles : une seringue de 20 ml pour la perfusion, 23 aiguilles G (environ 1 par cage) et une seringue de 1 ml avec une aiguille de 25 G (1 par souris de 3 à 5). Avant de peser les tubes, ajouter les perles d'acier (dans le capot) aux tubes de capuchon à vis à anneau O de 1,5 mL (un pour chaque organe). Les tubes doivent être appropriés pour l'homogénéisation.
  3. Préparer le jour de la récolte les matériaux nécessaires à la perfusion et à la congélation des organes.
    1. Remplissez un seau à glace de glace sèche et 70% EtOH pour faire un bain de glace. Préparer le phosphate stérile tamponné salin (PBS) en supposant que 25-30 ml par souris de PBS pour chaque perfusion est nécessaire 5-10 ml pour la moelle épinière). Obtenir une anesthésie, un cocktail de kétamine et de Xylazine, et assumer 300 L par souris. Placez tous les matériaux et les tubes supplémentaires nécessaires à la cytométrie d'écoulement, etc., dans un conteneur secondaire pour le transporter à l'établissement animalier.
  4. Suivez toutes les procédures nécessaires à l'entrée, y compris l'enfilage et le doffing équipement de protection personnelle lors de l'entrée et la sortie dans l'établissement pour animaux.
    MISE EN GARDE: Toutes les procédures doivent être effectuées dans un coffret de biosécurité certifié au sein d'un laboratoire de biosécurité de niveau 2 (BSL-2).
  5. Administrer l'anesthésie, 200-500 L, par voie intrapéritone en fonction de la taille et du poids de l'animal. Si vous travaillez seul, administrez l'anesthésie à un animal à la fois pour éviter de tuer les animaux avant la récolte des organes.
    1. Confirmer la dose d'anesthésie en pinçant l'orteil avec des forceps pour évaluer le réflexe de la pédale. Ne continuez pas à moins d'être complètement insensible. Utilisez des broches pour fixer la souris sur une planche de cire. À ce stade, arroser la souris dans 70% d'éthanol pour éviter la contamination des cheveux dans la procédure de récolte d'organes
  6. Saignement en phase terminale par ponction cardiaque.
    1. À l'aide des ciseaux et des forceps, ouvrez l'animal à travers la cavité thoracique pour exposer le cœur. Recueillir du sang par perforation cardiaque (800 l), cela peut être utilisé pour de multiples essais, y compris la chimie clinique, l'hématologie, la cytométrie de flux pour détecter les réponses spécifiques à l'antigène, et en temps réel quantitative PCR (qRT-PCR) pour l'analyse du numéro de copie virale.
    2. Pour l'analyse virale d'ARN par qRT-PCR, recueillez le sang dans un tube d'EDTA si extraire du sang entier ou dans un tube de microcentrifuge si extraire du sérum. (Pour le sérum, spin tube à vitesse maximale dans la centrifugeuse, température ambiante, pendant 20 min et retirer le sérum à un tube séparé). Ajouter un polyacrylamide linéaire comme porteur à l'échantillon de sérum après la finition. L'ARN peut ensuite être analysé ou stocké à -80 oC pour poursuivre le traitement à une date ultérieure.
  7. Remplissez la seringue de 20 ml de PBS, à température ambiante (ou 37 oC), et perfssez les souris en insérant l'aiguille papillon dans le ventricule gauche. Perforez l'atrium droit pour permettre au sang et au PBS de sortir. Administrer lentement le PBS tout en vérifiant la couleur du foie pour confirmer que l'animal est complètement perfusé. Le foie devrait passer d'une couleur rouge foncé à une couleur de saumon rose.
    1. Si vous préparez les organes pour l'histologie, laissez l'aiguille de papillon en place, puis perfillez avec 20 ml de paraformaldéhyde glacé de 4 %. Si c'est le cas, il est commode d'avoir la seringue connectée à un stopcock à 3 voies avec les deux seringues attachées à elle, tournant la valve ON et OFF comme on alterne entre PBS et PFA.
  8. Récoltez les organes dans des tubes étiquetés et pesés. Pour les organes périphériques, suivez un ordre établi pour la récolte : foie, rate, rein et poumons.
    1. Ne prenez qu'un seul lobe du foie; il n'a pas d'importance lequel, mais pour toutes les expériences toujours essayer de prendre le même lobe avec la même pièce de taille. De même, pour les reins et les poumons, prendre le même rein et les poumons. Si la cytométrie de flux doit également être complétée, n'importe quel organe peut être coupé en deux. Conserver la moitié à utiliser pour la cytométrie dans le milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) à température ambiante jusqu'à ce que la récolte soit terminée.
    2. Immédiatement après la récolte, mettre chaque organe dans un tube étiqueté et placer dans le bain de glace sèche. Le tiseur de virus réduit avec le temps à la température ambiante, de sorte que le temps qu'il faut pour récolter les organes est extrêmement important. Il doit y avoir une cohérence entre les souris, donc après la sécurité, la prochaine priorité est la vitesse.
      REMARQUE: Si la récolte d'organes pour les titreleurs viraux, il est très utile d'avoir une deuxième récolte individuelle du cerveau à ce stade, pour préserver les titres viraux.
  9. Retirez les organes restants de la cavité du corps de la souris pour accéder à la colonne vertébrale et au crâne.
    1. Retirez la souris de la planche et retirez la peau, suivie de l'enlèvement des bras et des jambes.
      Retirez la tête de la souris avec une décapitation, des ciseaux émoussés ou chirurgicaux pour récolter le cerveau en coupant le crâne avec un ciseaux LaGrange dentelé à travers le magnum foramen. Ensuite, décoller le crâne avec des forceps et ramasser le cerveau avec une spatule.
    2. À l'aide de ciseaux émoussés, retirez les côtes et autres os entourant la colonne vertébrale. Ensuite, couper à travers l'os pelvien, en exposant le foramen vertébral au niveau lombaire. La petite pointe de la moelle épinière doit être visible à ce stade.
    3. Utilisez une seringue de 10 ml remplie de PBS et une aiguille de 18 G pour expulser la moelle épinière en « arrachant » la moelle de la colonne lombaire à la colonne cervicale au-dessus d'un plat Petri.
    4. Soigneusement, placez la pointe bevée de l'aiguille à l'intérieur du foramen vertébral, en évitant la pression excessive pour empêcher l'aiguille d'intrusion dans le corps vertébral. Tenez fermement pour exercer une pression sur le corps vertébral et l'aiguille et appuyez sur le piston de seringue pour expulser le cordon. Transférer immédiatement la moelle épinière dans le tube étiqueté et le placer dans le bain de glace sèche.
  10. Répétez la procédure avec tous les animaux jusqu'à ce que la récolte soit terminée. Placez les outils de récolte dans l'éthanol à 70 % entre les animaux. Concentrez-vous sur la cohérence et la vitesse. La durée entre chaque récolte d'organes doit rester constante afin de ne pas biaiser les résultats de la titer virale.
  11. Une fois terminé, désinfecter l'armoire de biosécurité et tout le matériel avant de le retirer de l'établissement pour animaux.
  12. Retirez chaque tube du bain de glace et pesez les tubes pour déterminer le poids des organes. Pour déterminer le poids des organes, soustrayez le poids du tube vide du poids de l'organe contenant le tube.
    REMARQUE: À ce stade, les organes peuvent être congelés à -80 oC pour poursuivre le processus à une date ultérieure ou les organes peuvent être homogénéisés immédiatement avant de congeler des aliquots individuels. Le gel des échantillons de décongélation plusieurs fois diminue le titer viral. Par conséquent, il est important de faire la même procédure pour toutes les expériences au sein d'un seul projet.

2. Homogénéisation des organes

  1. Préparer 3 tubes étiquetés à capuchon rapide de 1,5 ml pour chaque organe à homogénéiser.
  2. Si les échantillons ne sont pas homogénéisés immédiatement après la récolte, retirer les tubes de -80 oC. Les échantillons n'ont pas besoin d'être décongelés pour homogénéiser.
  3. Mettre les échantillons sur la glace pour les garder au froid afin de minimiser la perte de titer virale. Ensuite, ajouter 1 ml de DMEM froid contenant 5% FBS à chaque organe contenant tube.
  4. Immédiatement battre les tubes dans le batteur de perles selon les instructions du fabricant. Homogériser tous les organes avec des perles d'acier dans un instrument d'homogénéisateur de perles. Vérifiez que chaque organe a été complètement homogénéisé.
  5. Faire baisser les débris d'organes dans un microfuge à 12 000 x g pendant 5 min dans un microfuge qui a été refroidi à 8 oC. Puis retournez les tubes dans le seau à glace. Dans l'armoire de biosécurité, aliquot échantillons dans des tubes pour les essais nécessaires. Puis retournez les tubes dans le seau à glace.
  6. Pour la mise au point formant l'essai, aliquot 500 l dans un tube étiqueté. Ensuite, placez les tubes dans la grille sur un seau à glace. Aliquot 50 l dans un tube pour l'ARN pour le quantitatif fluorogénique RT-PCR (qRT-PCR) pour mesurer le numéro de copie du génome viral.
  7. Isoler l'ARN total des organes des animaux infectés à l'aide d'une trousse commerciale d'isolement de l'ARN. Déterminer l'ARN viral flavivirus à l'aide de la sonde d'amorce définit spécifique pour ZIKV, qui reconnaît des séquences uniques dans chaque génome de flavivirus. Déterminer le numéro de copie virale à l'aide d'un plasmide de contrôle de copie contenant un ARN unique brin défini généré in vitro à l'aide de la polymérase T7 contenant les séquences cibles ZIKV.
  8. Aliquot l'échantillon restant, qui est d'environ 300 L, dans le troisième tube et stocker à -80 oC si nécessaire.
    REMARQUE: Si les échantillons n'étaient pas préalablement congelés, congeler à -80 oC. Si des échantillons avaient déjà été congelés, continuez sur la mise au point en formant l'analyse et/ou l'isolement de l'ARN avantde s'arrêter.

3. Zika Virus Focus Forming Assay26

REMARQUE: Il est important d'inclure un contrôle sans virus et un contrôle positif. Le contrôle positif est une série de dilution d'un stock de virus avec une concentration connue. Tous les contrôles n'ont pas besoin d'être sur la même plaque, mais comme l'assay devient plus grand que 5 plaques, plus de contrôles devraient être ajoutés, et répartis entre les plaques. Veillez à ne pas rayer la monocouche avec les pointes de pipet ou par lavage vigoureux. Plusieurs organes peuvent être titered le même jour ou sur des jours différents. Mais un organe individuel ne devrait pas être titered sur plusieurs jours parce que les conditions d'analyse différentes peuvent avoir un impact sur le titre viral. Il est fortement recommandé de faire fonctionner un organe individuel sur une seule journée.

  1. Avant le jour de l'action, préparez les cellules et les réactifs nécessaires à l'accent sur la formation d'un point de mire.
    1. Préparer un support de croissance contenant 500 ml de DMEM avec 5 ml de HEPES et 25 ml de FBS. Faire pousser les cellules de vero-Organisation mondiale de la santé (OMS) dans les médias de croissance à 37 oC, soit 5 % de CO2 avant le début de l'assidu. Les cellules Vero ne doivent pas être un passage élevé ou jamais grandi plus de 100% de confluence avant le début de l'assiduité.
    2. Préparer 500 ml d'une solution de méthylcellulose de 2 % en autoclantant une bouteille de 1 L en verre avec 10 g de méthylcellulose et une grande barre d'agitation et une bouteille de support en verre séparée de 1 L avec 500 ml de H2O. Si l'eau autoclaved a refroidi réchauffer au micro-ondes jusqu'à ce que la bouteille soit chaude au toucher, mais pas bouillante.
    3. Versez délicatement de l'eau chaude/chaude dans une bouteille de méthylcellulose dans le capuchon de culture tissulaire. Coflez partiellement la bouteille et remuer sur la plaque chauffante jusqu'à ce que la méthylcellulose soit en solution (1-4 h). Aliquot la solution de méthylcellulose de 2% en tube conique stérile de 50 ml. 2% De méthylcellulose peut être stockée à 4 oC jusqu'à ce que nécessaire.
    4. Préparer une solution de paraformaldéhyde de 5 % dans le PBS pour fixer les plaques et les stocker à 4 oC jusqu'à ce que nécessaire. Préparer un tampon de lavage d'assay de formation de mise au point 1x en ajoutant 0,05 % de Triton X-100 à PBS et stocké à RT. Préparer un tampon de coloration 1x FFA en ajoutant 1 mg/mL de saponine à PBS et stocké à 4 oC jusqu'à ce que nécessaire. Ceux-ci peuvent être préparés une à deux semaines à l'avance.
  2. Calculez le nombre de plaques de puits à fond plat de 96 nécessaires pour l'examen de telle sorte que chaque organe soit plaqué en triple. Inclure suffisamment de puits supplémentaires pour des contrôles positifs et négatifs.
    1. Cultivez suffisamment de cellules Vero dans les supports de croissance pour compléter l'exemple conçu. Trypsiniser les cellules Vero et les compter les resuspendre à 1,5 x 105 cellules par mL dans les médias de croissance. Plaquer les cellules Vero dans les 96 plaques à fond plat à 3,0 x 104 cellules Vero-OMS/bien dans les médias de croissance en ajoutant 200 L par puits.
    2. Incuber les plaques à 37oC à 5% de CO2 pendant la nuit, assurez-vous que les plaques sont de niveau dans l'incubateur afin que les cellules soient également réparties dans le puits.
      REMARQUE: Chaque laboratoire développe des cellules Vero légèrement différemment; la cible est un monocouche confluent de 90-95% dans chaque puits le jour de l'analyse pour le virus Zika.
  3. Diluer les échantillons du virus Zika le jour de l'analyse. Si les échantillons d'organes avaient déjà été homogénéisés, retirez les échantillons du congélateur de -80 oC et laissez-les décongeler avant de les placer sur la glace pour l'analyse.
    1. Sur la glace, préparer une plaque de puits de 96 degrés en l'ajout d'une plaque de puits de 180 l à la rangée B à H laissant la rangée A vide. Ajouter 150 l de chaque échantillon d'organe homogénéisé à la rangée A de la plaque inférieure ronde.
    2. Préparer des dilutions sérielles 10 de chaque échantillon, à l'aide d'une pipette multicanal. Diluer les échantillons dans une plaque de puits ronde de 96 en ajoutant 20 ll d'échantillon dans 180 l'un de la moyenne de croissance, en changeant les pointes de pipette entre chaque dilution.
  4. Préparer la plaque de formation de mise au point en enlevant le support de la plaque de puits à fond plat de 96 couvrant les cellules Vero. Faites-le immédiatement avant d'ajouter les échantillons de virus pour empêcher la monocouche de se dessécher.
    1. Ajouter 100 l de la dilution du virus à chaque puits dans la plaque Vero. Ajouter l'échantillon en utilisant le même ensemble de conseils en allant de la plus basse à la plus forte concentration. Plaques de roche côte à côte 2-4 fois en faisant attention de ne pas tourbillonner.
    2. Incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pour 1 à 2 h. Assurez-vous que les plaques sont à niveau dans l'incubateur. Pendant l'incubation réchauffer 2% de méthylcellulose à RT.
    3. Diluer la solution de méthylcellulose de 2% dans les médias de croissance. La dilution devrait être à un rapport d'environ 2:1 de 2% de méthylcellulose aux médias de croissance. Gardez à température ambiante jusqu'à ce qu'il soit temps de l'utiliser. Ajouter 1-2 gouttes/puits (mettre la tuyauterie à 125 l) de la méthylcellulose : support de croissance à chaque puits de la plaque de puits 96.
    4. Incuber 32-40 h à 37 oC, 5% CO2. Comme les cellules Vero de chacun se développent légèrement différemment et des facteurs tels que la confluence cellulaire et la souche du virus Zika peuvent changer le temps d'incubation.
  5. Fixez les cellules Vero à l'aide de la solution de paraformaldéhyde préparée à 5 %.
    1. Ajouter 50 lde de paraformaldéhyde de 5 % à chaque puits sur le dessus de la couche de méthylcellulose dans l'armoire de biosécurité. Incuber pendant 60 min à RT. La fixation peut aller toute la nuit à 4 oC, mais couvrir la plaque de parafilm pour réduire l'évaporation.
    2. Déchargez la superpose et les cellules dans un récipient d'élimination à l'intérieur de l'armoire de biosécurité. Laver délicatement avec du PBS, 150 l/puits. Retirer le PBS des plaques et retirer la plaque du BSL-2.
    3. Répéter le lavage PBS 2x en ajoutant 150 l/puits. Ensuite, retirez le PBS. Ajouter 150 l/puits 1x tampon de lavage FFA et laisser s'asseoir pendant 5-10 min à RT pour perméabilize les cellules fixes.
  6. Détecter l'infection à l'aide d'anticorps primaires contre le virus Zika. Préparer l'anticorps primaire 4G2 (D1-4G2-4-15) à une concentration de 1 mg/mL dans le tampon de coloration FFA. Préparez suffisamment d'anticorps pour l'ensemble de l'œil.
    REMARQUE: Éloignez-vous des couches de laboratoire ou d'autres matériaux absorbants à haute teneur en lints, car les fibres auront un impact négatif sur l'imagerie des foyers.
    1. Retirez le tampon de lavage FFA des plaques. Ajouter 50 l/puits de l'anticorps primaire dans le tampon de coloration FFA. Sceller les plaques avec du parafilm et incuber toute la nuit à 4 oC sur une plate-forme à bascule. L'analyse peut être faite avec une incubation de 2 h à RT.
  7. Visualisez l'infection par l'ajout d'un anticorps conjugué HRP secondaire. Préparer l'anticorps secondaire de chèvre anti-souris étiqueté HRP à une concentration de 1:5,000 dans le tampon de coloration FFA. Préparez suffisamment d'anticorps pour l'ensemble de l'œil.
    1. Laver les cellules 3x avec le tampon de lavage FFA, en enlevant le tampon de lavage en clignotant dans l'évier à chaque fois. Tainer les cellules avec l'anticorps secondaire dans le tampon de coloration FFA à 50 l/puits. Incubate 1-2 h à RT.
    2. Laver les cellules 3x avec le tampon de lavage FFA, en enlevant le tampon de lavage en clignotant dans l'évier à chaque fois. Ajouter 50 l/puits du Substrat Trueblue.
    3. Surveillez attentivement les plaques, en attendant 2-15 min jusqu'à ce que les taches soient entièrement définies et le fond minimal. Une fois les taches visibles, lavez-les doucement avec de l'eau, à l'aide d'une main pour protéger la monocouche de la force de l'eau courante. Appuyez à sec sur des essuie-tout (PAS DE COUCHES) et imagedès que possible.
    4. Les taches peuvent être comptées manuellement ou à l'aide d'un compteur spot automatisé. S'il est compté manuellement, une portée de dissection peut être utilisée pour faciliter la visualisation.
    5. Pour chaque échantillon, sélectionnez une dilution avec des foyers facilement distingués (p. ex., 20 à 200 par puits) et calculez le tatet dans les unités de formation de mise au point par mL (FFU/ml), en utilisant la moyenne des puits en double : FFU/mL (foci/well moyen) (facteur de dilution) (inoculum mL).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Évaluer les titers ZIKV à l'aide du protocole décrit ci-dessus Ifnar1-/- les souris ont été infectées par ZIKV (PRVABC59) par injection sous-cutanée (SC) sur le pied. Ici, l'administration de 1 x 105 FFU de ZIKV à 8-12 semaines Ifnar1-/- souris SC n'est pas mortelle, mais le virus peut se répliquer à la fois dans la périphérie et le SNC. Cette dose et cette voie sont utilisées pour étudier les réponses immunitaires et la pathogénicité de...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'infection par le ZIKV peut causer une maladie neurologique, c'est pourquoi les modèles animaux actuels pour étudier la pathogénie, les réponses immunitaires et l'efficacité protectrice des vaccins et des antiviraux doivent se concentrer sur la lutte virale au sein du SNC. L'un des défis en se concentrant sur la maladie du SNC est qu'elle se fait souvent au détriment de l'étude de l'infection périphérique. Les méthodes d'isolement des organes proposées ici mettent l'accent sur la nécessité d'évaluer rapidement l'infecti...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le Dr Pinto est financé par une subvention de démarrage de la Saint Louis University School of Medicine et des fonds de démarrage de l'École de médecine de l'Université Saint Louis. Le Dr Brien est financé par un prix K22AI104794 de l'INAID des NIH ainsi qu'une subvention de démarrage de l'École universitaire de Saint Louis. Pour toutes les personnes financées, les bailleurs de fonds n'avaient aucun rôle à jouer dans la conception des études, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-bromo-3-chloropropane (BCP)MRCBP151
Seringue de 10 ccThermo Fisher ScientificBD 309642
aiguille de 18 gThermo Fisher Scientific22-557-145
seringue de 1 cc TBThermo Fisher Scientific14-823-16H
seringue de 20 ccThermo Fisher Scientific05-561-66
Moulin à billes 24 tubesThermo Fisher Scientific15 340 163
Perles en acier inoxydable de 3,2 mmThermo Fisher ScientificNC9084634
37 ° ; C Incubateur de culture tissulaireNuair5800
4G2anticorps en maison
96 plaques à fond platbien plat MidsciTP92696
96 plaques à fond rondbien rond MidsciTP92697
Basix 1,5 mL tubes eppendorfThermo Fisher Scientific02-682-002
d’eau de Javel germicide concentrée30966CT
CTL S6 AnalyseurCTLCTL S6 Analyseur
Ciseaux de coupe incurvésOutils de science fine14061-11
Dulbecco' s Aigle modifié' s Glycémie moyenne à élevée Avec 4 500 mg/L de glucoseMilliporeSigmaD5671
Éthanol (qualité biologie moléculaire)MilliporeSigmae7023
Sérum fœtal bovinMilliporeSigmaF0926-500ML
PinceOutils de science fine11036-20
Acide acétique glacialMilliporeSigma537020
Chèvre anticorps anti-souris marqué HRPMilliporeSigma8924
HEPES 1 MMilliporeSigmaH3537-100ML
Isopropanol (biologie moléculaire)MilliporeSigmaI9516
Cocktail kétamine/xylazineMédecine
L-glutamineMilliporeSigmag7513
Magmax RNA kit de purificationThermo Fisher ScientificAM1830
MéthylcelluloseMilliporeSigmaM0512
MicrocentrifugeuseEpendorf5424R
MiniCollect 0,5 mL Tubes EDTABio-one450480
Tubes à joint toriqueThermo Fisher Scientific21-403-195
One step q RT-PCRmix Thermo Fisher Scientific4392938
ParaformaldéhydeThermo Fisher ScientificEMS- 15713-S
Phosphate Tamponné SalineSaline MilliporeSigmad8537-500ml
Pipettes multicanaux ProlineSartorius72230/72240
Pipettes monocanaux ProlineSartorius728230
Eau sans RNAse Thermo Fisher Scientific10-977-023
RNAzol BDMRC gèneRB192
Plate-forme à basculeThermo Fisher Scientific11-676-333
RPMI 1640FisherMT10040CV
SaponinMilliporeSigmas7900
Cuillère/spatuleOutils pour les sciences fines10090-17
Droit ciseaux coupantsFine Science Tools14060-11
Triton X-100MilliporeSigmat8787
True Blue SubstratVWR95059-168
TrypsinMilliporeSigmaT3924-100ML
gène Agrafesuniverselcomparative

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
  2. Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
  3. Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
  4. McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
  5. Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
  6. Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
  7. Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
  8. Brien, J. D. Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , Oregon Health & Science University. (2007).
  9. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
  10. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
  11. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  12. Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823(2010).
  13. Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230(2011).
  14. Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407(2011).
  15. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
  16. Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
  17. Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343(2013).
  18. Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
  19. Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
  20. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086(2014).
  21. Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
  22. Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
  23. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237(2018).
  24. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086(2014).
  25. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
  26. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237(2018).
  27. Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
  28. Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).

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