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Utilisation de la microscopie de force atomique pour mesurer les propriétés mécaniques et la pression turgor des cellules et des tissus végétaux

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DOI :

10.3791/59674

⸱

15 juillet 2019

 ,  , 
1SFR Biosciences, Université de Lyon, 2Laboratoire de Reproduction et Développement des Plantes, Université de Lyon, ENS de Lyon, UCBL, INRA, CNRS

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons la microscopie de force atomique (AFM), actionnée comme outil de nano- et de micro-indentation sur des cellules et des tissus. L'instrument permet l'acquisition simultanée de la topographie de surface 3D de l'échantillon et de ses propriétés mécaniques, y compris le modulus de la paroi cellulaire de Young ainsi que la pression de la turgor.

Résumé

Nous présentons ici l'utilisation de la microscopie de force atomique pour indenter les tissus végétaux et récupérer ses propriétés mécaniques. À l'aide de deux microscopes différents en mode d'indentation, nous montrons comment mesurer un modulus élastique et l'utilisons pour évaluer les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire. En outre, nous expliquons également comment évaluer la pression de turgor. Les principaux avantages de la microscopie par force atomique sont qu'elle est non invasive, relativement rapide (5 à 20 min), et que pratiquement n'importe quel type de tissu végétal vivant qui est superficiellement plat peut être analysé sans avoir besoin de traitement. La résolution peut être très bonne, en fonction de la taille de la pointe et du nombre de mesures par zone unitaire. Une limitation de cette méthode est qu'elle ne donne qu'un accès direct à la couche cellulaire superficielle.

Introduction

La microscopie par force atomique (AFM) appartient à la famille de la microscopie de la sonde de balayage (SPM), où une pointe avec un rayon de quelques nanomètres scanne habituellement la surface d'un échantillon. La détection d'une surface n'est pas réalisée par des méthodes optiques ou à base d'électrons, mais par les forces d'interaction entre la pointe et la surface de l'échantillon. Ainsi, cette technique ne se limite pas à la caractérisation topographique d'une surface d'échantillon (résolution 3D qui peut descendre à quelques nanomètres), mais permet également la mesure de tout type de forces d'interaction telles que l'électrostatique, van der Waals ou les forces de contact. En outre, la pointe peut être utilisée pour appliquer des forces à la surface d'un échantillon biologique et mesurer la déformation résultante, la soi-disant «indentation», afin de déterminer ses propriétés mécaniques (par exemple, le modulus de Young, les propriétés viscoélastiques).

Les propriétés mécaniques des parois cellulaires végétales sont essentielles pour être prises en compte lors de l'essai de comprendre les mécanismes sous-jacents aux processus de développement1,2,3. En effet, ces propriétés sont étroitement contrôlées au cours du développement, en particulier depuis l'adoucissement de la paroi cellulaire est nécessaire pour permettre aux cellules de se développer. L'AFM peut être utilisé pour mesurer ces propriétés et étudier la façon dont elles changent entre les organes, les tissus ou les stades de développement.

Dans cet article, nous décrivons comment nous utilisons l'AFM pour mesurer à la fois les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire et la pression de la turgor. Ces deux applications sont démontrées sur deux microscopes Différents De l'AFM et sont détaillées ici après.

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Protocole

1.Mesure des propriétés mécaniques de mur de cellules

REMARQUE: L'exemple du gynoecium en développement d'Arabidopsis est présenté.

  1. Préparation des échantillons biologiques
    1. Recueillir un bourgeon de fleur fermé au stade 9 à 10 (environ 0,5 mm de long) selon les étapes publiées détermination pour Arabidopsis4. Sous une jumelle, à l'aide d'une pince fine, ouvrez soigneusement le bourgeon pour vérifier le stade de développement et de recueillir le gynoecium situé au centre de la fleur.
    2. Mettre le gynoecium sur du ruban adhésif double placé au centre de la couverture d'un petit plat Petri (diamètre de 5 cm).
      REMARQUE: Comme alternative, la colle biocompatible peut également être employée pour une immobilisation plus efficace de l'échantillon lors de l'indentation.
    3. Ajouter rapidement de l'eau jusqu'à ce que l'échantillon soit complètement couvert. Cela évite la déshydratation et réduit l'adhérence de la pointe à l'échantillon. Alternativement, submergez l'échantillon dans le milieu liquide, telque la culture d'apex d'Arabidopsis 5.
  2. Calibrage De l'AFM
    1. Définir le ressort en porte-à-faux k constant assez élevé pour permettre la déformation de la surface de l'échantillon jusqu'à l'indentation désirée, mais pas trop élevé pour éviter une perte de sensibilité.
      REMARQUE: En règle générale, si le modulus de l'échantillon de Young est connu, l'ordre de grandeur de la constante printanière peut être choisi comme k'E ' , où ' est l'indentation désirée.
    2. Utilisez une pointe sphérique de 400 nm avec une distance de 15 m en porte-à-faux.
      REMARQUE: Le rayon de pointe est directement lié à la résolution latérale. En général, pour l'indentation sur les matériaux biologiques, choisissez des pointes arrondies (R supérieures à 10-20 nm) ou des sondes colloïdales. Les petites sondes colloïdales peuvent être difficiles à utiliser en raison de la petite distance entre l'extrémité de la pointe et le porte-à-faux qui peut toucher la surface de l'échantillon.
    3. Allumez le logiciel et placez la tête horizontalement au moins 2-3 h avant l'expérience : cela permettra à la tête de se thermiquer et évitera les mouvements relatifs en porte-à-faux induits thermiquement. Si le microscope est équipé d'un module CellHesion (extension de la plage de piézo Z disponible à 100 m au lieu de 15 m), allumez d'abord son contrôleur, puis sélectionnez le mode CellHesion lors du démarrage du logiciel.
    4. Montez le porte-à-faux sur le bloc de verre et montez le bloc sur la tête. Placez une gouttelette de quelques microlitres d'eau ultrapure sur la pointe pour éviter la formation de bulles d'air lorsque la pointe est trempée dans l'eau.
    5. Placer un échantillon dur (lame de verre nettoyé ou saphir) et ajouter 30-50 l d'eau ultrapure.
      REMARQUE: La procédure d'étalonnage décrite ici est l'étalonnage de contact parfois appelé. Tout d'abord, une courbe de force est faite sur une surface raide et plate, puis le spectre d'oscillation du porte-à-faux thermiquement excité est enregistré afin de calculer la constante du ressort. D'autres protocoles d'étalonnage existent et seront brièvement décrits dans le paragraphe de discussion.
    6. Placez la tête sur la scène (attention à soulever les moteurs Z assez haut). Utilisez l'image optique pour placer grossièrement le laser sur le porte-à-faux.
      1. Déplacez le laser le long de l'axe principal du porte-à-faux surveillant le signal de somme sur la photodiode.
        REMARQUE: Lorsque des cantilevers standard sont utilisés, une somme supérieure à 0,5 V doit être obtenue.
      2. Déplacez le laser dans l'autre direction et maximisez le signal de somme afin de positionner le laser au milieu du porte-à-faux. Cela permettra de minimiser le croisement entre la déviation latérale et verticale.
    7. Mesure de la sensibilité de déviation
      REMARQUE: La photodiode lit le déplacement laser et fournit un signal en volts. Afin de pouvoir mesurer la déviation dans l'unité métrique, la sensibilité de déviation doit être mesurée.
      1. Définir l'instrument dans la spectroscopie Contact et Force. Définir un point de position relatif à 2 V, z longueur à 0,5 m, et Étendre la vitesse à 2 m/s (taux d'échantillonnage à 10000 Hz) et sélectionnez Z boucle fermée.
      2. Ouvrez le gestionnaire de calibration et sélectionnez la partie de contact de la courbe de force (qui devrait être linéaire) pour faire un ajustement linéaire : l'inverse de la pente donne la sensibilité de déviation. La lecture de photodiode est maintenant calibrée en unité métrique.
    8. Détermination de la constante de printemps. Dans Calibration manager, sélectionnez Spring constant pour exécuter une acquisition de spectre thermique. Pour faire la moyenne du signal pendant une plus longue période, sélectionnez le symbole de l'a.m. Le spectre de puissance du porte-à-faux thermiquement excité peut montrer plusieurs crêtes ; dessiner une sélection autour de celle placée à la fréquence la plus basse pour l'adapter.
      REMARQUE: Si l'air thermique est effectué en liquide, le pic de résonance sera plus large et sa fréquence abaissée par rapport à nominale.
  3. Mise en place et acquisition d'expériences de spectroscopie de force
    1. Placez l'échantillon sur la scène AFM et placez la tête au-dessus de l'échantillon.
      REMARQUE: Assurez-vous que la tête a été suffisamment rétractée pour éviter un contact difficile entre la pointe et la surface de l'échantillon.
    2. Laisser le porte-à-faux thermiquer quelques minutes.
    3. En mode QI, approchez avec une force Setpoint de 50 nN.
    4. Définir une longueur Z de 4 m et une zone d'analyse à 80 x 80 m2 avec un nombre de pixels de 40 x 40. Dans le panneau de réglages d'imagerie avancée, configurez le mode à vitesse constante. Définir la vitesse d'extension et de rétractation à 200 m/s et les taux d'échantillonnage à 25 kHz.
    5. Commencez à numériser et utilisez cette analyse rapide à faible force pour vérifier si l'échantillon se déplace. Vérifier que la zone numérisée est exempte de débris ou de cellules déviées et localiser une région d'intérêt aussi plate que possible pour effectuer les mesures.
      REMARQUE: Afin d'apprécier l'inclinaison réelle de l'échantillon, le nivellement de la ligne doit être réglé sur OFF ou à Constant. Un angle d'inclinaison excessif entre l'axe d'indentation et la surface aura un effet sur le modulus mesuré de Young5.
    6. Une fois qu'une zone d'intérêt a été localisée, sélectionnez une région de 40 x 40 à 60 x 60 m2 autour d'elle et augmentez le nombre de pixels pour atteindre 2 pixels/m. Augmentez le point d'ensemble à 500 nm pour obtenir 100-200 nm d'indentation. Ajustez cette valeur, si nécessaire, au début de l'expérience. Diminuer la longueur de Z à 2 m. Diminuer la vitesse d'extension et de rétractation à 100 m/s et augmenter le taux d'échantillonnage à 50 kHz.
    7. Commencez à numériser et enregistrer la sortie (généralement composée par une image et un fichier de données).
    8. À la fin de la journée de mesure, retirez le support de la pointe et rincez-le délicatement avec de l'eau ultrapure et 70 % EtOH.
    9. Séchez et retirez le porte-à-faux. Pour d'autres expériences avec la même astuce, envisagez de le nettoyer avec un protocole de nettoyage humide et, si possible, un traitement plasmatique de suivi O 2. Ne laissez pas sécher l'eau sur le porte-en-faux et/ou le porte-bout pour éviter la cristallisation du sel.
  4. Analyse de données (pour la version logicielle de traitement de données 6.x)
    1. Logiciel de traitement de données ouvert et chargez le fichier de données.
    2. Cliquez sur Utilisez cette carte pour le bouton de traitement par lots afin d'utiliser les mêmes paramètres d'analyse sur toutes les courbes de la carte.
    3. Dans Le processus prédéfinide charge, sélectionnez Hertz fit.
    4. Utilisez le premier onglet pour vérifier ou modifier les paramètres d'étalonnage.
    5. Dans le deuxième onglet, retirez un décalage (ou un décalage plus une inclinaison) de la ligne de base pour définir sa valeur moyenne à 0.
    6. Dans le troisième onglet, estimez la position du point de contact (POC) en la considérant comme le premier point franchissant la force 0 en descendant de la valeur du point d'ensemble le long de la courbe d'extension.
    7. La position de pointe verticale de l'onglet calcule le mouvement de la pointe en soustrayant la déviation en porte-à-faux de la hauteur mesurée. À cette étape, utilisez la hauteur non lissée (données brutes) pour l'ajustement suivant, en cochant la case à cocher correspondante.
    8. Dans l'onglet Elasticity fit, sélectionnez le modèle d'ajustement approprié. Si aucune adhérence ou faible n'est visible sur les courbes rétractables (correspondant à moins de 10 % de la force de point d'ensemble ou à la force moyenne maximale à la profondeur d'indentation sélectionnée), le type de modèle doit être réglé sur Hertz/Sneddon et étendre la courbe doit être utilisé. En cas d'adhérence plus forte, le modèle DMT, qui signifie le modèle Derjaguin-Muller-Toporov, doit être préféré et adapté sur les courbes rétractables (se référer au manuel pour plus de détails sur les modèles de contact disponibles et les formules connexes).
      1. Définiz les paramètres géométriques de pointe basés sur la forme nominale de pointe. Ici, Tip Shape est sphère et Tip Radius est de 400 nm.
      2. Définir le Ratio du Poisson à 0,5 comme il est fait de façon conventionnelle pour le matériel biologique (correspondant à la matière incompressible).
    9. S'adapter à l'indentation spécifique. Par défaut, l'ajustement est effectué sur toute la courbe. Si l'ajustement doit être fait jusqu'à une indentation spécifique, vérifiez d'abord la case à cocher Shift Curve; cela modifiera l'origine de la courbe en fonction des valeurs de base et de POC nouvellement déterminées.
      1. Ajoutez une deuxième routine d'ajustement Elasticity en cliquant sur l'icône sur la fenêtre principale.
      2. Redéfinir tous les paramètres d'ajustement et spécifier en X min l'indentation souhaitée. Ajouter autant d'étapes que nécessaire (2 à 3 étapes devraient suffire) afin d'affiner la détermination de la position POC et, par la suite, la profondeur d'indentation calculée. Le processus peut être enregistré à ce stade.
    10. Cliquez sur Garder et appliquer à tous pour itérer les étapes précédentes sur toutes les courbes de la carte.
    11. Enregistrer les résultats. Une image et un fichier .tsv seront obtenus.

2. Mesure de la pression de Turgor

REMARQUE: Un exemple du meristem d'inflorescence oryzalin-traité d'Arabidopsis est présenté.

  1. Préparation de l'échantillon biologique
    1. Recueillir Arabidopsis inflorescence meristem (IM) traité avec le microtubule dépolymérisant oryzalin de plantlet in vitro cultivé sur le milieu contenant l'inhibiteur du transport d'auxine polaire 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) suivant la méthode publiée 6.
    2. Montage de l'échantillon de GI suivant l'une des deux options
      1. Pour la surveillance à long terme : monter l'échantillon dans un plat Petri contenant le milieu de culture d'apex d'Arabidopsis (ACM)7,8 et 0,1% mélange de conservation de plante (PPM), pour empêcher la contamination. Suspendre la pointe de messagerie instantanée au-dessus de la surface ACM et soutenir la base de la GI avec une baisse de 2% agarose.
      2. Pour la mesure avec des changements rapides de solution : montez l'échantillon dans un Petri-plat tenant un petit morceau de mastic adhésif, et scellez rapidement l'écart entre le mastic et la base d'échantillon avec la colle bio-compatible. Attendez que la colle se solidifie (moins de 2 min), puis immerger l'échantillon dans un ACM liquide contenant 0,1 % de PPM.
        REMARQUE: Assurez-vous que la surface de l'échantillon n'est pas recouverte d'agarose ou de colle lors de la fixation de la base de l'échantillon. La mesure AFM de la pression de turgor exige que l'échantillon soit monté de façon stable, et les méthodes de montage précédentes fournissent la stabilité acceptable. Selon l'échantillon, d'autres méthodes de montage peuvent être utilisées, comme le ruban à double face, la polylysine, etc.
  2. Calibrage De l'AFM
    1. Activez le logiciel d'acquisition AFM et choisissez le mode de mesure PeakForce QNM (grande amplitude).
    2. Effectuer l'étalonnage selon le même principe décrit dans les étapes 2.1 à 2.6.
    3. Dans la fenêtre Paramètres De contrôle, définiz la taille de l'analyse à 0. Dans la fenêtre Ramp, réglez la taille de la rampe entre 200 nm et 500 nm, seuil Trig entre 2 V et 5 V et Nombre d'échantillons jusqu'en 2048 ou plus.
    4. Alignez la pointe en porte-à-faux avec l'échantillon d'étalonnage et cliquez sur Approche.
    5. Au contact, allez à la fenêtre Ramp et cliquez sur le bouton Rampe continue. Sur le régime linéaire de la courbe, déterminez la pente en cliquant sur le bouton Sensibilité mise à jour. Répétez la mesure de sensibilité de déviation plusieurs fois et mettez à jour manuellement l'étalonnage avec la moyenne de mesure en ouvrant le détecteur d'onglet du menu Calibration.
    6. Retirez la tête de l'AFM et retirez l'échantillon d'étalonnage.
      REMARQUE: Il est suggéré de rétracter complètement la tête de l'AFM en choisissant l'onglet Étape - Initialize pour prévenir les contacts accidentels durs lors du changement d'échantillon.
  3. Mise en place et acquisition d'expériences de spectroscopie de force
    1. Si l'échantillon n'est pas encore submergé, immerger avec de l'ACM liquide contenant du PPM.
    2. Dans le logiciel d'acquisition, spécifiez les paramètres de mesure comme suit :
      1. Dans la fenêtre de paramètre Check, définiz la constante de ressort à la constante de ressort fabriquée du porte-à-faux ou la constante de ressort déterminée comme dans l'étape 2.8. Dans cet exemple, il est fixé à 42 N/m.
      2. Définir le rayon De pointe à 400 nm dans cet exemple.
      3. Définir le ratio de l'échantillon Poisson à 0,5, puisque l'eau contribue principalement à la pression de la turgor.
      4. Définir l'échantillon/ligne à 128 pour assurer une acquisition rapide.
      5. Définir le taux d'analyse à 0,2 Hz.
      6. Définir la taille de l'analyse à 1 m.
        REMARQUE: La fixation du taux d'analyse et de la petite taille de l'analyse peut effectivement prévenir les dommages causés par l'échantillon déclenché par l'analyse AFM. Il est recommandé de réduire ces deux paramètres lors de tout changement d'échantillon.
      7. Dans la fenêtre Ramp, définir la taille de la rampe à 5 m.
        REMARQUE: Il est mieux de réglage de la taille de la rampe plus grande que la profondeur d'indentation prévue pour une meilleure acquisition de base.
      8. Définir le seuil Trig au maximum.
      9. Définir le nombre d'échantillons à 4608.
      10. En option, dans l'onglet Paramètres Microscope et Engagement, réduisez les paramètres suivants pour éviter de forts dommages causés par le contact à l'échantillon. Définir peak Force Engage Setpoint à 0,3 V (par défaut 0,5 V). Définir le gain de L'int. engage à 0,5 (par défaut 0,75). Définir l'étape d'engagement SPM à 4 m (par défaut 15 m).
    3. Placez et alignez l'échantillon sous la tête de l'AFM et approchez-le jusqu'à ce que le porte-à-faux soit submergé, mais pas en contact avec la surface de l'échantillon.
      REMARQUE: En approchant, soufflez légèrement à la surface de l'ACM liquide jusqu'à ce qu'un pont liquide se forme entre le porte-à-faux et la surface liquide. Cela empêche généralement le contact dur.
    4. Avec soin, approchez-vous manuellement vers l'échantillon. Lorsque la sonde est relativement proche de la surface de l'échantillon, cliquez sur Approche.
    5. Au contact, augmentez graduellement la taille du scan et/ou le taux d'analyse jusqu'à l'équilibre souhaité sans endommager l'échantillon et/ou le porte-à-faux.
      REMARQUE: La taille de l'analyse est limitée par la courbure et la rugosité de la surface de l'échantillon. Dans le cas de la GI oryzalin-traitée, 50 x 50 'm2 zone d'analyse peut être atteint avec un taux d'analyse de 0,3 Hz.
    6. Lors de la numérisation, déterminez si la région de mesure est comme souhaité. Déplacez-vous si nécessaire. Une fois satisfait, cliquez sur le bouton Point et Tirez pour lancer le point et tirer fenêtre.
    7. Avant d'enregistrer l'analyse, choisissez un canal d'image approprié qui peut faciliter l'identification claire des contours des cellules. Souvent, l'erreur de force de pointe, DMT Modulus, LogDMT Modulus ou Dissipation est approprié. Spécifiez l'annuaire et le nom du fichier. Cliquez ensuite sur Ramp sur le scan suivant pour lancer l'enregistrement.
      REMARQUE: Une chaîne d'un point et trois numéros seront automatiquement ajoutés après votre nom de fichier désigné (comme .000). Ce nombre augmente automatiquement de 1 sur chaque répétition d'analyse enregistrée.
    8. Lorsque l'analyse est terminée, l'interface logicielle sera automatiquement redirigée vers la fenêtre Ramp. Cliquez sur l'image numérisée pour spécifier les positions à indent.
      REMARQUE: Avant d'enregistrer les indentations, il est préférable de choisir plusieurs repères pour effectuer des indentations de test en cliquant uniquementsur Ramp, au cas où l'alternance des paramètres serait nécessaire (pour la taille de la rampe, la position Piezo,etc.). La profondeur d'indentation doit être plus grande que l'épaisseur de la paroi cellulaire (idéalement déterminée séparément par microscopie électronique de transmission).
    9. Choisissez au moins trois sites d'indentation par cellule près de son barycenter, et répétez l'indentation trois fois par site. Cela donnerait au moins neuf courbes de force par cellule pour une analyse plus approfondie. Lorsque vous êtes satisfait du placement du site d'indentation, cliquez sur Ramp et capturez. Les courbes d'indentation de force sont automatiquement enregistrées dans l'annuaire désigné.
    10. Lorsque les rampes sont terminées, déplacez-vous vers une position différente pour la mesure des tuiles, ou rétractez la tête d'analyse et changez l'échantillon.
    11. Une fois terminé, nettoyez le porte-à-faux comme dans les étapes 1.3.8 et 1.3.9.
  4. Analyse des données
    1. Dans le logiciel d'analyse, ouvrez le fichier '.mca'. Cela montre la position de chaque courbe de force sur l'image numérisée. Si vous le souhaitez, présélectionnez les courbes de force pour l'analyse.
    2. Ouvrez une courbe de force à analyser, généralement dans le format de x0000y.00z, où x est le nom de fichier spécifié dans l'annuaire enregistrer tandis que y et z sont automatiquement enregistrés numéros indiquant séquence d'indentation et numéro d'analyse.
    3. Cliquez sur le bouton de correction de base et faites glisser les lignes bleues du tableau de bord sur la courbe de force jusqu'à ce que extend Source Baseline Start et Extend Source Baseline Stop soient respectivement de 0 % et 80 %. Cliquez sur Exécuter.
      REMARQUE: Alternativement, Extend Source Baseline Stop peut être réglé à différentes valeurs, tant qu'il est encore dans la ligne de base et non pas au-delà du point de contact.
    4. Cliquez sur le bouton Filtre Boxcar et cliquez sur Exécuter pour lisser la courbe de force.
    5. Cliquez sur le bouton Indentation.
      1. Dans la fenêtre entrée, définir la courbe active pour étendre.
      2. Définir la méthode Fit pour linéairer le modèle et inclure la force d'adhérence à Oui.
      3. Définir Max Force Fit Boundary à 99% et Min Force Fit Boundary à 75%.
      4. Définir le modèle Fit to Stiffness (Linéaire).
        REMARQUE: Cette configuration calculera la rigidité apparente k pour la déduction de pression de turgor. Dans cet exemple, les limites d'ajustement reflètent une rigidité d'environ 1,5 m de profondeur d'indentation.
    6. Les courbes de force peuvent être analysées par lots. Cliquez sur le bouton Historique d'exécution, spécifiez l'annuaire du rapport et ajoutez toutes les autres courbes de force qui nécessitent le même traitement. Une fois satisfait, cliquez sur Exécuter. Par défaut, l'ajustement sera stocké sous la forme d'un fichier .txt.
    7. Lorsque k est monté par lots, cliquez sur Historique 5 Indentation pour revenir à la fenêtre d'indentation.
      1. Changer la limite d'ajustement de force maximale à 10 % et la limite d'ajustement de force de Min à 0 %.
      2. Définir le modèle Fit à Hertzian (sphérique).
        REMARQUE: Ceci calculera le modulus E de la paroi cellulaire de Young pour la déduction de pression de turgor. Dans cet exemple, les limites d'ajustement reflètent un ajustement hertzien (à l'aide d'une sonde sphérique) d'environ 0,4 m de profondeur d'indentation.
    8. Répétez l'étape 2.4.6 pour l'ajustement de lot pour E.
    9. Ouvrez le fichier de 0,00z (z est le numéro d'analyse automatiquement enregistré) pour afficher les différents canaux d'analyse. Dans la fenêtre du canal Height, cliquez sur bouton Section. Cela permettra de mesurer la courbure de surface de l'échantillon qui est nécessaire pour la déduction de pression de turgor.
      1. Tracez une ligne à travers le long axe d'une cellule, déplacez les limites de la ligne de tableau de bord vers les bords cellulaires et enregistrez la valeur Radius r1. Répétez cette opération pour l'axe court pour récupérer le rayon r2. Calculer la courbure moyenne de la cellule -CourbureM et Gaussian -G en utilisant les deux mesures radii comme suit:
        figure-protocol-1etfigure-protocol-2 
    10. Déduire la pression de turgor P en utilisant le modèle à coquille mince publié9 comme suit:
      figure-protocol-3 
      avec
      figure-protocol-4
      où t est l'épaisseur de la paroi cellulaire déterminée par exemple la microscopie électronique.
      REMARQUE: La déduction de la pression de turgor est un processus approprié, où des itérations sont exigées. Quatre itérations sont généralement capables de reproduire un produit stable, mais plus d'itérations peuvent être faites (par exemple 100 fois).
    11. Calculer moyenne E, k et P par cellule. En outre, enregistrez la variabilité intracellulaire (p. ex., déviation type) pour la documentation.

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Résultats

La figure 1A et la figure 1B montrent une capture d'écran illustrant le résultat des étapes 1.3.4 à 1.3.6 du protocole, utilisées pour localiser une région d'intérêt où acquérir la carte QI. Il convient de mentionner que la région d'intérêt a été choisie afin de ne pas être sur une surface inclinée (c'est-à-dire aussi plate que possible). En fait, comme l'ont remarqué Routier et al.5, si l'axe d'indentatio...

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Discussion

L'émergence des formes dans les plantes est principalement déterminée par le taux coordonné et la direction de la croissance pendant le temps et l'espace. Les cellules végétales sont enfermées dans une paroi cellulaire rigide faite d'une matrice polysaccharidique, qui les colle ensemble. En conséquence, l'expansion cellulaire est contrôlée par l'équilibre entre la pression de turgor tirant sur la paroi cellulaire, et la rigidité de la paroi cellulaire résistant à cette pression. Afin de comprendre les mécanismes sous-jac...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous tenons à remercier l'équipe de PLATIM pour son soutien technique, ainsi qu'Arezki Boudaoud et les membres de l'équipe Biophysic du laboratoire RDP pour des discussions utiles.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
< fort > Croissance moyenne
1 000x solution mèreutilisée pour fabriquer de l’ACM, composition voir Stanislas et al., 2017. Ajouter à l’ACM après l’autoclavage, avant de verser.
Acide 1-N-Naphtylphtalamique (NPA)Sigma-Aldrich/Merck132-66-1ajouter au milieu Arabidopsis, 10 &mu ;M. Ajouter après l’autoclavage, avant de verser.
Agar-agarSigma-Aldrich/Merck9002-18-0ajouter au milieu Arabidopsis, 1 % p/v.
AgaroseMerck Millipore9012-36-6utilisé pour fabriquer des MCA solides, 0,8 % p/v.
Arabidopsis moyenDuchefa BiochimieDU0742.0025Pour culture in vitro d’arabidopsis, 11,82g/L.
Nitrate de calcium tétrahydratéSigma-Aldrich/Merck13477-34-4ajouter au milieu d’Arabidopsis, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUMDuchefa BiochimieM0221.0025Mélange de sels de base, utilisé pour la fabrication de l’ACM, 2,2 g/ L.
N6-benzyladénine (BAP)Sigma-Aldrich/Merck1214-39-7utilisé pour fabriquer de l’ACM, 555 nM. Ajouter à l’ACM après l’autoclavage, avant de verser.
OryzalinSigma-Aldrich/Merck19044-88-3pour le traitement de l’oryzaline, 10 &mu ; g/mL.
Mélange de préservation des plantes (PPM)cellules végétalesutilisée pour fabriquer de l’ACM, 0,1 % v/v. Ajouter à l’ACM après l’autoclavage, avant de verser.
Hydroxyde de potassiumDuchefa Biochimie1310-58-3utilisé pour fabriquer le milieu Arabidopsis et l’ACM, tous deux pH 5,8.
SaccharoseDuchefa Biochimie57-50-1utilisé pour fabriquer de l’ACM, 1 % p/v.
Outils pour AFM
BioScope Catalyst BioAFMBrukerL’AFM utilisé pour la mesure de la pression de turgescence dans ce protocole.
Nanowizard III + CellHesionJPK (Bruker)L’AFM utilisé pour mesurer les propriétés mécaniques.
PatafixUHUD1620
Référence structure élastitiqueNanoIdea2Z00026
Reprorubber-Thin PourFlexbar16135colle biocompatible.
Embouts AFM sphériquesNanoandmoreSD-SPHERE-NCH-S-10Embouts utilisés pour la mesure des propriétés mécaniques.
de vimatin Technologie de

Références

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