Article de méthode

Un test de stabilité cible sensible à l'affinité semi-quantitative des médicaments (DARTS) pour étudier l'interaction Rapamycin/mTOR

DOI :

10.3791/59656

⸱

27 août 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, New York University Medical Center, 2Department of Cell Biology, New York University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, nous avons amélioré les capacités d'analyse de données de l'expérience DARTS en surveillant les changements dans la stabilité des protéines et en estimant l'affinité des interactions protéines-ligands. Les interactions peuvent être tracées en deux courbes : une courbe protéolytique et une courbe dose-dépendance. Nous avons utilisé l'interaction mTOR-rapamycine comme un cas exemplaire.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) est une méthode robuste pour la détection de nouvelles cibles protéiques à petites molécules. Il peut être utilisé pour vérifier les interactions molécules-protéines connues et pour trouver des cibles protéiques potentielles pour les produits naturels. Comparé à d'autres méthodes, DARTS utilise des molécules indigènes, non modifiées, petites et est simple et facile à utiliser. Dans cette étude, nous avons encore amélioré les capacités d'analyse de données de l'expérience DARTS en surveillant les changements dans la stabilité des protéines et en estimant l'affinité des interactions protéines-ligands. Les interactions protéines-ligands peuvent être tracées en deux courbes : une courbe protéolytique et une courbe dose-dépendance. Nous avons utilisé l'interaction mTOR-rapamycine comme un cas exemplaire pour l'établissement de notre protocole. De la courbe protéolytique nous avons vu que la protéolyse du mTOR par pronase a été inhibée par la présence de rapamycine. La courbe dose-dépendance nous a permis d'estimer l'affinité contraignante de la rapamycine et du mTOR. Cette méthode est susceptible d'être une méthode puissante et simple pour identifier avec précision les nouvelles protéines cibles et pour l'optimisation de l'engagement cible médicamenteux.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'identification des petites molécules cibles des protéines est essentielle à la compréhension mécaniste et au développement de médicaments thérapeutiques potentiels1,2,3. La chromatographie d'affinité, comme méthode classique pour identifier les protéines cibles des petites molécules, a donné de bons résultats4,5. Cependant, cette méthode a des limites, en ce que la modification chimique de petites molécules entraîne souvent une spécificité ou une affinité de liaison réduite ou altérée. Pour surmonter ces limitations, plusieurs nouvelles stratégies ont récemment été développées et appliquées pour identifier les cibles de petites molécules sans modification chimique des petites molécules. Ces méthodes directes pour l'identification ciblée des petites molécules sans étiquette comprennent la stabilité de la cible sensible à l'affinité médicamenteuses (DARTS)6, stabilité des protéines des taux d'oxydation (SPROX)7, analyse thermique cellulaire (CETSA)8 ,9, et profilage protéome thermique (TPP)10. Ces méthodes sont très avantageuses parce qu'elles utilisent de petites molécules naturelles et non modifiées et ne reposent que sur des interactions de liaison directes pour trouver des protéines cibles11.

Parmi ces nouvelles méthodes, DARTS est une méthodologie relativement simple qui peut facilement être adoptée par la plupart des laboratoires12,13. DARTS dépend du concept que les protéines ligand-liées démontrent la susceptibilité modifiée à la dégradation enzymatique par rapport aux protéines non liées. La nouvelle protéine cible peut être détectée par l'examen de la bande modifiée dans le gel SDS-PAGE par spectrométrie de masse de chromatographie liquide (LC-MS/MS). Cette approche a été mise en œuvre avec succès pour l'identification de cibles jusque-là inconnues de produits naturels et de médicaments14,15,16,17,18, 19. Il est également puissant comme moyen de filtrer ou de valider la liaison des composés à une protéine spécifique20,21. Dans cette étude, nous présentons une amélioration à l'expérience en surveillant les changements dans la stabilité des protéines avec de petites molécules et en identifiant les affinités de liaison protéine-ligand. Nous utilisons l'interaction mTOR-rapamycine comme exemple pour démontrer notre approche.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Recueillir et lyser les cellules

  1. Cultivez 293T cellules à l'aide du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal, 2 mM de glutamine et 1% d'antibiotiques. Incuber les cultures à 37 oC sous 5 % co2.
    REMARQUE : L'état de croissance des cellules peut affecter la stabilité des expériences ultérieures.
  2. Élargir les cellules en culture jusqu'à atteindre 80'u201290% confluence.
  3. Mélanger 345 l de réactif de lyse cellulaire (voir le tableau des matériaux)avec 25 l de cocktail inhibiteur de la protéase 20x, 25 oL de 1 M de fluorure de sodium, 50 oL de 100 mM de glycérophosphate, 50 oL de 50 mM de pyrophosphate de sodium et 5 l d'orthovanadate de sodium de 200 mL. Gardez le tampon de lyse au frais sur la glace.
    REMARQUE : D'autres tampons de lyse avec divers détergents (p. ex., Triton X-100 ou NP-40) peuvent être utilisés avec dARTS tant qu'ils ne dénaturent pas. Les protéines membranaires ou les protéines nucléaires peuvent être extraites en ajoutant 0,4 % de Triton X-100 ou 0,4 % de NP-40 au lysate cellulaire.
  4. Laver les cellules deux fois avec du salin tamponné par le phosphate froid (PBS).
  5. Utilisez un grattoir cellulaire pour recueillir les cellules dans une quantité appropriée de tampon de lyse cellulaire et transférer les cellules lysing dans un tube de 1,5 ml.
    REMARQUE : Le nombre de cellules nécessaires pour chaque expérience DARTS variera en fonction de la quantité de protéines pouvant être extraites de différentes lignées cellulaires. En général, la concentration en protéines du lysate utilisé se situe entre 4'u20126 'g/L. Une plaque de 10 cm de cellules 293T à 85'u201290% de confluence, lysée avec 300 'L de tampon de lyse se traduit généralement par un lysate avec une concentration de protéines de 5 'g/L.
  6. Mélanger bien les cellules tampon/lysing de lyse et incuber le tube sur la glace pendant 10 min.
  7. Centrifuger le tube à 18 000 g pour 10 min à 4 oC.
  8. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 ml et garder au frais sur la glace.
  9. Effectuez un bcA pour approximer la concentration protéique des lysates.

2. Incubate protéine lysates avec la petite molécule

  1. Diviser 99 l de lysates en deux tubes de 1,5 ml.
  2. Faire une concentration de stock de départ de 10 mM petite molécule. Lors de l'exécution de DARTS, on peut commencer par une concentration plus élevée de la petite molécule (5-u201210x la valeur EC50) pour assurer une liaison optimale.
    1. Ajouter soit 1 l de solvant que la petite molécule est soluble dans ou 1 l de solutions de stock de petites molécules à chaque aliquot de lysate. Incuber la cellule lysate avec les solutions pour 30'u201260 min à température ambiante avec secousses.
  3. Sur la glace, établir des dilutions en série (1:200, 1:400, 1:800 et 1:1600) de solution de pronase fraîchement décongelée dans 1x TNC (Pour 1 mL de tampon 10x TNC, mélanger 300 l d'eau ultrapure avec 100 l de chlorure de sodium de 5 M, 100 oL de chlorure de calcium 1 M , et 500 l de 1 M Tris-HCl, pH 8.0).
  4. Examiner une large gamme de rapports pronase:protein (p. ex., s'étendant de 1:100 à 1:2000) pour garantir l'observabilité de l'effet step-wise de la pronase sur les cibles.
    REMARQUE : Pour calculer les concentrations de pronase (exemple) : 5 concentrations de protéines de l'homme x 20 degrés L, 100 g de protéines. Pour un rapport pronase:protein de 1:100, nous avons besoin d'une solution de pronase de 0,5 g/L (100 g et 100 et 2 l). Cette expérience peut devoir être répétée plusieurs fois pour obtenir une gamme appropriée de rapports pronase:protein.

3. Effectuer une protéolyse

REMARQUE : Pour la protéolyse, les étapes sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire

  1. Après l'incubation avec la petite molécule, diviser chaque aliquot en 20 échantillons de L.
  2. Ajouter 2 L de la gamme de solutions pronase dans chaque échantillon à intervalles spécifiques (tous les 30 s). Utilisez un volume égal de tampon 1x TNC pour établir un échantillon de contrôle non digéré.
  3. Après 5'u201220 min, arrêter la digestion par l'ajout de 2 'L de froid 20x cocktail inhibiteur de protéase tous les 30 s. Bien mélanger et incuber sur la glace pendant 10 min.
  4. Diluer les échantillons avec le volume approprié de tampon de chargement SDS-PAGE de 5 x et faire bouillir à 95 oC pendant 5 min.
  5. Effectuer la partie suivante de l'expérience ou stocker l'échantillon de protéines à 80 oC.

4. Quantification et analyse

  1. Après DARTS, effectuer coomassie coloration bleue selon le protocole précédemment publié22.
  2. Les bandes de protéines tachées doivent être très claires après le destaining. Verser la solution de déstain utilisée et ajouter la solution fraîche d'acide acétique de 1 % pour couvrir le gel. Mettez le gel sous la lumière pour observer les bandes avec des différences significatives entre les groupes avec (groupe d'échantillon) ou sans (groupe témoin) la petite molécule.
  3. Couper les deux bandes correspondantes du gel avec un instrument stérile et effectuer LC-MS/MS immédiatement.
    REMARQUE : LC-MS/MS doit être fait dès que possible parce que les protéines dans le gel se dégradent continuellement.
  4. Digles les bandes, extraire les peptides et effectuer l'analyse LC-MS/MS23.
    1. Pour analyser les données LC-MS/MS, identifiez d'abord toutes les protéines de la bande. Deuxièmement, utiliser le spectre peptidique (PSM) pour représenter l'abondance de chaque protéine.
      REMARQUE : Les MSP fournissent le nombre total de séquences de peptides identifiées pour la protéine, y compris celles identifiées de façon redondante. En général, la fréquence à laquelle un peptide est identifié/séquencé peut être utilisée comme une estimation approximative de l'abondance de la protéine dans l'échantillon. Les protéines enrichies dans le groupe témoin sur le groupe témoin sont des protéines d'intérêt.
  5. Procurez-vous les anticorps primaires des protéines sélectionnées. Effectuer la tache occidentale pour vérifier que la petite molécule peut se lier directement aux protéines cibles potentielles24.
    1. Chargez des quantités égales de protéines dans les puits d'un gel SDS-PAGE de 8 %, ainsi qu'un marqueur de poids moléculaire approprié. Exécuter le gel pendant 30 min à 80 V, puis ajuster la tension à 120 V et continuer à fonctionner pendant 1'u20122 h.
  6. Quantifier les différentes bandes protéiques cibles à l'aide d'un logiciel de traitement et d'analyse d'images (voir le Tableau des matériaux).
  7. Analysez les données et dessinez les courbes.
    1. Détermination de la courbe protéolytique pour une protéine cible
      1. Le rapport pronase:protein est varié lors de la protéolyse. Normaliser les données de l'analyse d'images en attribuant à 100 % les valeurs d'intensité de la bande correspondant aux bandes non digérées.
      2. Utilisez l'analyse non linéaire de la régression de l'analyse statistique et du logiciel de dessin pour tracer une courbe de données normalisées pour l'intensité relative de la bande et les ratios pronase:protein.
      3. Tout d'abord, ouvrez le logiciel, sélectionnez le type de table et le graphique comme XY et autorisez 3 valeurs de repli dans les sous-colonnes côte à côte. Entrez ensuite les données correspondantes dans l'espace sous x et y. Sous x, entrez les nombres 0, 1, 2, 3, 4, 5 (en tant que détenteurs de place correspondant pronase:protein ratios).
      4. Dans la colonne y, entrez les données normalisées pour les intensités relatives de bande. Effectuer la « régression non linéaire » et implémenter une équation « Dose-response-Stimulation » à l'aide de l'équation « Log (agoniste) versus response—Variable slope (quatre paramètres) ».
      5. Convertir les annotations de l'axe X dans la courbe aux rapports pronase:protein correspondants.
    2. Détermination de la courbe dose-dépendance pour une protéine cible
      REMARQUE : Pour l'analyse dose-dépendance, la molarité de la petite molécule est différente d'un échantillon à l'autre. Le rapport stable pronase:protein devrait être informé par l'analyse des données de protéolyse. Le rapport pronase/protéine qui a montré la différence maximale dans l'intensité de protéine cible pendant la courbe protéolytique devrait être employé pour l'expérience dose-dépendance.
      1. Quantifier les différentes bandes protéiques cibles à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images. Comme dans la génération de la courbe dose-dépendance, normaliser les données de l'analyse d'image en attribuant les valeurs d'intensité de bande correspondant à la bande la moins digérée à 100%.
      2. Appliquer l'analyse de régression non linéaire dans le logiciel d'analyse statistique et de dessin aux données normalisées. Tout d'abord, ouvrez le logiciel, sélectionnez le type de table et de graphique comme XY, et entrez 3 valeurs de répétition dans les sous-colonnes côte à côte.
      3. Ensuite, entrez les données correspondantes dans l'espace ci-dessous x et y. Pour la variable «x», entrez différentes concentrations de la petite molécule; 'y' comprend les données normalisées correspondantes pour l'intensité relative de la bande.
      4. Transformez les valeurs x à l'aide de X et Log(X). Enfin, utilisez la régression non linéaire et mettez en œuvre une stimulation dose-réponse à l'aide de l'équation « Log (agoniste) versus response—Variable slope (quatre paramètres) ».

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le graphique de débit de l'expérience est décrit à la figure 1. Le résultat de la coloration bleue de Coomassie est montré dans la figure 2. L'incubation avec la petite molécule confère une protection contre la protéolyse. Trois bandes qui semblent être protégées par l'incubation avec de la rapamycine sur le contrôle du véhicule sont trouvées. Les résultats attendus de l'expérience de la courbe protéolytique sont présentés à la figure 3

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DARTS permet d'identifier les cibles de petites molécules en exploitant l'effet protecteur de la liaison protéique contre la dégradation. DARTS ne nécessite aucune modification chimique ou immobilisation de la petite molécule26. Cela permet d'utiliser de petites molécules pour déterminer leurs cibles protéiques de liaison directe. Les critères d'évaluation standard pour la méthode Classique DARTS incluent la coloration de gel, la spectrométrie de masse et le ballonnement occidental

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été soutenus en partie par les subventions de recherche des NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, et une subvention de recherche du MINISTÈRE W81XWH-16-1-0482.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cocktail d’inhibiteurs de protéase 100XSigma-AldrichP8340Dilué à 20X avec de l’eau ultrapure
Lignée cellulaire 293TATCCCRL-3216Milieu DMEM avec 10 % d’acide acétique FBS
Sigma-AldrichA6283
Kit de dosage des protéines BCAThermo Fisher23225
Chlorure de calciumSigma-AldrichC1016
Racleur cellulaireThermo Fisher179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Solution de colorationBio-Rad1610436
Dimethyl sulfofide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
GraphPadPrism GraphPad SoftwareVersion 6.0logiciel d’analyse statistique et de dessin
Acide chlorhydrique Sigma-AldrichH1758
ImageJVersion 1.52logiciel de traitement et d’analyse d’images
M-PER Réactif de lyse cellulaireThermo Fisher78501
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)CorningR21-040-CV
PronaseRochePRON-RO10 mg/ml
Chlorure de sodiumSigma-AldrichS7653
Fluorure de sodiumSigma-AldrichS7920
Orthovanadate de sodiumSigma-Aldrich450243
Pyrophosphate de sodiumSigma-Aldrich221368
base TrizmaSigma-AldrichT1503ajuster au pH 8,0
&bêta ;-glycérophosphateSigma-AldrichG9422
National Institutes of Health

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
  2. O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
  3. McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
  4. Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
  5. Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
  6. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
  7. Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
  8. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  9. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  10. Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784(2014).
  11. Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
  12. Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
  13. Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
  14. Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454(2018).
  15. Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438(2018).
  16. Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
  17. Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
  18. Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
  19. Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
  20. Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
  21. Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
  22. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  23. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  24. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
  25. Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
  26. Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
  27. Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
  28. Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Protein stabilityProteolytic curveDose dependence curvemTOR rapamycin interactionWestern blotBCA assayPronase digestionCell lysisSDS PAGE gel

Articles connexes