Une méthode enzymatique efficace pour l'isolement des cellules endothéliales aortiques primaires porcines (pAECs) des porcs miniatures est décrite. Les pAECs primaires isolés peuvent être employés pour étudier la réponse immunisée et de coagulation dans la xénotransplantation.
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Article de méthode
Isolement et culture des cellules endothéliales aortiques primaires des porcs miniatures
Dans cet article
Résumé
Résumé
La xénotransplantation est un moyen prometteur de résoudre la pénurie d'organes humains chez les patients atteints d'insuffisance d'organes en phase finale, et le porc est considéré comme une source d'organes appropriée. Le rejet immunitaire et la coagulation sont deux obstacles majeurs au succès de la xénotransplantation. Les dommages et le dysfonctionnement vasculaires de cellules endothéliales (EC) sont importants pour le développement des réponses d'inflammation et de coagulation dans la xénotransplantation. Ainsi, l'isolement des cellules endothéliales aortiques porcines (pAECs) est nécessaire pour étudier les réponses de rejet et de coagulation immunisées. Ici, nous avons développé une approche enzymatique simple pour l'isolement, la caractérisation et l'expansion des pAEC sépulifiés à partir de porcs miniatures. Tout d'abord, le cochon miniature a été anesthésié avec de la kétamine, et une longueur d'aorte a été excisée. Deuxièmement, la surface endothéliale de l'aorte a été exposée à une solution digestive de collagène IV de 0,005 % pendant 15 min. Troisièmement, la surface endothéliale de l'aorte a été grattée dans une seule direction avec un grattoir cellulaire (10 fois) et n'a pas été comprimée au cours du processus de raclement. Enfin, les pAECs isolés du jour 3, et après passage 1 et passage 2, ont été identifiés par cytométrie de flux avec un anticorps anti-CD31. Les pourcentages de cellules CD31-positives étaient de 97,4 % - 1,2 %, 94,4 % - 1,1 %, et 92,4 % - 1,7 % (moyenne et DD), respectivement. La concentration de Collagène IV, le temps digestif, la direction, la fréquence et l'intensité du raclage sont essentiels pour diminuer la contamination par le fibroblaste et obtenir une haute pureté et un grand nombre d'ECs. En conclusion, notre méthode enzymatique est une méthode très effctive pour isoler les ECs de l'aorte miniature de porc, et les cellules peuvent être étendues in vitro pour étudier les réponses immunitaires et de coagulation dans la xénotransplantation.
Introduction
La pénurie d'organes disponibles pour la transplantation est un problème en suspens dans le monde entier1. Selon la Croix-Rouge chinoise, seul un petit nombre de patients atteints d'insuffisance d'organes en phase finale ont reçu un organe approprié en Chine en 2018.
La xénotransplantation est un moyen prometteur de résoudre le problème de la pénurie d'organes. Les organes porcins sont considérés comme les organes les plus appropriés pour l'homme en raison de similitudes anatomiques et physiologiques2,3. L'échec d'un xénogreffe de porc est en grande partie lié au rejet immunitaire de primate et aux réponses de coagulation. Les cellules endothéliales porcines (EC) sont critiques puisque ces cellules sont les premières à interagir avec le système immunitaire des primates, qui comprend des anticorps, des compléments, des cytokines et des cellules immunitaires (p. ex. lymphocytes T, cellules B et macrophages)4,5. Les CE porcins jouent un rôle vital dans l'organe porcin et la xénotransplantation des îlots6,7. Ainsi, les EC sont des cellules importantes pour étudier les réponses de rejet et de coagulation à une greffe de porc. L'isolement des EC soudeurs porcins de haute qualité est nécessaire pour la recherche sur la xénotransplantation.
Dans les tentatives d'isoler les EC de différents organes (p. ex. cœur, rein, foie et aorte), plusieurs protocoles ont été signalés dans un cadre de xénotransplantation8,9,10,11,12. Cependant, le maintien d'une culture ultrapure d'ECs isolés est un problème exceptionnel dans les protocoles standard. La concentration accrue de la solution digérée, le temps de digestion inapproprié et l'intensité des éraflures peuvent contribuer à l'augmentation de la contamination par le fibroblaste dans les études actuelles8,10,13. En outre, la méthode des pAECs isolés de porcs miniatures est moins étudiée. Ici, nous décrivons une méthode enzymatique optimisée pour isoler les pAECs fortement purifiés des porcs miniatures (Wuzhishan ou Bama). Plusieurs étapes du protocole ont été conçues pour réduire la contamination par le fibroblaste et obtenir des EC de haute pureté.
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Protocole
L'utilisation d'animaux a été approuvée par le Comité d'examen de l'éthique du Shenzhen Second People's Hospital, conformément aux principes du bien-être animal.
1. Préparation des animaux, des milieuis et des tampons
- Préparer le cochon miniature.
REMARQUE : Tous les porcs miniatures étaient des porcs chinois de Wuzhishan ou de Bama (mâle). L'âge et le poids des porcs étaient de 100 jours, soit 8 jours et 5,7 kg et 1,0 kg (moyenne , SD, n - 3), respectivement. - Préparer le milieu de culture : milieu cellulaire endothélial (ECM) complété par 10 % (v/v) sérirum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS), 1 % (v/v) pénicilline/streptomycine (P/S) et 1 % (v/v) supplément de croissance des cellules endothéliales (ECGS).
- Préparer le tampon de lavage : 1x solution PBS (pH 7,4) avec 1 % (v/v) P/S.
- Préparer une solution digestive à 0,005% de collagène IV : 1 mg de poudre de collagène IV dans 20 ml de solution PBS. Préchauffer la solution digestive au collagène à 37 oC avant la digestion.
- Préparer le tampon d'arrêt : le milieu eagle modifié (DMEM) modifié de Dulbecco complété par 10 % de FBS inactivé par la chaleur et 1 % de P/S.
2. Chirurgie et préparation à l'isolement des cellules endothéliales aortiques porcines
- Désinfecter la salle d'opération avec de la lumière UV pendant 1 h et du désinfectant médical 84 liquide (la teneur en chlore disponible est de 4,0% - 5,0%, Tableau des matériaux)avant d'effectuer la chirurgie.
- Après que le porc miniature a reçu une injection intramusculaire formée par 15 mg/kg de kétamine, 15 mg/kg d'hydrochlorure de Xylazine et 0,05 mg/kg d'hydrochlorure de phénacétine ( Volumes : 100 l/kg, Tableau des matériaux) (Figure 1A), confirmer l'animal état de l'anesthésie avec contrôle du stimulus douloureux porcin (par exemple pincer une oreille ou secouer un membre antérieur) et l'index physiologique (par exemple, la pression artérielle, le rythme cardiaque et respiratoire).
REMARQUE : Une autre injection d'une demi-dose pourrait être administrée au porc si elle montre les signes de réveil. - Couper l'abdomen avec un scalpel, exposer le veau cava inférieur et par conséquent injecter de l'héparine sodium (5 000 U, Table of Materials) dans le veau cava inférieur avec une seringue de 5 ml.
- Cinq minutes plus tard, insérez un cathéter à l'aorte abdominale dans le sang, coupez la peau de la poitrine et incisez le diaphragme avec un scalpel et coupez ensuite le ventricule gauche.
REMARQUE : Assurez-vous que le porc est euthanasié en vérifiant le pouls aortique après le sang et la coupe du cœur. - Accise les côtes avec des forceps osseux (Table des Matériaux), et exposer le cœur et les poumons. Trouver l'aorte postérieure au cœur et les poumons et serrer les deux extrémités. Laver l'aorte une fois avec un tampon de lavage pré-réfrigéré (Figure 1B,C).
- Découper l'aorte avec des ciseaux et garder l'aorte serrée à chaque extrémité. Excisez l'excès de tissu autour de l'aorte avec des forceps stériles et des ciseaux. Mettre l'aorte dans un tube de centrifugeuse de 50 ml, laver l'aorte avec un tampon de lavage pré-refroidi 3x (30 ml par lavage), et transférer l'aorte au laboratoire (Figure 1D).
3. Isolement des cellules endothéliales aortiques porcines
- Dans des conditions aseptiques, retirer l'aorte de porc du tampon de lavage et le placer sur un plat Petri de 150 mm (figure 2A).
- Couper doucement les deux extrémités de l'aorte et exciser l'excès de tissu autour de l'aorte avec des forceps stériles et des ciseaux à nouveau (Figure 2B). Laver l'extérieur et l'intérieur de l'aorte (sur le plat de culture à température ambiante) avec 20 à 50 ml de tampon de lavage.
REMARQUE : Essayez seulement de couper la zone où les pinces ont été placées pendant la chirurgie puisque quelques ECs ont été endommagés dans ce secteur, et enlèvent les tissus excessifs et les branches latérales artérielles. - Passer une suture chirurgicale à travers l'aorte, puis attacher une extrémité de l'aorte en utilisant la suture chirurgicale (5-0, 90cm, Table des Matériaux). Gardez la suture chirurgicale à l'intérieur de l'aorte (Figure 2C,D).
- Fixer doucement l'aorte près de l'extrémité attachée avec des forceps, puis tirer la suture chirurgicale lentement pour inverser l'aorte jusqu'à ce que la surface endothéliale de l'aorte est exposée (Figure 2E-G).
REMARQUE: Assurez-vous de fixer l'aorte près de l'extrémité attachée et ne fixez pas l'aorte étroitement, ou bien l'aorte ne peut pas être inversée en tirant la suture chirurgicale. - Laver la surface endothéliale de l'aorte avec un tampon de lavage 3x (10 ml par lavage), puis jeter cette solution. Placer l'aorte dans un tube de centrifugeuse de 15 ml, et couvrir l'aorte de 10 ml de 0,005% collagène IV solution digestive dans le tube (Figure 2H).
REMARQUE : Réchauffez la solution digestive de 0,005% de collagène IV à 37 oC avant la digestion. - Incuber à 37 oC pendant 15 min. Placez l'aorte digérée et la solution digestive dans un plat de culture de 100 mm et arrêtez les effets de la collagène IV de 0,005 % en ajoutant 10 à 15 ml de tampon d'arrêt pré-réfrigéré.
REMARQUE : Le temps de digestion recommandé est compris entre 10 et 20 minutes. Assurez-vous que la surface endothéliale de l'aorte est recouverte par le tampon d'arrêt. - Gratter délicatement les pAEC s'éteignent de la surface intérieure de l'aorte à l'aide d'un grattoir cellulaire (Figure 2I). Laver l'aorte grattée 3x avec un tampon de lavage (5 ml par temps). Mettez la solution du plat de culture dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Laver le fond du plat de culture 2x avec un tampon de lavage (5 ml par temps), et mettre la solution dans un tube de centrifugeuse de 50 ml à nouveau.
REMARQUE : Grattez doucement dans une direction et ne comprimez pas. Ne touchez pas le tissu près des bords et des trous. Il est recommandé de gratter de 5 à 8x. - Centrifuger le tube à 600 x g pendant 6 min à 4 oC. Jeter le supernatant et laisser 10 ml de solution au fond d'un tube centrifugeur de 50 ml. Ajouter 20 ml de tampon de lavage au tube de centrifugeuse de 50 ml et suspendre à nouveau les granulés. Évitez les bulles pendant cette étape.
- Centrifugeuse à 600 x g pendant 6 min à 4 oC. Jetez lentement le supernatant. Resuspendre les granulés de cellules avec 1 ml de milieu de culture et bien mélanger.
REMARQUE : Le nombre moyen obtenu d'ECpar aorte de cm est de 1,9 x 105 x 1,4 x 104 (moyenne - SD, n - 3). - Comptez les cellules avec un compteur cellulaire. Plaque et culture des cellules dans un récipient sans revêtement de matériaux selon le numéro de cellule. Si le nombre de cellules est inférieur ou égal à 1,0 x 106, cellules de culture dans un flacon de 25 cm2. Si le nombre de cellules est supérieur à 1,0 x 106, cellules de culture dans plusieurs flacons de 25 cm2 (1,0 x 106 cellules par flacon). Placer le flacon dans un incubateur (sans secouer) à 37 oC avec 5 % de CO2 et remplacer le milieu tous les 2 à 3 jours.
REMARQUE : Certaines cellules sont endommagées par le grattoir cellulaire. Un analyse de viabilité cellulaire a révélé que le pourcentage de cellules vivantes était de 95,7 % et de 1,7 % (moyenne , DD, n et 3). Le temps de doublement des cellules isolées est d'environ 1/2 jours.
4. Récolte et caractérisation des cellules endothéliales pures
- Laissez les cellules se développer pendant environ 4 à 5 jours. Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence (Figure 3A), digèrent les cellules avec 0,25% de trypsine et de passage des cellules. Ensuite, collectez certaines des cellules isolées (Jour 3, Passage 1 et Passage 2) et identifiez par cytométrie de flux (avec un anticorps anti-CD31).
- Étiqueter les pAECs isolés (numéro cellulaire : 1 x 105) (Jour 3, Passage 1 et Passage 2) avec anticorps conjugués anti-porcc31-fluorescein isothiocyanate (FITC) (10 oL anticorps pour 100 cellules ll, tachés pendant 30 min à 4 oC) pour l'analyse de la cytométrie du débit.
- Population totale de cellules vivantes avec une parcelle dispersée vers l'avant, échantillon non taché comme un contrôle négatif. Ensuite, présentez les cellules positives CD31 des cellules fermées avec l'histogramme.
REMARQUE : L'efficacité des cellules cD31-positives est de 97,4 % - 1,2 % (Jour 3), 94,4 % - 1,1 % (P1) et 92,4 % - 1,7 % (P2) (moyenne et DP), respectivement (figure 3B).
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Résultats
Notre méthode vise à fournir un moyen efficace d'isoler les CE très purifiés des aortes des porcs miniatures. Le processus de la chirurgie de l'aorte est montré dans la figure 1. La première étape est que toute l'aorte est excisée du cochon. Il est très important de prévenir d'autres contaminations cellulaires ou bactériennes. Ainsi, ne pas blesser d'autres organes ou tissus au cas où des cellules ou des bactéries non ciblées contaminent l'aorte, et lavez l'aorte avec un tampon de lavage pré...
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Discussion
Les cellules endothéliales sont couramment utilisées dans la recherche sur le dysfonctionnement vasculaire, le diabète, la régénération des tissus, la transplantation et les cancers14,15,16,17,18. Pour comprendre et caractériser la biologie et la fonction des E dans ces maladies, de nombreuses méthodes d'isolement des CE de différents organes ou tissus malades...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Les travaux ont été soutenus par des subventions de la Natural Science Foundation of Guangdong Province, Numéro de subvention/prix: 2016A030313028; Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province, Grant/Award Number: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Numéro de subvention/prix: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160222204849975, GJHZ2017031417135556, JCYJ201604251030000011 et JCYJ2016042420420 Shenzhen Longhua District Foundation of Science and Technology, Numéro de subvention/prix: 2017013; National Key R-D Program of China, Grant/Award Number: 2017YFC1103704; Sanming Project of Medicine à Shenzhen, Numéro de subvention/prix: SZSM201412020; Fonds spéciaux pour la construction d'hôpitaux de haut niveau dans la province du Guangdong (2019); Fonds pour la construction de discipline médicale de haut niveau de Shenzhen, numéro de subvention/prix : 2016031638 ; Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission, Numéro de subvention/prix: SZXJ2017021 et SZXJ2018059. Nous remercions Hancheng Zhang et Zhicheng Zou de l'Université de Shenzhen d'avoir aidé à la préparation du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Pékin HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. Chine | HL-YGQ ; ; | |
| Seringue jetable BOON (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. Chine | ||
| CD31-FITC anticorps | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Grattoir cellulaire | Corning ; | 3010# | |
| Collagénase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Injection de kétamine composée ; | Usine pharmaceutique vétérinaire de Shenyang, Chine | Chlorhydrate de kétamine ?0.3g / 2ml, chlorhydrate de xylazine :0.3g / 2ml, chlorhydrate de phénacétine ?1mg / 2ml | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Microtube à capuchon encliquetable (1.5mL) ; | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Boîte de Culture Cellulaire | Corning | 353003# | |
| Sérum de Bovin Fœtal | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps ; | ShangHai medical instruments Co., Ltd.China | ||
| Heparine sodique | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co., Ltd.China | ||
| Teinture d’iode | Guilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama ou Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope ; | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Pénicilline/Streptomycine | Life Technologies | 15070063# | |
| Flacon de culture cellulaire rectangulaire à col incliné avec capuchon d’aération ? T25 ? | Corning ; | 3289# | |
| Ciseaux | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Pipettes de transfert sérologique (10ml) | JET Biofil | GSP010010# ; | |
| Pipette Pasteur stérile | GeneBrick | GY0025# | |
| Filtre de seringue stérile (0.22µ ; m) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Scalpel chirurgical | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Suture chirurgicale | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Seringue ?5mL ? | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75 % Alcool médical | Guilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China | ||
| 20 x solution PBS (pH 7.4, sans nucléase) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Désinfectant médical 84 liquide | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bouteille |
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Réimpressions et autorisations
