Utilisation de la fluorescence proche infrarouge et de la numérisation haute résolution pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs

Résumé

Ici, nous présentons un protocole qui utilise des colorants quasi-infrarouges en conjonction avec l’immunohistochimie et la numérisation à haute résolution pour les protéines de dosage dans les régions du cerveau.

Résumé

La neuroscience est l’étude de la façon dont les cellules du cerveau médient diverses fonctions. La mesure de l’expression des protéines dans les neurones et la Glia est essentielle pour l’étude des neurosciences car la fonction cellulaire est déterminée par la composition et l’activité des protéines cellulaires. Dans cet article, nous décrivons comment l’immunocytochimie peut être combinée avec l’analyse à haute résolution proche infrarouge pour fournir une mesure semi-quantitative de l’expression des protéines dans les régions cérébrales distinctes. Cette technique peut être utilisée pour une expression de protéine simple ou double dans la même région cérébrale. Les protéines de mesure de cette façon peuvent être utilisées pour obtenir un changement relatif dans l’expression des protéines avec une manipulation expérimentale, la signature moléculaire de l’apprentissage et de la mémoire, l’activité dans les voies moléculaires, et l’activité neuronale dans plusieurs régions cérébrales. En utilisant les bonnes protéines et l’analyse statistique, la connectivité fonctionnelle entre les régions cérébrales peut également être déterminée. Étant donné la facilité de mise en œuvre de l’immunocytochimie dans un laboratoire, l’utilisation de l’immunocytochimie avec un balayage à haute résolution à infrarouge proche peut élargir la capacité du neuroscientifique à examiner les processus neurobiologiques au niveau des systèmes.

Introduction

L’étude des neurosciences concerne une enquête sur la façon dont les cellules du cerveau médient les fonctions spécifiques¹. Ceux-ci peuvent être cellulaires dans la nature comme la façon dont les cellules gliales confèrent l’immunité dans le système nerveux central ou peuvent impliquer des expériences qui visent à expliquer comment l’activité des neurones dans l’hippocampe dorsal conduit à la navigation spatiale. Dans un sens large, la fonction cellulaire est déterminée par les protéines qui sont exprimées dans une cellule et l’activité de ces protéines². En conséquence, la mesure de l’expression et/ou de l’activité des....

Protocole

Le protocole suivant a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Delaware. Des rats mâles Sprague Dawley âgés de 55 à 75 jours environ ont été utilisés pour ce protocole.

1. extraction du cerveau et préparation tissulaire

1. Anesthésier le rat avec l’isoflurane dans la chambre d’induction d’anesthésie jusqu’à ce que le rat ne montre plus une réponse au pincement de pied.
2. Sacrifiez les rats par décapitation rapide à l’aide d’une guillotine.
3. Coupez la peau sur le crâne postérieur à antérieur et clair du haut du crâne.
4. Utilisez pinces-gouges p....

Résultats

Avant d’utiliser l’analyse à haute résolution pour l’immunohistochimie, il faut vérifier que le protocole fonctionne. Cela peut être accompli à l’aide d’un test de validation où les sections cérébrales du même animal sont incubées avec des anticorps primaires et secondaires, des anticorps secondaires seuls, ou ni des anticorps primaires ni secondaires. Les résultats d’un tel test de validation sont illustrés à la figure 2. Dans cette réaction, nous avons déte.......

Discussion

Les résultats présentés dans cet article montrent que la quasi-infrarouge immunocytochimie en combinaison avec la numérisation à haute résolution peut être utilisé pour obtenir des mesures semi-quantitatives de l’expression des protéines dans le tissu cérébral. Il peut également être utilisé pour étiqueter deux protéines simultanément dans la même région du cerveau. Nous avons déjà utilisé l’immunohistochimie près de l’infrarouge pour mesurer l’expression précoce immédiate des gènes dans plusieurs régions cérébrales

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Extraction
Chambre d’induction d’anesthésie	Kent Scientific	VetFlo-0530SM
Kleine Guillotine	Harvard Apparatus	73-1920
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14	utilisé pour enlever l’arrière du crâne
Ciseaux de dissection délicats	Fischer Scientific	08-951-5	utilisé pour couper vers le haut le long de la ligne médiane du crâne
Micro Spatule	Fischer Scientific	21-401-5	utilisé pour évider le cerveau
Lames de microscope en verre	Fischer Scientific	12-549-6
Réaction
; Triton X-100			Utilisé comme détergent doux pour perméabiliser les cellules après fixation dans le paraformaldéhyde, également utilisé comme détergent doux en combinaison avec le sérum de l’hôte et l’anticorps secondaire.
Tween-20			Utilisé comme une petite quantité de détergent ajoutée à TBS  ; pour produire TBS-T après le recouvrement des lames avec l’anticorps primaire
Scanner Licor Odyssey	Licor Biotechnology Inc.
Image Studio	Licor Biotechnology Inc.

cérébrale immunohistochimique