Article de méthode

Étude fonctionnelle In Vivo des variantes humaines rares associées à la maladie utilisant la drosophile

DOI :

10.3791/59658

⸱

20 août 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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L'objectif de ce protocole est de décrire la conception et la performance d'expériences in vivo dans Drosophila melanogaster pour évaluer les conséquences fonctionnelles des variantes génétiques rares associées aux maladies humaines.

Résumé

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Les progrès de la technologie de séquençage ont rendu les ensembles de données à génome entier et à l'exome entier plus accessibles pour le diagnostic clinique et la recherche de pointe en génétique humaine. Bien qu'un certain nombre d'algorithmes in silico aient été développés pour prédire la pathogénicité des variantes identifiées dans ces ensembles de données, les études fonctionnelles sont essentielles pour déterminer comment des variantes génomiques spécifiques affectent la fonction protéique, en particulier pour le mauvais sens Variantes. Dans le Réseau des maladies non diagnostiquées (UDN) et d'autres consortiums de recherche sur les maladies rares, des organismes modèles (MO), y compris Drosophila, C. elegans, le poisson zèbre et les souris sont activement utilisés pour évaluer la fonction de la maladie humaine putative causant des maladies Variantes. Ce protocole décrit une méthode pour l'évaluation fonctionnelle des variantes humaines rares utilisées dans le centre de dépistage des organismes modèles Drosophila Core de l'UDN. Le flux de travail commence par la collecte d'informations humaines et MO à partir de plusieurs bases de données publiques, en utilisant la ressource Web MARRVEL pour évaluer si la variante est susceptible de contribuer à l'état d'un patient ainsi que la conception d'expériences efficaces basées sur disponibles connaissances et ressources. Ensuite, des outils génétiques (p. ex., T2A-GAL4 et UAS-human cDNA lines) sont générés pour évaluer les fonctions des variantes d'intérêt dans Drosophila. Lors du développement de ces réactifs, des essais fonctionnels à deux volets basés sur des expériences de sauvetage et de surexpression peuvent être effectués pour évaluer la fonction de la variante. Dans la branche de sauvetage, les gènes de la mouche endogène sont « humanisés » en remplaçant le gène orthologue Drosophila par des transgènes humains de référence ou de variante. Dans la branche de surexpression, les protéines humaines de référence et de variante sont exogènes entraînées dans une variété de tissus. Dans les deux cas, tout phénotype évolutif (p. ex. létalité, morphologie des yeux, électrophysiologie) peut être utilisé comme lecture, quelle que soit la maladie d'intérêt. Les différences observées entre les alleles de référence et les alleles de variante suggèrent un effet variante-spécifique, et donc la pathogénie probable. Ce protocole permet des évaluations rapides et in vivo des variantes humaines présumées causant des maladies des gènes avec des fonctions connues et inconnues.

Introduction

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Les patients atteints de maladies rares subissent souvent un voyage ardu appelé « odyssée diagnostique » pour obtenir un diagnostic précis1. On pense que la plupart des maladies rares ont une forte origine génétique, ce qui rend les analyses génétiques/génomiques des éléments critiques de la prise de contrôle clinique. En plus du séquençage des panneaux génétiques candidats et de l'analyse de la variation des nombres de copies basée sur les microréseaux chromosomiques, les technologies de séquençage du génome entier (WGS) sont devenues des outils de plus en plus précieux au cours de la dernière décennie2, 3. À l'heure actuelle, le taux de diagnostic pour l'identification d'une variante pathogène connue dans WES et WGS est de 25 % (plus élevé dans les cas pédiatriques)4,5. Pour la plupart des cas qui restent non diagnostiqués après le WES/WGS clinique, un problème commun est qu'il y a beaucoup de gènes et de variantes de candidat. Le séquençage de nouvelle génération identifie souvent des variantes nouvelles ou ultra-rares dans de nombreux gènes, et il est difficile d'interpréter si ces variantes contribuent aux phénotypes de la maladie. Par exemple, bien que la plupart des mutations absurdes ou de changement d'image dans les gènes soient considérées comme des allèles de perte de fonction (LOF) en raison de la désintégration non-écrite de la transcription codée, les mutations tronquantes trouvées dans les derniers exons échappent à ce processus et peuvent fonctionner comme alleles bénins ou de gain de fonction (GOF)6.

En outre, prédire les effets d'un allèle de mauvais sens est une tâche intimidante, car il peut entraîner un certain nombre de scénarios génétiques différents comme décrit pour la première fois par Herman Muller dans les années 1930 (c.-à-d., amorphe, hypomorphe, hypermorphe, antimorphe, néomorphe, ou isomorphe)7 . De nombreux programmes et méthodologies silico ont été développés pour prédire la pathogénicité des variantes de mauvais sens basées sur la conservation évolutive, le type de changement d'acide aminé, la position dans un domaine fonctionnel, la fréquence d'allèle dans la population générale, et d'autres paramètres8. Cependant, ces programmes ne sont pas une solution complète pour résoudre le problème complexe de l'interprétation des variantes. Fait intéressant, une étude récente a démontré que cinq algorithmes de prédiction de la pathogène variante largement utilisés (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) s'accordent sur la pathogénicité 80 % du temps8 . Notamment, même lorsque tous les algorithmes sont d'accord, ils renvoient une prédiction erronée de la pathogénicité jusqu'à 11% du temps. Ceci mène non seulement à l'interprétation clinique défectueuse mais peut également dissuader des chercheurs de suivre vers le haut de nouvelles variantes en les énumérant faussement comme bénins. Une façon de compléter la limitation actuelle de la modélisation silico est de fournir des données expérimentales qui démontrent l'effet de la fonction de variante in vitro, ex vivo (par exemple, les cellules cultivées, les organoïdes), ou in vivo.

Les études fonctionnelles in vivo des variantes associées aux maladies rares dans MO ont des forces uniques13 et ont été adoptées par de nombreuses initiatives de recherche sur les maladies rares à travers le monde, y compris le Réseau des maladies non diagnostiquées (UDN) aux États-Unis et Rare Diseases Models and Mechanisms (RDMM) Networks in Canada, Japan, Europe, and Australia14. En plus de ces efforts coordonnés visant à intégrer les chercheurs de MO dans le flux de travail du diagnostic des maladies rares et des études mécanistes à l'échelle nationale, un certain nombre d'études individuelles en collaboration entre les chercheurs cliniques et les chercheurs de MO ont mené à la découverte et la caractérisation de nombreux nouveaux gènes et variantes pathogènes82,83,84.

Dans l'UDN, un centre centralisé de dépistage des organismes modèles (MOSC) reçoit des soumissions de gènes et de variantes candidats avec une description de l'état du patient et évalue si la variante est susceptible d'être pathogène à l'aide d'outils informatiques et in vivo Expériences. Dans la phase I (2015-2018) de l'UDN, le MOSC composé d'un drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] et Zebrafish Core (University of Oregon) qui a travaillé en collaboration pour évaluer les cas. En utilisant l'analyse informatique et un certain nombre de stratégies expérimentales différentes dans la drosophile et le poisson zèbre, le MOSC a jusqu'à présent contribué au diagnostic de 132 patients, l'identification de 31 nouveaux syndromes55, la découverte de plusieurs nouveaux humains gènes de la maladie (par exemple, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) et l'expansion phénotypique de la maladie connue (p. ex., CACNA1A21,ACOX122).

En plus des projets au sein de l'UDN, les chercheurs du MOSC Drosophila Core ont contribué à de nouvelles découvertes de gènes pathogènes en collaboration avec les Centers for Mendelian Genomics et d'autres initiatives (p. ex. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) en utilisant le même ensemble d'informatique et de génétique stratégies développées pour l'UDN. Compte tenu de l'importance des études de MO sur le diagnostic des maladies rares, le MOSC a été élargi pour inclure un noyau de C. elegans et un deuxième noyau de poisson zèbre (tous deux à l'Université de Washington à St. Louis) pour la phase II (2018-2022) de l'UDN.

Ce manuscrit décrit un protocole d'étude fonctionnel in vivo qui est activement utilisé dans le noyau d'ODN MOSC Drosophila pour déterminer si les variantes de mauvais sens ont des conséquences fonctionnelles sur la protéine d'intérêt à l'aide de mouches transgéniques qui expriment l'homme Protéines. L'objectif de ce protocole est d'aider les chercheurs de MO à travailler en collaboration avec des groupes de recherche clinique afin de fournir des preuves expérimentales qu'une variante candidate d'un gène d'intérêt a des conséquences fonctionnelles, facilitant ainsi le diagnostic clinique. Ce protocole est le plus utile dans un scénario dans lequel un chercheur de Drosophila est approché par un chercheur clinique qui a un patient rare de maladie avec une variante spécifique de candidat dans un gène d'intérêt.

Ce protocole peut être divisé en trois éléments : (1) la collecte d'informations pour évaluer la probabilité que la variante d'intérêt soit responsable du phénotype du patient et la faisabilité d'une étude fonctionnelle dans Drosophila, (2) la collecte d'outils génétiques existants et d'en établir de nouveaux, et (3) d'effectuer des études fonctionnelles in vivo. Le troisième élément peut en outre être subdivisé en deux sous-éléments en fonction de la façon dont la fonction d'une variante d'intérêt peut être évaluée (expérience de sauvetage ou stratégies basées sur la surexpression). Il est important de noter que ce protocole peut être adapté et optimisé à de nombreux scénarios en dehors de la recherche sur les maladies monogéniques rares (p. ex., maladies courantes, interactions gènes-environnement et écrans pharmacologiques/génétiques pour identifier des cibles thérapeutiques). La capacité de déterminer la fonctionnalité et la pathogénicité des variantes profitera non seulement au patient d'intérêt en fournissant un diagnostic moléculaire précis, mais aura également des impacts plus larges sur la recherche scientifique translationnelle et fondamentale.

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Protocole

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1. Collecte d'informations humaines et MO pour évaluer: Probabilité d'une variante de l'intérêt étant responsable des phénotypes de la maladie et la faisabilité des études fonctionnelles dans la drosophile

  1. Effectuer des recherches approfondies dans les bases de données et la littérature afin de déterminer si les gènes et les variantes d'intérêt spécifiques sont de bons candidats pour expliquer le phénotype du patient d'intérêt. Plus précisément, recueillir les informations suivantes.
    1. Évaluer si le gène d'intérêt a déjà été impliqué dans d'autres troubles génétiques (expansion phénotypique du gène de la maladie connue) ou s'il s'agit d'un gène candidat à la maladie entièrement nouveau [variante génétique d'une signification incertaine (GVUS)].
    2. Évaluer la fréquence allèle de la variante de l'intérêt pour la maladie ou contrôler les bases de données des populations.
    3. Évaluer s'il existe des variations de nombre de copies (VNC) qui incluent ce gène dans les bases de données des populations de la maladie ou la lutte contre la maladie.
    4. Évaluer ce que les gènes orthologues sont dans différentes espèces MO, y compris la souris, le poisson zèbre, Drosophila, C. elegans, et la levure, puis d'étudier plus avant les fonctions connues et les modèles d'expression de ces gènes orthologues.
    5. Évaluer si la variante d'intérêt est présente dans un domaine fonctionnel de la protéine et si l'acide aminé d'intérêt est conservé de façon évolutive.
      REMARQUE: Les réponses à ces cinq questions (étapes 1.1.1-1.1.5) peuvent être obtenues en accédant individuellement à un certain nombre de bases de données humaines et MO ou en utilisant la ressource Web MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant Exploration) (voir tableau 1 pour les ressources en ligne)30, qui est décrit en profondeur dans un article d'accompagnement31. Consultez la section des résultats représentatifs pour obtenir des exemples précis. Le site Web monarch Initiative32 et Gene2Function33 fournissent également des renseignements utiles.
  2. Recueillir des informations supplémentaires pour évaluer davantage si la variante est un bon candidat de la maladie à partir d'une fonction protéique et la structure point de vue.
    1. Évaluer si la variante d'intérêt est prévue pour être dommageable en fonction des algorithmes de prédiction silico.
      REMARQUE: De nombreux groupes de recherche ont mis au point des algorithmes de pathogénicité variable au cours des 15 dernières années, et certains sont également affichés dans les résultats de recherche MARRVEL. Des programmes plus récents, y compris les deux énumérés ci-dessous, combinent des algorithmes de rediction de pathogènes de variantes multiples et des approches d'apprentissage automatique pour générer un score de pathogénicité. Pour plus d'informations sur les algorithmes de prédiction desvariantes et leurs performances, consultez Ghosh et al.8 . (i) CADD (épuisement combiné dépendant de l'annotation) : outil d'annotation intégrative construit à partir de plus de 60 caractéristiques génomiques, qui fournit des scores pour les SNV humains ainsi que pour les insertions et suppressions courtes11. (ii) REVEL (rare exome variante apprenante d'ensemble) : combine plusieurs algorithmes de pathogénicité de variantes (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP et phastCons) pour fournir un score intégré pour toutes les variantes possibles de mauvais sens humain34.
    2. Déterminer si le gène humain/protéine d'intérêt ou ses orthologs MO ont été montrés pour interagir génétiquement ou physiquement avec des gènes/protéines précédemment liés aux maladies génétiques. Si c'est le cas, évaluez si le patient d'intérêt présente des phénotypes qui se chevauchent avec ces troubles.
      REMARQUE: Plusieurs outils ont été développés pour analyser les interactions génétiques et protéines-protéines basées sur des publications MO ainsi que la protéomique à grande échelle à partir de plusieurs écrans d'espèces. STRING (outil de recherche pour les cas récurrents de gènes voisins)35: base de données pour les interactions protéines-protéines connues et prédites. Il intègre des ensembles de données d'interaction génétique et de coexpression ainsi que des outils d'extraction de texte pour identifier les gènes et les protéines qui peuvent fonctionner ensemble dans une variété d'organismes. MIST (outil de recherche d'interaction moléculaire)36: une base de données qui intègre des données génétiques et d'interaction protéine-protéine des Mde génétiques de base (levure, C. elegans, Drosophila, poisson zèbre, grenouille, rat, souris) et des humains. La prévision des interactions déduites des gènes/protéines orthologues (interlogs) sont également affichées.
    3. Déterminer si la structure 3D de la protéine d'intérêt a été résolue ou modélisée. Si c'est le cas, déterminez où la variante de la carte d'intérêt par rapport aux domaines fonctionnels clés.
      REMARQUE: Les structures protéiques résolues par la cristallographie aux rayons X, la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la microscopie cryo-électronique peuvent être trouvées dans les bases de données publiques, y compris la PDB (banque de données protéiques) et EMDatabank37. Bien qu'il n'existe pas de base de données unique pour les structures protéiques prédites/modélisées, un certain nombre d'algorithmes (c.-à-d. SWISS-MODEL38, Modeller39, et Phyre240) sont disponibles pour les utilisateurs d'effectuer la modélisation des protéines.
  3. Communiquez avec les collaborateurs cliniques pour discuter de l'information recueillie à partir des analyses informatiques dans les sections 1.1-1.2. Si les collaborateurs cliniques estiment également que la variante et le gène d'intérêt sont de bons candidats pour expliquer les phénotypes observés chez le patient, passez à la section 2. S'il y a des questions spécifiques au sujet du génotype et du phénotype du patient, discutez-en avec les collaborateurs cliniques avant d'aller de l'avant.
    REMARQUE: Si l'on estime que la variante d'intérêt est peu susceptible d'expliquer le phénotype d'intérêt (p. ex., variante identique trouvée dans la population témoin à haute fréquence), discutez-en avec des collaborateurs cliniques pour déterminer si la variante est une bonne candidat, car il peut ne pas y avoir l'expertise appropriée pour interpréter les phénotypes cliniques.

2. Rassembler les outils génétiques existants et établir de nouveaux réactifs pour étudier une variante spécifique de l'intérêt

REMARQUE: Une fois que la variante d'intérêt a été déterminée comme un bon candidat pour poursuivre expérimentalement, rassembler ou générer des réactifs pour effectuer des études fonctionnelles in vivo. Pour les études fonctionnelles décrites dans ce protocole, certains réactifs clés de melanogaster de Drosophila sont nécessaires : 1) les souches transgéniques humaines réglées par séquence d'activation en amont qui portent la séquence de référence ou de variante, 2) une perte de fonction allele d'un gène de mouche d'intérêt, et 3) une ligne GAL4 qui peut être utilisée pour des expériences de sauvetage.

  1. Génération de uAS-human cDNA construit et mouches transgéniques
    1. Identifier et obtenir les constructions d'ADNc humain appropriées. De nombreux clones sont disponibles auprès du MGC (collection de gènes mammifères)43 et peuvent être achetés auprès de distributeurs sélectionnés. Pour les gènes qui sont alternativement épissés, vérifiez quel adNdain isoforme correspond à l'utilisation d'Ensembl ou refSeq.
      REMARQUE: De nombreux cDNA sont disponibles dans les réactifs compatibles du système de clonage recombinase-mediaed44, ce qui simplifie l'étape de subcloning. les cDNA peuvent être livrés dans un format « ouvert (sans codon d'arrêt) » ou « fermé (avec codon d'arrêt endogène ou artificiel) ». Bien que les clones ouverts permettent le marquage C'-tagging des protéines qui sont utiles pour biochimiques (par exemple, tache occidentale) et les cellules biologiques (par exemple, immunostaining) essais pour surveiller l'expression de la protéine d'intérêt, il peut interférer avec la fonction de protéine dans certains cas.
    2. Sous-cloner l'ADNc de référence et de variante dans le vecteur transgénique drosophila. Utilisez le système de transgenèse à médiation C31, car cela permet d'intégrer les cDNA de référence et de variante au même endroit dans le génome45. Pour ce projet, le MOSC Drosophila Core utilise régulièrement le vecteur pGW-HA.attB46.
      REMARQUE: Si l'ADNc humain se trouve dans des vecteurs compatibles avec le système de clonage médié par recombinase (p. ex., pDONR221, pENTR221), passez à la section 2.1.4, qui explique les réactions De LR pour subcloner les CDNA en pGW-HA.attB.
      1. Si l'ADNC humain n'est pas dans un système de clonage à médiation recombinase compatible plasmide, sublimer les cDNA humains dans un vecteur d'entrée de passerelle en utilisant des techniques biologiques moléculaires standard (un exemple de tel protocole est documenté ci-dessous).
        1. Effectuer un SURplomb PCR pour introduire attB1 et attB2 bras. L'apprêt avant devrait avoir la séquence attB1 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAGCAGGCTTCACC-3' suivi des 22 premiers nucléotides de l'ADNC cible. L'amorce inverse devrait avoir la séquence attB2 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3' suivi par le complément inverse des 25 derniers nucléotides de l'ADNc d'intérêt. Exclure le codon d'arrêt de l'ADNc, puis ajouter une étiquette C's'il est souhaité d'"ouvrir" un clone, ou ajouter un codon d'arrêt pour "fermer" un clone.
        2. Préparer un mélange PCR haute fidélité de 100 l l composé de 50 l de mix maître PCR haute fidélité, de 36 l d'eau distillée, de 5 L de chaque amorce avant et inversée énumérée à l'étape 2.1.2.1.1 dilué à 10 'M, et de 4 oL d'ADNc cible (150 ng/L).
        3. Effectuer PCR en utilisant le protocole de mutagénèse standard pour ajouter des bras attB1 et attB2 sur l'ADNc d'intérêt. Les conditions varient en fonction de la construction et des variantes d'intérêt.
        4. Isolez l'ADNc cible avec des bras homologiques ajoutés par électrophorèse de gel et extraction de gel. Créez 1% de gel agarose et effectuez l'électrophorèse en utilisant des méthodes standard. Accise la bande qui correspond à la taille de l'ADNc plus la longueur supplémentaire des bras homologiques. Extraire l'ADN du gel par les méthodes standard95. Des kits commerciaux d'extraction de gel sont disponibles auprès de plusieurs entreprises.
        5. Effectuer une réaction in vitro recombinase basée sur le protocole de clonage recombinase-négocié selon le système qui est utilisé.
        6. Transformez le mélange de réaction BP en cellules E. coli chimiquement compétentes. Les cellules compétentes peuvent être fabriquées à l'interne ou achetées auprès de fournisseurs commerciaux. Culture les cellules transformées pendant la nuit sur une plaque LB contenant des antibiotiques appropriés pour la sélection des colonies. Le lendemain, sélectionnez plusieurs colonies et cultivez-les dans des cultures liquides indépendantes du jour au lendemain.
        7. Isoler l'ADN des cultures du jour au lendemain grâce à la mini-préparation. Sanger séquence les clones positifs pour s'assurer que l'ADNc a la séquence correcte96. Maintenir les cellules des cultures qui sont positives pour la séquence désirée dans 25% de glycérol stocké à -80 oC.
    3. Effectuer la mutagénèse dirigée par le site pour introduire la variante d'intérêt dans le plasmide de la porte avec la référence humaine cDNA97. Un protocole détaillé pour cette méthode peut être trouvé dans le site Web du vendeur48,49. Valider la présence de la variante dans le plasmide muté via le séquençage de Sanger de l'ensemble du cadre de lecture ouverte (ORF) pour s'assurer qu'il n'y a pas de variantes supplémentaires introduites par cette étape de mutagénèse.
    4. Sublimer la référence et la variante des cDNA humains dans le plasmide des donneurs (plasmides de la passerelle avec des sites attL1 et attL2) dans le plasmide transgénique (p.p., p.g., pGW-HA.attB avec attR1 et attR2 sites) via une réaction llonase.
      REMARQUE: Il existe des vecteurs UAS C31 conçus pour le sous-clonage à base d'enzymes de restriction conventionnelle (p.p., pUAST.attB50) s'il est préférable de subcloner les CDNA humains par l'intermédiaire de méthodes d'enzymes de restriction.
    5. Sélectionnez les sites d'amarrage C31 pour intégrer les transgènes uAS-cDNA humain. Un certain nombre de sites d'amarrage ont été générés par plusieurs laboratoires et sont publiquement disponibles à partir des centres de stock50,52,53.
      REMARQUE: Puisqu'il est commode d'avoir le transgène humain sur un chromosome qui ne contient pas l'ortholog de mouche du gène d'intérêt, il est recommandé d'employer un deuxième site d'amarrage de chromosome [VK37 (stock de BDSC #24872] quand l'ortholog de mouche est sur le X , troisième, ou quatrième chromosomes, et utilisez un troisième site d'amarrage de chromosome [VK33 (stock de BDSC #24871] quand l'ortholog de mouche est sur le deuxième chromosome.
    6. Injecter uAS-humain cDNA construit dans les mouches exprimant l'intégrase C31 dans leur lignée germinale (par exemple, vas-C31, nos-C31).
      REMARQUE : La microinjection peut être effectuée en interne ou envoyée à des installations de base ou à des entités commerciales pour la transgenèse. Le protocole détaillé pour générer des mouches transgéniques peut être trouvé dans le chapitre51du livre cité.
    7. Établir des souches transgéniques stables des embryons injectés. Injecter 100 à 200 embryons par construction94. Un système de croisement représentatif pour une insertion de transgène dans un deuxième site d'amarrage chromosomique (VK37) est représenté dans la figure 1A. Consultez les livres cités54,55 pour l'information de base sur la génétique drosophila.
  2. Obtenir ou générer une ligne T2A-GAL4 qui facilite les essais fonctionnels basés sur le sauvetage (voir la figure 2 et la section 3.1).
    REMARQUE: Cette ligne servira à deux fins. Tout d'abord, la plupart des lignées T2A-GAL4 testées se comportent aussi fortes allèles LOF en fonctionnant comme un allèle de piège à gènes. Deuxièmement, les lignes T2A-GAL4 fonctionnent comme un pilote GAL4 qui permet l'expression de constructions UAS (p. ex. UAS-GFP, CDNA UAS-humain) en vertu des éléments de régulation endogènes du gène d'intérêt56,57 (figure 2A-C).
    1. Rechercher des collections d'actions publiques pour les lignes T2A-GAL4 disponibles, y compris le Drosophila Gene Disruption Project (GDP)58 dans lequel 1 000 lignes T2A-GAL4 ont été générées59. Ces souches sont actuellement disponibles à partir du Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) et sont consultables à la fois par le PIB et les sites Web BDSC.
    2. Si une ligne T2A-GAL4 pour le gène de mouche d'intérêt n'est pas disponible, vérifiez si une ligne de code intronic InMIC (cassette d'intégration médiéepar Minos)est disponible pour la conversion en une ligne T2A-GAL4 à l'aide d'échange de cassettes médiées par recombinase (RMCE )60 (Figure 2A).
      REMARQUE: RMCE permet de convertir des éléments MiMIC introniques entre deux exons codants en ligne T2A-GAL4 par microinjection d'une construction de donneur (un exemple de système de croisement est indiqué à la figure 1B)ou en série de croix, comme décrit en détail57,59.
    3. Si une ligne T2A-GAL4 n'est pas disponible et qu'il n'existe pas de codage intronic MiMIC approprié, explorez la possibilité de générer une ligne T2A-GAL4 via le système CRIMIC (cassette d'intégration à médiation CRISPR)59.
      REMARQUE: Cette méthodologie utilise le clivage d'ADN négocié par CRISPR et la réparation dirigée par l'homologie (HDR) pour intégrer une cassette miMIC-like dans un intron de codage dans un gène d'intérêt.
    4. Si le gène d'intérêt n'a pas un grand intron (150 pb) ou n'a pas d'introns, essayez de frapper dans un transgène GAL4 dans le gène de la mouche avec le système CRISPR/Cas9 en utilisant HDR comme décrit20,61,62.
      REMARQUE: Si la génération d'un allele t2A-GAL4 ou GAL4 est difficile, essayez d'effectuer des expériences de sauvetage à l'aide de ces alleles préexistants ou lignes RNAi et de pilotes GAL4 omniprésents ou spécifiques aux tissus tels que décrits92 (REF).

3. Exécution de l'analyse fonctionnelle de la variante humaine de l'intérêt In Vivo dans Drosophila

REMARQUE: Effectuer une analyse basée sur le sauvetage (section 3.1) ainsi que des études de surexpression (section 3.2) à l'aide des outils recueillis ou générés à la section 2 pour évaluer les conséquences de la variante de l'intérêt in vivo dans Drosophila. Envisagez d'utiliser les deux approches, puisque les deux sont complémentaires.

  1. Effectuer des analyses fonctionnelles au moyen d'expériences basées sur le sauvetage
    note: Expériences de sauvetage hétérologues enDrosophilal'utilisation de protéines humaines détermine si la fonction moléculaire des deux gènes orthologues a été conservée sur plus de 500 millions d'années d'évolution. Ils évaluent également la fonction de la variante dans le contexte de la protéine humaine63. Bien qu'une analyse systématique de centaines de paires de gènes n'ait pas été signalée, plusieurs dizaines de gènes humains et mammifères (p. ex., souris) sont en mesure de remplacer la fonction deDrosophilaGènes13.
    1. Dans l'approche basée sur le sauvetage, déterminez d'abord s'il y a des phénotypes évidents, évolutifs et reproductibles chez les mutants LOF dans l'ortholog de mouche avant d'évaluer les fonctions des variantes.
      REMARQUE: La littérature précédente sur le gène de la mouche est un bon endroit pour la mine de données d'abord, et il peut être trouvé à l'aide de bases de données, y compris FlyBase et PubMed. D'autres bases de données telles que MARRVEL, Monarch Initiative et Gene2Funcion sont également utiles pour recueillir ces informations.
    2. Effectuer une étude globale des phénotypes corsables chez les homozygotes et les hémizygous (allèle T2A-GAL4 sur un animal déficience chromosomique défini moléculairement, surtout si l'allèle T2A-GAL4 est la première mutation à être caractérisée pour un gène spécifique. Évaluer les phénotypes tels que la létalité, la stérilité, la longévité, la morphologie (p. ex., la taille et la morphologie de l'œil) et le comportement (p. ex., cour, vol, escalade et défauts de sensibilité au bang).
      REMARQUE: S'il n'y a pas de phénotypes majeurs identifiés à partir de cet écran primaire, des phénotypes plus subtils tels que les défauts neurologiques mesurés par des enregistrements électrophysiologiques peuvent être utilisés s'ils sont hautement reproductibles et spécifiques. À titre d'exemple, les études fonctionnelles à l'aide d'électrorétinogramme (ERG) sont décrites à l'étape 3.2.3. S'il n'y a pas de décelement de phénotype évolutif, passez à la section 3.2 et effectuez l'étude fonctionnelle basée sur la surexpression.
    3. Une fois qu'un phénotype scorable est identifié dans le mutant LOF mouche, testez si l'ADNc humain de référence peut remplacer la fonction de l'ortholog de mouche en essayant d'utiliser l'ADNc humain pour sauver la ligne de mouche mutante. L'analyse phénotypique à effectuer ici dépend des résultats de l'étape 3.1.2 et sera spécifique au gène étudié.
      REMARQUE: Si l'« humanisation » du gène de la mouche est réussie, il existe maintenant une plate-forme pour comparer l'efficacité du sauvetage pour la variante d'intérêt par rapport à la contrepartie de référence. Le sauvetage vu avec l'ADNc humain de référence n'a pas besoin d'être parfait. Le sauvetage partiel du phénotype mutant de mouche utilisant un cDNA humain fournit toujours un point de référence pour effectuer des études comparatives utilisant la souche humaine variable de cDNA.
    4. À l'aide du système d'analyse choisi à l'étape 3.1.2, comparez le sauvetage observé avec l'ADNc humain de référence au sauvetage observé avec la variante de l'ADNc humain pour déterminer si la variante de l'intérêt a des conséquences sur le gène d'intérêt.
      REMARQUE: Si la variante de l'ADNc humain fonctionne moins bien que l'allèle de référence, cela suggère que la variante d'intérêt est délétère pour la fonction protéique. Si la variante et la référence ne peuvent pas être fonctionnellement distinguées, alors 1) l'allèle peut être un isomorphe (une variante qui n'affecte pas la fonction protéique) ou 2) l'analyse n'est pas assez sensible pour détecter des différences subtiles.
    5. Si la variante s'acquiesce à un allèle délétère, alors évaluez plus en détail l'expression et la localisation intracellulaire des protéines de référence et de variante d'intérêt in vivo par l'intermédiaire de la tache occidentale, de la coloration d'immunofluorescence, ou d'autres méthodes93.
      REMARQUE: Si l'ADNc UAS-humain est généré à partir d'un clone ouvert dans un vecteur pGW-HA.attB, utilisez un anticorps anti-HA pour effectuer ces essais biochimiques et cellulaires. Si le clone d'origine est un clone fermé, testez si des anticorps commerciaux contre les protéines humaines peuvent être utilisés pour ces essais. Une différence dans les niveaux d'expression et la localisation intracellulaire peut révéler comment la variante de l'intérêt affecte la fonction protéique.
  2. Effectuer l'analyse fonctionnelle par le biais d'études sur expression
    REMARQUE: La surexpression ubiquitaire ou tissulaire des ADNC humaines chez des mouches de type sauvage peut fournir des renseignements complémentaires aux expériences de sauvetage discutées à la section 3.1. Bien que les essais basés sur le sauvetage soient principalement conçus pour détecter les variantes LOF (amorphiques, hypomophiques), les essais basés sur la surexpression peuvent également révéler des variantes de gain de fonction (GOF) qui sont plus difficiles à évaluer (hypermorphiques, antimorphes, néomorphes).
    1. Sélectionnez un ensemble de pilotes GAL4 pour surexprimer les cDNA humains d'intérêt. Un certain nombre de conducteurs GAL4 omniprésents et spécifiques aux tissus et aux stades sont disponibles dans les centres publics d'actions (p. ex., BDSC), dont certains sont plus fréquemment utilisés que d'autres. D'abord se concentrer sur les conducteurs omniprésents et les phénotypes facilement décorables (létalité, stérilité, phénotypes morphologiques), puis passer à des conducteurs spécifiques aux tissus et des phénotypes plus spécifiques.
      REMARQUE : Validez l'expression des pilotes GAL4 avec une ligne de journaliste (p. ex., UAS-GFP) pour confirmer les modèles d'expression avant utilisation dans les expériences.
    2. Exprimer la référence et la variante des CDNA humains en utilisant le même conducteur dans la même condition (p. ex., température) en croisant 3 à 5 femelles vierges de la ligne GAL4 (p. ex. ey-GAL4 pour l'expression du disque imaginaire pour les yeux) avec 3 à 5 mouches mâles des lignes uAS [p. ex., UAS-TBX2 (MD) ou UAS-TBX2(p.R.R305H) pour l'exemple indiqué à la section 4.2 dans une seule fiole.
      1. Transférer les croix tous les 2-3 jours pour avoir de nombreux animaux qui s'élit d'une seule croix.
    3. Examiner la progéniture et détecter les différences entre les souches de référence et les souches variables (p. ex., la morphologie des yeux) au microscope à dissection. Imagez les mouches à l'aide d'une caméra fixée à un microscope à dissection pour documenter le phénotype.
      REMARQUE: Si un phénotype n'est vu que dans la référence mais pas dans la ligne de variante, alors la variante peut être un allèle amorphe ou hypomorphe fort. Si le phénotype est vu dans les deux génotypes mais la référence cause un défaut plus fort, alors la variante peut être un allèle hypomorphique doux-à-faible. Si la référence ne montre pas un phénotype ou ne présente qu'un phénotype faible, mais la variante montre un défaut fort, alors la variante peut être un allèle GOF.
    4. Si un phénotype n'est pas observé dans des conditions de culture standard (RT ou à 25 oC), placez les croix à des températures différentes allant de 18 à 29 oC, puisque le système UAS/GAL4 est connu pour être sensible à la température64,65). Typiquement, l'expression des transgènes UAS est plus élevée à des températures plus élevées.
  3. Effectuer d'autres études fonctionnelles liées aux gènes et aux protéines d'intérêt.
    note: En plus d'examiner les défauts généraux, un système d'analyse peut être sélectionné pour sonder les fonctions moléculaires du gène et de la variante. Dans un exemple discuté dans les résultats représentatifs (TBX2cas), les enregistrements ERG ont été utilisés pour déterminer les effets de la variante sur la fonction photorécepteur, puisque le gène de mouche d'intérêt (bifid) avait fait l'objet d'études approfondies dans le contexte du développement du système visuel. Protocoles détaillés pour ERG enDrosophilapeuvent être trouvés comme précédemment publié66,67,68.
    1. Générer des mouches pour tester les défauts fonctionnels dans le système visuel. Croisez les femelles vierges de la ligne Rhodopsin e (Rh1)-GAL4 aux mâles avec référence ou variante UAS-humain cDNA transgenes pour exprimer les protéines humaines d'intérêt dans les photorécepteurs R1-R6.
      REMARQUE: Croisez 3-5 femelles vierges à 3-5 mouches mâles dans une seule fiole et transférez les croix tous les 2-3 jours pour avoir beaucoup d'animaux s'éfermant d'une seule croix. Toutes les croix doivent être conservées dans un incubateur réglé à la température expérimentale pour obtenir des résultats cohérents.
    2. Une fois que les mouches commencent à s'éfermer (à 25 oC, 10 jours après la mise en place de la croix initiale), recueillir la progéniture (Rh1-GAL4/ UAS-human cDNA/ ') dans des flacons frais et les remettre dans l'incubateur réglé à la température expérimentale pendant 3 jours supplémentaires pour que le système visuel mûrisse.
      REMARQUE: Bien qu'ERG puisse être effectué sur des mouches de 1 à 2 jours, les mouches nouvellement fermées peuvent avoir de grandes fluctuations dans leur signal ERG. S'il est souhaitable d'examiner un phénotype dépendant de l'âge, ces mouches peuvent être vieillies pendant plusieurs semaines tant qu'elles sont régulièrement (p. ex., tous les 5 jours) transférées dans une nouvelle fiole pour éviter de se noyer dans les aliments humides.
    3. Préparer les mouches à l'enregistrement ERG en anesthésiant d'abord les mouches à l'aide du CO2 ou en les plaçant dans une fiole sur la glace. Collez délicatement un côté de la mouche sur une lame de microscope en verre pour les immobiliser.
      REMARQUE: Les mouches de référence et de variante s'ils peuvent être collées sur une seule diapositive. Placez toutes les mouches dans environ la même orientation avec un œil étant accessible pour l'électrode d'enregistrement. Veillez à ne pas obtenir de la colle sur l'œil et de laisser le proboscis libre.
    4. Préparer l'enregistrement et les électrodes de référence. Placer un capillaire en verre de 1,2 mm dans un pulleur à aiguilles et activer. Casser le tube capillaire pour obtenir deux électrodes acffilées. Les électrodes qui en résultent doivent être creuses et avoir des diamètres finaux de 0,5 mm.
    5. Remplissez les capillaires d'une solution saline (100 mM NaCl), en vous assurant qu'il n'y a pas de bulles d'air. Faites glisser les capillaires de verre sur les électrodes de fil argenté (à la fois l'électrode d'enregistrement et l'électrode de référence, voir figure 4) et fixer les capillaires en place.
    6. Configurer le stimulateur et l'amplificateur. Une mise en place détaillée peut être trouvée dans Lauwers, et al.67. La mise en place de l'UDN Drosophila MOSC se compose d'équipements répertoriés dans la section matériaux.
      1. Définir l'amplificateur à 0,1 Hz filtre à haute passe, 300 Hz filtre à faible passage, et 100 gain.
      2. Définir le stimulateur à 1 s période, 500 ms largeur d'impulsion, 500 ms de retard d'impulsion, mode de course, et 7 Ampli.
      3. Préparer la source de lumière pour la photostimulation. Utilisez une source de lumière halogène pour activer les photorécepteurs de mouche.
      4. Préparer le logiciel d'enregistrement sur un ordinateur connecté à la configuration ERG. Créez un protocole de stimulation avec le modèle d'acquisition «événements de longueur fixe» et la durée de 20 s.
    7. Acclimater les mouches pour compléter l'obscurité avant d'initier les enregistrements ERG. Placez les mouches dans l'obscurité complète pendant au moins 10 minutes avant de commencer l'expérience.
      REMARQUE: Comme les mouches ne peuvent pas détecter la lumière rouge, utilisez une source de lumière rouge pendant la période d'accouturation sombre.
    8. Placez la glissière contenant les mouches sur l'appareil d'enregistrement et déplacez les micromanipulateurs transportant la référence et enregistrant les électrodes à un point proche de la mouche d'intérêt sur la glissière. Surveillez la pointe de l'électrode et placez soigneusement l'électrode de référence dans le thorax de la mouche (pénétrer la cuticule). Une fois que l'électrode de référence est insérée de façon stable, placez l'électrode d'enregistrement à la surface de l'œil.
      REMARQUE: La position exacte de cette électrode de référence n'a pas d'impact majeur sur le signal ERG. L'électrode d'enregistrement doit être placée à la surface de l'œil puisque l'ERG est un enregistrement potentiel sur le terrain plutôt qu'un enregistrement intracellulaire. La bonne quantité de pression appliquée à l'électrode d'enregistrement provoque une petite fossette sans pénétrer l'œil.
    9. Éteignez toutes les lumières pendant 3 min pour acclimater les mouches à l'environnement sombre.
    10. Configurez le logiciel d'enregistrement et commencez l'enregistrement du signal. Si vous utilisez une source de lumière halogène avec obturateur manuel, allumez la source de lumière avec l'obturateur fermé. Commencez à enregistrer le signal.
    11. Exposez les yeux de mouche à la lumière en ouvrant et fermant l'obturateur tous les 1 s pour la durée de 20 s d'une seule course.
      REMARQUE: L'on/off de la source de lumière halogène peut être contrôlé manuellement ou programmé pour devenir automatisé à l'aide d'une source de lumière LED blanche. Un ERG plus robuste et fiable peut être obtenu en utilisant une source de lumière halogène par rapport à une LED de lumière blanche, probablement due au spectre de lumière plus large émis par la source de lumière halogène.
    12. Enregistrez les ERG de toutes les mouches montées sur la glissière de verre. Effectuer des ERG à partir de 15 mouches par génotype par condition.
      REMARQUE: Certains paramètres qui peuvent être modifiés pour trouver une condition qui présente des différences solides entre les cDNDe de référence et les variantes peuvent inclure la température, l'âge ou les conditions environnementales (p. ex., élevée dans un cycle clair-obscurité ou une lumière/obscurité constante).
    13. Effectuer l'analyse des données : comparez les ERG à partir de la référence, de la variante et des contrôles pour déterminer s'il y a des différences. Évaluer les données de l'ERG pour les changements dans les transactions, la dépolorisation, les non-transitoires et la repolarisation69 (figure 4B).
      REMARQUE: La dépolarisation et la repolarisation reflètent l'activation et l'inactivation de la cascade de phototransduction dans les photorécepteurs, tandis que les sur-transitoires sont des mesures des activités des cellules post-synaptiques qui reçoivent des signaux de les photorécepteurs. L'amplitude diminuée et la cinétique altérée de la repolarisation sont souvent associées aux défauts avec la fonction et la santé de photorécepteur, alors que des défauts dans les sur- et hors-transitoires sont trouvés dans les mutants avec le développement, la fonction, ou l'entretien défectueux de synapse 70.
    14. Après identification des différences dans les phénotypes ERG avec surexpression de référence par rapport à la variante cDNA humaine, déterminer si ce phénotype électrophysiologique est associé à des défauts structurels et ultrastructuraldans les photorécepteurs et leur synapses en effectuant une analyse histologique et une microscopie électronique de transmission.
      REMARQUE: D'autres discussions sur l'interprétation des défauts de l'ERG et l'analyse structurale/ultrastructurale ont déjà été décrites69.

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Résultats

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Étude fonctionnelle de la variante de de novo Missense dans EBF3 liée aux phénotypes neurodéveloppementaux
Chez un homme de 7 ans présentant des phénotypes neurodéveloppementaux, y compris l'hypotonie, l'ataxie, le retard de développement global et le trouble de la parole expressif, les médecins et les généticiens humains du National Institutes of Health Undiagnosed Diseases Project (UDP) a identifié une variante de de novo missense (p.R.R163Q) dans EBF3 (Early B-Cell Factor 3

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Discussion

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Les études expérimentales utilisant le melanogaster de Drosophila fournissent un système d'ascompte robuste pour évaluer les conséquences des variantes humaines maladie-associées. Cela est dû à l'ampleur des connaissances et des divers outils génétiques qui ont été générés par de nombreux chercheurs dans le domaine de la mouche au cours du siècle dernier89. Tout comme tout autre système expérimental, cependant, il est important de reconnaître les mises en garde et les limites qui existent...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Nous remercions Jose Salazar, Julia Wang et karen Schulze pour la lecture critique du manuscrit. Nous reconnaissons les Drs Ning Liu et Xi Luo pour la caractérisation fonctionnelle des variantes TBX2 discutées ici. Le Centre de dépistage des organismes modèles du Réseau des maladies non diagnostiquées a reçu l'appui du National Institutes of Health (NIH) Common Fund (U54 NS093793). H. T. C. a également reçu l'appui des NIH[CNCDP-K12 et NINDS (1K12 NS098482)], de l'American Academy of Neurology (Neuroscience Research grant), burroughs Wellcome Fund (Career Award for Medical Scientists), Child Neurology Society et Child Neurology Foundation ( PERF Elterman), et le Prix pour l'indépendance anticipée du directeur des NIH (DP5 OD026426). M. F. W. a également reçu le soutien de la Fondation Simons (Prix SFARI : 368479). S. Y. a également reçu le soutien des NIH (R01 DC014932), de la Fondation Simons (Prix SFARI : 368479), de la Alzheimer's Association (New Investigator Research Grant : 15-364099), du Fonds familial Naman pour la recherche fondamentale et du Fonds de droit Caroline Wiess pour la recherche en Médecine moléculaire. La microscopie confocale au BCM est appuyée en partie par la subvention U54HD083092 des NIH au centre de neurovisualisation du Centre de recherche sur les déficiences intellectuelles et développementales (CRDI).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Drosophila Stocks pour la transgenèse UAS-ADNc humain
Souches d’injection pour la transgenèse (D. melanogaster)BDSC#24871Réactif spécifique : VK33 (3ème chromosome) Ligne d’injection
Souches d’injection pour la transgenèse (D. melanogaster)BDSC#24872Réactif spécifique : VK37 (2e chromosome) Ligne d’injection
ADN plasmidique
Vecteur de clonageThermo Fisher#12536-017Réactif spécifique : vecteur de transgenèse pDONR221
DrosophilaDon des Drs Johannes Bischof et Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS)Réactif spécifique : pGW-HA.attB
Kits et réactifs de biologie moléculaire
AgaroseSigma-Aldrich#A2790Réactif spécifique : Agarose (grade de biologie moléculaire)
Cellules chimiquement compétentes (E. coli)Thermo Fisher#18265017Réactif spécifique : DH5&alpha ;
Kit d’extraction de gel d’ADNThermo Fisher#K210012Réactif spécifique : Kit d’extraction de gel PureLink
Kit d’isolement et de purification de l’ADNQiagen#27104Réactif spécifique : QIAprep Spin Miniprep Kit Miniprep
Haute Fidélité PolyméraseNEB#M0491Réactif spécifique : Q5 Kit de polymérase
Système de clonage médié par recombinaseThermo Fisher#11789020Réactif spécifique : Gateway BP Clonase kit
clonase Système de clonage médié par recombinaseThermo Fisher#11791100Réactif spécifique : Gateway LR Clonase II Kit enzymatique
Kit de mutagenèse dirigéeAgilent#200523Réactif spécifique : Quick Change II Kit de mutagenèse
Electroretinogram Équipement associé au banc d’essai
ERG AnalysisDispositifs moléculairesN/ARéactif spécifique : Axon pCLAMP 10 Data Software
Package ERG Data CollectionLabX#R150358Réactif spécifique : ISO-DAM Amplificateur biologique isolé
Stimulateur ERGAstro-Med#S48Réactif spécifique : Stimulateur à impulsions carrées
de

Références

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