Construction de plasmides CRISPR et détection de l’efficacité des knockouts dans les cellules mammifères grâce à un système de double luciferase reporter

Résumé

Ici, nous présentons un protocole décrivant une méthode rationalisée pour la génération efficace de plasmides exprimant à la fois l’enzyme CRISPR et l’ARN guide unique associé (SGARN). La co-transfection des cellules mammifères avec ce vecteur sgRNA/CRISPR et un double vecteur de reporter luciferase qui examine la réparation de rupture à double brin permet d’évaluer l’efficacité des KNOCKOUT.

Résumé

Bien que très efficace, la modification d’un site génomique par l’enzyme CRISPR nécessite la génération d’un sgRNA unique au site cible(s) à l’avance. Ces travaux décrivent les étapes clés menant à la construction de vecteurs sgRNA efficaces à l’aide d’une stratégie qui permet la détection efficace des colonies positives par PCR avant le séquençage de l’ADN. Étant donné que l’édition efficace du génome à l’aide du système CRISPR nécessite un SGRNA hautement efficace, une présélection des cibles sgRNA candidats est nécessaire pour gagner du temps et des efforts. Un système double de journaliste de luciferase a été développé pour évaluer l’efficacité de KO en examinant la réparation de rupture de double brin par annealing simple brin. Ici, nous utilisons ce système de reporter pour ramasser la cible préférée xCas9/sgRNA à partir des vecteurs candidats sgRNA pour l’édition génétique spécifique. Le protocole décrit fournira un vecteur d’enzyme sgRNA/CRISPR préféré en 10 jours (en commençant par des oligonucléotides convenablement conçus).

Introduction

Les SGARN CRISPR comprennent une séquence de 20 nucléotides (le protospacer), qui est complémentaire à la séquence^{cible génomique 1,2}. Bien que très efficace, la capacité du système CRISPR/Cas à modifier un site génomique donné nécessite la génération d’un vecteur porteur d’un SGRNA efficace unique au site cible(s)². Cet article décrit les étapes clés de la génération de ce vecteur sgRNA.

Pour réussir l’édition du génome à l’aide du système CRISPR/Cas, l’utilisation de sgARN hautement efficaces est une condition préalable cruciale³

Protocole

1. conception d’oligonucléotide de sgRNA

1. Concevoir des sgARN à l’aide d’outils en ligne tels que l’outil en ligne Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). La séquence PAM est importante en fonction du Cas9 utilisé. Pour xCas9, les séquences PAM pertinentes sont NG et l’ancien outil en ligne Cas-Designer référé peut générer xCas9 sgRNAs pertinents.
   1. Utilisez des outils de conception sgRNA qui englobent des algorithmes pour la prédiction sur et hors cible (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)¹¹. Un score de 0,2 ou plus est préféré.
2. Sélectionnez jusqu’à 3 cibles ....

Résultats

Les méthodes décrites dans ce protocole sont pour la construction de vecteurs d’expression sgRNA et xCas9, puis pour le dépistage d’optimisation des oligos sgRNA avec des efficacités de ciblage génétique relativement plus élevées. Ici, nous affichons un exemple représentatif de 3 cibles sgRNA pour les moutons DKK2 exon 1. SgRNA et xCas9 exprimant des vecteurs peuvent être construits en prédigestant l’épine dorsale vectorielle (Figure 2) suivie par ligating dans une série de courts f.......

Discussion

Les procédures de clonage vectoriel sgRNA que nous avons décrites ici facilitent la production efficace de sgARN, avec la plupart des coûts dérivés de la commande d’oligonucléotide et du séquençage vectoriel. Alors que la méthode décrite est conçue pour permettre aux utilisateurs de générer des sgARN pour une utilisation avec CRISPR/Cas9, le protocole peut facilement être adapté pour une utilisation avec des orthologues Cas9 ou d’autres endonucleases guidés par l’ARN tels que Cpf1, introduisant des modifications mineures.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Une nouvelle génération d’instrument de PCR à gradient d’écran tactile LongGene		A200	Amplification du gène cible
Enzymes de restriction AscI	New England Biolabs	R0558V	Attaque des vecteurs cibles
Enzyme de restriction BbsI	New England Biolabs	R0539S	Coupe des vecteurs cibles
Établi propre	AIRTECH	SW-CJ-2FD/VS-1300L-U	Un dispositif de purification partielle sous la forme d’un flux laminaire vertical, qui crée un environnement local à air pur
élevé DH5&alpha ; Cellules compétentes	TaKaRa	K613	Transformation vectorielle plasmidique
Système d’essai Dual-Luciferas Reporter	Promega	E1910	Essai rapporteur Dual-luciferas Bain
d’eau thermostatique électrique	Sanfa Scientific Instruments	DK-S24	Réactif de chauffage par température constante dans le bain-marie
Électrophorèse	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	DYY-6C	Tension de commande, courant, etc.
Eppendorf Référence 2	Eppendorf China Ltd.	Référence 2	Dessiner et transférer avec précision des traces d’analyseur d’imagerie sur
gel	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	WD-9413B	Pour l’analyse d’images de gel d’électrophorèse
Luminomètre GloMax 20/20	Promega	E5311	Détection de l’activité de la luciférase double
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse	BMH	sigma 3K15	Extraction et purification des acides nucléiques
Incubateur biochimique intelligent	Sanfa Scientific Instruments	SHP-160	Fournir un environnement de température approprié pour l’expérience de digestion enzymatique
LB Broth Agar	Sangon Biotech	A507003-0250	Pour la culture d’E.coli
Lipofectamine 3000 Kit de réactifs de transfection	Thermo Fisher	L3000015	Transfection d’ADN
Enzymes de restriction SalI	New England Biolabs	R3138V	Couper les vecteurs cibles
SanPrep Colonne DNA Gel Kit d’extraction	Sangon Biotech	B518131-0050	Recyclage des fragments d’ADN
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit	Sangon Biotech	B518191-0100	Extraction de l’ADN plasmidique
T4 ADN Ligase	New England Biolabs	M0202V	Link Fragment d’ADN
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0	TaKaRa	9761	Purification de l’ADN
Vertical stérilisateur à vapeur sous pression	JIBIMED	LS-50LD	Haute température et autoclave pour tuer les bactéries, les champignons et autres micro-organismes dans l’équipement de laboratoire Thermostat
bain d’eau	Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.	SHZ-82	Laissez les bactéries continuer à trembler, ce qui est bon pour le contact avec l’air.

liquide à