Article de méthode

Génération d'organoïdes tumoraux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés du cancer de la prostate

DOI :

10.3791/59710

⸱

13 juin 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology & Therapeutics, Roswell Park Comprehensive Cancer Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous montrons une méthode pour l'autopsie et la dissection des modèles de cancer de la prostate de souris, se concentrant sur la dissection de tumeur de prostate. Un protocole étape par étape pour la génération des organoïdes de tumeur de prostate de souris est également présenté.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les méthodes basées sur la recombinaison homologue pour modifier des gènes ont considérablement favorisé la recherche biologique. Les modèles de souris génétiquement modifiés (GEMM) sont une méthode rigoureuse pour étudier le développement et la maladie des mammifères. Notre laboratoire a développé plusieurs GEMMs du cancer de la prostate (PCa) qui manquent d'expression d'un ou plusieurs gènes suppresseurs de tumeur utilisant le système de recombinase de Cre-loxP site-spécifique et un promoteur prostate-spécifique. Dans cet article, nous décrivons notre méthode pour l'autopsie de ces GEMMs de PCa, se concentrant principalement sur la dissection des tumeurs de prostate de souris. De nouvelles méthodes développées au cours de la dernière décennie ont facilité la culture des cellules épithéliales pour modéliser les systèmes d'organes in vitro en trois dimensions. Nous détaillons également une méthode de culture cellulaire 3D pour produire des organoïdes de tumeur des GEMMs de PCa de souris. La recherche préclinique sur le cancer a été dominée par la culture cellulaire 2D et les modèles de xénogreffe dérivés de lignées cellulaires ou dérivés du patient. Ces méthodes manquent de microenvironnement tumoral, une limitation de l'utilisation de ces techniques dans les études précliniques. GemMs sont plus physiologiquement-pertinents pour comprendre la tumorigénèse et la progression du cancer. La culture organoïde de tumeur est un système in vitro de modèle qui récapitule l'architecture de tumeur et les caractéristiques de lignée cellulaire. En outre, les méthodes de culture cellulaire 3D permettent la croissance des cellules normales pour la comparaison aux cultures de cellules de tumeur, rarement possible utilisant des techniques de culture cellulaire 2D. En combinaison, l'utilisation des GEMM et de la culture cellulaire 3D dans les études précliniques a le potentiel d'améliorer notre compréhension de la biologie du cancer.

Introduction

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Depuis la fin des années 1980, la capacité de modifier les gènes par recombinaison homologue a grandement avancé l'étude des systèmes biologiques1. Les systèmes promoteurs inductibles, tissulaires ou cellulaires et les recombinases spécifiques au site, comme Cre-loxP, ont fait progresser les études génétiques en facilitant le contrôle des modifications génétiques tant temporellement que spatialement2,3, 4. La combinaison de ces stratégies génétiques a créé un large éventail de systèmes de modèles expérimentaux5,6,7.

Les modèles de souris génétiquement modifiés (GEMM) sont un outil intégral pour évaluer comment les gènes individuels ou les groupes de gènes affectent le développement et la maladie des mammifères. Dans la recherche préclinique sur le cancer, les GEMM sont la méthode la plus pertinente sur le plan physiologique et la plus rigoureuse pour étudier le développement, la progression et le traitement du cancer8. Notre laboratoire est spécialisé dans la génération et la caractérisation des GEMM cancéreux.

Le cancer non cutané le plus fortement diagnostiqué chez les hommes aux États-Unis est le cancer de la prostate (PCa). La majorité des patients atteints de PCa ont une maladie à faible risque et une forte probabilité de survie, mais les taux de survie diminuent considérablement lorsque la maladie est diagnostiquée à des stades avancés ou si l'hormonothérapie ciblée induit une progression vers une PCa agressive et non curable. sous-types9,10. Notre laboratoire a développé des GEMM qui utilisent des alleles floxed d'un ou plusieurs gènes suppresseurs de tumeur. La recombinaison et la perte de l'expression de gène de suppresseur de tumeur se produit spécifiquement dans la prostate parce que nous avons introduit un transgène avec Cre recombinase en aval du promoteur de probasin activé seulement dans les cellules épithéliales de prostate11, 12. Nous avons également élevé nos GEMMpour contenir un transgène Cre reporter appelé mT/mG, qui induit l'expression de protéines fluorescentes de tomate dans les cellules dépourvues d'expression de cre et de protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules avec Cre13. Tandis que la présentation de cette méthode et nos résultats représentatifs montrent GEMMs que nous étudions dans notre laboratoire, ce protocole peut être employé pour produire des organoïdes de cancer de la prostate à partir de n'importe quel modèle de souris. Cependant, comme discuté en détail dans notre section représentative de résultats, nous avons observé que certaines caractéristiques de tumeur sont optimales pour la génération d'organoïdes de cancer de la prostate.

Au cours de la dernière décennie, de nouvelles méthodes de culture des cellules à partir de tissus d'origine épithéliale ont conduit à des progrès significatifs dans notre capacité à modéliser les systèmes d'organes in vitro14,15. Le terme « culture cellulaire 3D » a été attribué aux techniques impliquées dans l'établissement et le maintien des organoïdes, qui peuvent généralement être définis comme des structures composées de cellules qui assemblent l'architecture secondaire entraînée par la lignée cellulaire spécifique à l'organe caractéristiques16. Ces nouvelles méthodes sont distinctes de la culture classique des cellules 2D en ce que les cellules ne nécessitent pas de transformation ou d'immortalisation pour la croissance à long terme; ainsi, les cultures 3D des cellules normales peuvent être comparées aux cellules malades. Ceci est particulièrement utile dans la recherche sur le cancer où les cultures normales de contrôle cellulaire n'ont généralement pas été disponibles. En outre, les organoïdes forment spontanément des architectures de tissus secondaires avec des types de cellules correctement différenciés, ce qui en fait un meilleur système modèle pour comprendre le cancer in vitro que les lignées cellulaires 2D17. Notre laboratoire a créé des lignes organoïdes 3D à partir de la question tumorale isolée de nos GEMM PCa pour compléter nos données in vivo et effectuer des expériences qui ne seraient pas réalisables dans les GEMM.

Dans cet article, nous présentons des protocoles écrits et visuels pour l'autopsie complète des GEMM de PCa, y compris la dissection des lobes distincts de prostate de souris et des lésions métastatiques. Nous décrivons et montrons une méthode étape par étape pour produire des organoïdes des tumeurs de prostate de souris basées sur un protocole précédemment édité par Drost et autres pour dériver des organoïdes du tissu épithélial normal de prostate de souris18.

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Protocole

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Les procédures animales décrites ici ont été effectuées avec l'approbation du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) au Département des ressources animales de laboratoire, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York.

REMARQUE: Les souris mâles à disséquer pour isoler les tumeurs de la prostate ou de la prostate pour la génération d'organoïdes devraient avoir au moins atteint l'âge de la maturité sexuelle - environ 8-10 semaines d'âge. L'âge spécifique des souris peut varier d'une étude à l'autre. Certains facteurs à considérer lors du choix de l'âge comprennent les changements dépendants de l'âge dans les populations de cellules de la prostate, l'expression dépendante de l'âge de transgènes Cre promoteur spécifique, et le taux de progression de la tumeur de la prostate dans un GEMM particulier.

1. Dissection et imagerie des tumeurs prostatetumor et métastatiques de souris

  1. Préparations
    1. Obtenir les outils de dissection stériles nécessaires. Zone de dissection d'étape sur la surface stérile propre avec une règle de 15 cm, équilibre de précision, équilibre analytique, bouteille de pulvérisation avec 70% d'éthanol, saline phospho-tamponné (PBS), et serviettes en papier.
    2. Préparation de solutions fixatives pour les organes et les os viscéraux qui ne seront pas utilisés pour la génération d'organoïdes
      1. Pour les organes viscéraux : Préparer 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans PBS. Pour une souris, faire 20 ml de 4 % de PFA, aliquot en deux tubes coniques de 15 ml et conserver à température ambiante jusqu'à utilisation.
      2. Pour les os longs : Aliquot 10 ml de formaline tamponnée neutre préfabriquée (NBF) dans un tube conique de 15 ml et conserver à température ambiante jusqu'à utilisation.
    3. Obtenir des plats non traités de 10 cm et remplir de PBS non stérile — ceux-ci serviront de récipients temporaires pour les organes pendant la dissection fine à l'aide d'un microscope de dissection.
      REMARQUE: Des outils stériles sont utilisés pour disséquer les tissus pour générer des organoïdes. Des outils non stériles sont utilisés pour l'incision initiale et la dissection des membres postérieurs.
  2. Euthanasie et incision initiale
    1. Euthanasier la souris par asphyxie au CO2 à l'aide d'un débit de 2,0 L/min pendant 5 min. Retirez la souris de la cage et effectuez une luxation cervicale. Utilisez l'équilibre de précision pour mesurer le poids corporel et l'enregistrement de la souris.
    2. Placez la souris sur un essuie-tout et dirigez-vous sur le côté ventral de la surface de dissection vers le haut avec la tête de la souris face à l'enquêteur. Affix la souris à la carte en étirant ses membres et en perçant chacun des pattes avant et pattes postérieures avec une aiguille jetable.
    3. À l'aide d'une bouteille de pulvérisation, arroser la fourrure de la souris avec 70 % d'éthanol. À l'aide de ciseaux de dissection non stériles et de forceps droits, pincez juste au-dessus du pénis de la souris et faites une petite incision à travers la fourrure seulement.
    4. Continuer l'incision midline jusqu'au cou de la souris à travers la fourrure seulement. Faire des incisions bilatérales à partir du point de l'incision initiale à travers le plan ventral de la souris à travers la fourrure seulement.
    5. Saisissez la fourrure et retirez-la soigneusement de la peau de la souris. Épinglez la fourrure sur la planche pour permettre l'accès aux cavités abdominales et thoraciques.
  3. Extraction du système urogénital masculin en bloc
    1. À l'aide de ciseaux de dissection stériles et de forceps droits, couper soigneusement la peau à environ 0,75 cm au-dessus du rectum. Continuer l'incision midline jusqu'à la cage thoracique sans déranger les organes de la cavité abdominale. Retirez soigneusement la peau et épinglez la planche pour exposer toute la cavité abdominale.
      REMARQUE: Ne laissez pas ces instruments toucher l'extérieur de la souris ou toute autre surface de la zone de transit, car ces tissus seront utilisés pour générer des organoïdes.
    2. Disséquer le système urogénital et d'autres organes selon le diagramme de la figure 1A, avec des nombres indiquant l'ordre que les organes seront retirés de la souris.
    3. Trouvez la vessie, puis saisissez le coussinet de graisse à gauche ou à droite et tirez vers le haut pour exposer le testicule. Disséquez soigneusement le testicule du reste de la région urogénitale et mettez de côté. Faites la même procédure de l'autre côté.
      REMARQUE: Atteindre la qualité optimale des tissus et la caractérisation détaillée des tumeurs de la prostate exige que toute la région urogénitale soit retirée de la souris en bloc19. Il est recommandé d'enlever d'abord la région urogénitale (figure 1A).
    4. Saisissez la vessie et tirez soigneusement vers le haut de sorte que la région urogénitale soulève ensemble, exposant l'urètre en dessous. Tout en tenant la vessie, orientez les ciseaux afin qu'ils soient contre le dessous de la prostate dorsale et coupez l'urètre. Toute la région urogénitale se libérera alors de la cavité abdominale.
    5. Mettre la région urogénitale dans un plat de 10 cm rempli de PBS. S'il est encore rempli d'urine, drainer la vessie en faisant une petite incision. À l'aide de l'équilibre analytique, peser le système urogénital et enregistrer.
  4. Extraction des ganglions lymphatiques pelviens, de la rate, du foie, des reins, des poumons, du tibia et du fémur
    1. L'élimination du système urogénital expose les ganglions lymphatiques pelviens, positionnés juste derrière le système urogénital (figure 1A) et de chaque côté de la colonne vertébrale. Les ganglions lymphatiques ne seront visibles que s'ils contiennent des lésions métastatiques ou s'il y a une inflammation locale. Orientez les forceps droits sous le ganglion lymphatique et tirez vers le haut pour enlever le ganglion lymphatique. Faites la même procédure de l'autre côté.
    2. Saisir le rectum avec les forceps droits et couper. Tirez sur le rectum pour démêler l'ensemble du côlon et de l'intestin grêle, à la recherche de lésions métastatiques dans les ganglions lymphatiques mésentériques. Lorsque l'on enlève tout l'iléum, continuez à tirer sur le duodénum pour exposer l'estomac. Couper l'œsophage pour enlever complètement l'estomac et jeter. Si des lésions métastatiques dans les ganglions lymphatiques sont observées, disséquez soigneusement loin de l'intestin et entreposez-les dans un plat de 10 cm de PBS.
    3. L'exposition et l'enlèvement de l'estomac tireront la rate du côté dorsal de l'abdomen (figure 1A). Retirez la rate et placez-la dans 4 % de PFA. La rate sert de contrôle de coloration pour l'hémotoxylin car elle est très cellulaire.
      REMARQUE: Les tissus viscéraux qui ne seront pas utilisés pour la production d'organoïdes seront fixés du jour au lendemain dans un PFA de 4 %, lavés au PBS, puis placés dans 70 % d'éthanol.
    4. Enlever le foie dans la partie supérieure de l'abdomen (Figure 1A). Basé sur la charge métastatique dans le foie, les lobes individuels peuvent être disséqués, ou le foie entier peut être enlevé en coupant soigneusement le long du diaphragme. (Ne pas couper à travers le diaphragme pour le moment). Placer le foie dans un plat de 10 cm de PBS.
    5. Enlever le foie exposera complètement les reins de chaque côté de la colonne vertébrale (Figure 1A). Enlever les reins — ainsi que les ganglions lymphatiques rénaux, si les ganglions ont des lésions métastatiques — en plaçant les forceps droits sous le rein et en tirant vers le haut. Faites la même procédure pour l'autre côté.
    6. Pour exposer la cavité thoracique, couper soigneusement le diaphragme le long de la cage thoracique. Percer le diaphragme libérera la pression négative dans la cavité thoracique et exposera le cœur et les poumons (Figure 1A).
    7. Saisir le sternum et tirer vers le haut pour ouvrir la cavité thoracique plus loin. Observez le visage ventral de la cavité thoracique le long de la cage thoracique pour les lésions métastatiques dans les ganglions lymphatiques thoraciques et disséquer, s'il est présent.
    8. Tout en tenant le sternum, couper la cage thoracique ventrale pour accéder au cœur et aux poumons. Saisissez le cœur, tirez vers le haut et coupez sous les poumons. Pour enlever complètement le cœur et les poumons en bloc, couper tous les vaisseaux sanguins antérieurs et la trachée. Placez le tissu dans PBS et retirez soigneusement le coeur sans endommager le tissu pulmonaire ou les lésions métastatiques de poumon.
    9. Prenez les forceps droits non stériles et disséquez les ciseaux et coupez la patte arrière à la tête du fémur. Saisissez soigneusement le fémur et retirez la patte postérieure de la fourrure.
    10. Placez la patte postérieure sur un essuie-tout et saisissez la patte postérieure. Utilisez la lame de rasoir à bord unique pour éliminer tous les muscles et les tissus conjonctifs du tibia et du fémur. Retirer le fémur du tibia en coupant postérieuràà à la rotule et enlever le tibia en enlevant la patte postérieure. Placez le tibia et le fémur dans 10% NBF. Faites la même procédure de l'autre côté.
      REMARQUE: Aux fins de l'examen des longs os de la souris pour les lésions métastatiques, le péroné n'a pas besoin d'être intact. Les os longs seront fixés en 10% NBF pendant une semaine, puis décalcifiés à l'aide de la solution EDTA neutre20. Après trois semaines, les os seront transférés à 70% d'éthanol.
    11. Après avoir enlevé les membres postérieurs, prendre une oreille ou une coupe de la queue pour le génotypage futur. Jeter la carcasse de la souris et tous les tissus à ne pas fixer ou utilisés pour la génération d'organoïdes.
  5. Dissection de tumeur de prostate
    REMARQUE: La dissection des lobes de la prostate de la souris ne peut être réalisée qu'à l'aide d'un microscope disséquant19. Cependant, la charge de tumeur de prostate peut être si haute que les lobes individuels ne peuvent pas être distingués, et la dissection peut être effectuée sans microscope. Néanmoins, le protocole complet pour la dissection des lobes de prostate individuels est décrit ci-dessous.
    1. Placez la région urogénitale dans un plat de 10 cm de PBS sous un microscope disséquant et orientez le côté ventral vers le haut avec la vessie et les vésicules séminales faisant face à l'investigateur. Toute manipulation de la région urogénitale doit être faite à l'aide d'instruments stériles.
    2. Évaluer le phénotype général de la tumeur de la prostate- très probablement, soit une tumeur remplie de liquide ou solide sera observée dans PCa GEMMs (Figure 2A, B).
      REMARQUE: Les tumeurs remplies de liquide sont souvent situées dans la région antérieure de la prostate (figure2A). Les tumeurs remplies de liquide sont composées principalement de tissu conjonctif avec des composants épithélial scant - ainsi ces tumeurs ne sont pas optimales pour la génération d'organoïdes en raison du bas nombre de cellules épithéliales de tumeur, comme sera discuté dans les résultats représentatifs section.
    3. Si des tumeurs remplies de liquide sont présentes, percer un petit trou dans la tumeur. Placer la région urogénitale dans un nouveau plat de 10 cm de PBS.
    4. Prenez une paire de forceps droits dans la main non dominante et des forceps courbés dans la main dominante. Retournez la région urogénitale sur son visage dorsal. Recherchez la région proximale de prostate (figure 1B), qui peut être identifiée par la couleur rose/rouge de l'urètre. Saisir l'urètre et tenir fermement afin de manipuler le tissu urogénital avec les forceps courbés.
      REMARQUE: Pendant la dissection de la prostate, prenez toujours note de l'emplacement de la vessie, car c'est le moyen le plus simple de localiser les lobes de la prostate individuels (Figure 1B).
  6. Enlèvement du tissu non-prostate de la région urogénitale
    1. Alors que toujours sur la face dorsale de la région urogénitale, trouver la base de la vésicule séminale. Retirez soigneusement la vésicule séminale et jetez-la. Effectuez la même procédure sur le côté opposé.
      REMARQUE: Évitez de perforer la vésicule séminale, car cela libérera le liquide sécréteur collant et opaque qui interfère avec la dissection de la prostate. Si la vésicule séminale est perforée, transférer la région urogénitale restante dans un nouveau plat de 10 cm avec du PBS frais.
    2. Enlever et jeter les déférents vas et autant de tissu gras et conjonctif que possible en utilisant le côté incurvé des forceps.
    3. Tout en maintenant fermement l'urètre/région proximale de prostate, employer une paire de ciseaux fins et pointus pour enlever la vessie de l'urètre.
  7. Isolement des lobes de la prostate individuels
    1. Localiser la prostate antérieure (Figure 1B). Assurez-vous de tenir fermement la région proximale de prostate/urètre avec les forceps droits. Enlever la région antérieure de la prostate en saisissant directement le tissu avec le côté courbé des forceps et en le tirant fermement loin de la vessie et du reste de la prostate. Placez le tissu dans PBS.
      REMARQUE: Pour toutes les régions de la prostate, disséquer les ciseaux peuvent être nécessaires pour enlever le tissu, selon la taille de la tumeur.
    2. Localiser la région ventrale de la prostate (Figure 1B). Enlever la région ventrale de la prostate de la même manière que dans l'étape 1.5.7.
    3. À ce stade de la dissection, seules les régions latérales et dorsales de la prostate devraient être présentes, tandis que la région proximale de prostate est toujours saisie par les forceps droits. Évaluer les régions latérales et dorsales de la prostate (figure 1B). Si la région latérale peut être distinguée de la région dorsal, enlevez la région latérale de prostate comme décrit dans l'étape 1.5.7. Faites la même procédure sur le côté opposé.
    4. Enlever la région de la prostate dorsal comme décrit à l'étape 1.5.7. Placez la région proximale de prostate dans le PFA de 4%, car sa structure dans le tissu musculaire de l'urètre la rend impropre à la génération d'organoïdes.

2. Génération d'organoïdes 3D à partir du tissu tumoral de la prostate

REMARQUE: La figure 3 montre une description picturale de la procédure pour la génération d'organoïdes tumoraux.

  1. préparation
    1. Préparer les médias organoïdes de la prostate de souris selon Drost et coll.18 avec les modifications suivantes. Utilisez le milieu conditionné au lieu des protéines recombinantes pour Noggin et R-Spondin et utilisez une concentration finale de 1% (v/v), au lieu de 10%, pour les deux milieu conditionné noggin et R-Spondin.
      REMARQUE: Les cellules HEK293 poignardées transfectées avec HA-souris Noggin-Fc ou HA-souris Rspo1-Fc sont utilisées pour produire noggin- ou R-Spondin- milieu conditionné, respectivement. Ces lignées cellulaires étaient un cadeau du laboratoire Calvin Kuo de l'Université Stanford.
    2. Préparer la solution de digestion dans un tube de 15 ml en diluant 20 mg/mL de collagène II avec un média DMEM/F12(MD) avancé à une concentration finale de 5 mg/mL. Ajouter l'inhibiteur de roche Y-27632 à la solution de collagène II à une concentration finale de 10 M.
      REMARQUE: Le rapport de tampon de digestion au tissu est de 1 ml à 50 mg, que nous utilisons selon Drost et al.18.
  2. Mincing et digestion du tissu tumoral
    1. Dans le capuchon de culture cellulaire, placez le tissu tumoral de la prostate dans un plat stérile de culture de 10 cm, disséquez et jetez le tissu nécrotique.
    2. Émincer le tissu tumoral de la prostate restant en cubes de 1 mm3 en tenant les morceaux de tissu avec les forceps incurvés stériles et en coupant avec des ciseaux de dissection.
    3. Placez les morceaux de tumeur hachés dans le tube de 15 ml avec le tampon de digestion en les ramassant vers le haut avec le côté courbé des forceps. Digdiez le tissu tumoral à 37 oC en secouant pendant 1,5 à 2 h. Vérifiez les progrès de la digestion toutes les 20 min.
      REMARQUE: À ce moment-là, retirer au moins 2 ml de matrice à partir de -20 oC de stockage et de dégel sur la glace. 1 mL d'aliquots de matrice prendra environ 3 h pour dégeler.
    4. Après la digestion des tissus, le tube centrifugeur à 175 x g pendant 5 min à 4 oC pour former une pastille cellulaire.
    5. Retirez le supernatant, faites glisser le tube pour desserrer la pastille cellulaire, et suspendez à nouveau la pastille cellulaire dans 1 ml de trypsine pré-chauffée complétée par 10 'M Y-27632 Rock Inhibitor. Mettre le tube dans un bain d'eau de 37 oC pendant 5 min.
    6. Après l'incubation, pipette de haut en bas 5 fois avec une pointe P1000 standard. Remettre le tube à un bain d'eau de 37 oC pendant 5 minutes de plus et répéter l'étape 2.2.6.
      REMARQUE: À ce moment-là, réchauffez un plat stérile de culture cellulaire à 6 puits en le mettant dans un incubateur de 55 oC.
  3. Compter les cellules et la résuspension dans la matrice
    1. Laver les cellules en ajoutant 9 ml d'AdDMEM/F12 froid et centrifuger le tube à 175 x g pendant 5 min à 4 oC.
    2. Après la centrifugation, retirez le supernatant, faites glisser le tube pour desserrer la pastille, et lavez les cellules à nouveau en ajoutant 10 ml d'AdDMEM/F12 froid. Centrifuger le tube à 175 x g pendant 5 min à 4 oC.
    3. Après la centrifugation, retirez le supernatant, faites glisser le tube pour desserrer la pastille, suspendez les cellules dans 1 ml d'AdDMEM/F12( ) et comptez le nombre de cellules à l'aide d'un hémocytomètre selon la procédure standard.
    4. Sept à huit dômes s'adaptent dans un puits d'un plat de 6 puits lorsque les organoïdes sont plaqués dans la matrice par l'intermédiaire d'une mode drop-wise. Environ 200 l de matrice produiront 7-8 dômes. Décidez du nombre de puits d'organoïdes nécessaires à des fins expérimentales futures et calculez le volume de matrice requis. Ensuite, calculez le volume de la solution cell-containing nécessaire pour avoir une concentration finale de 1,0 x 106 cellules/mL de matrice.
    5. Après comptage des cellules, centrifugeuse à 175 x g pendant 5 min à 4 oC. Retirez le supernatant, faites glisser le tube pour desserrer la pastille, et suspendez les cellules en volume de matrice calculée à l'étape 2.3.4.
      REMARQUE: La matrice ne reste sous forme liquide qu'à 4 oC; garder les tubes de stock de matrice et les solutions de cellules matricielles sur la glace en tout temps.
  4. Dômes de matrice de placage et application des médias
    1. Mélanger la solution de cellule matricielle avec un tuyau p200 pour répartir uniformément les cellules sans introduire de bulles. Retirer le plat de culture de 6 puits de l'incubateur de 55 oC.
    2. Soigneusement pipette 200 L de solution de cellule matricielle et rapidement déposer la solution dans un puits pour créer des dômes.
    3. Répétez l'étape 2.4.2. jusqu'à ce que le volume de la solution de cellule matricielle soit dépensé. Laisser les dômes se solidifier à température ambiante pendant 2 min.
    4. Retourner le plat de 6 puits à l'envers et mettre le plat dans un incubateur de 37 oC pour continuer la solidification pendant 20 min.
    5. Après l'incubation, ajouter 2 ml de la souris prostate organoïde à chaque puits. Ajouter l'androgène synthétique R1881 à chaque puits pour une concentration finale de 1 nM et y-27632 Rock Inhibitor à une concentration finale de 10 m. Mélanger soigneusement et placer la plaque dans un incubateur de 37 oC pour la culture.
      REMARQUE: Les médias de culture organoïde doivent être complétés par 10 'M Y-27632 Rock Inhibitor pour seulement 1 semaine après la génération d'organoïdes.

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Résultats

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Les images d'autopsie représentatives d'une souris avec une grande tumeur primaire remplie de liquide de prostate dans la région antérieure de prostate sont montrées dans la figure 2A. En revanche, la figure 2B, montre des images d'autopsie représentatives d'une souris avec une grande tumeur primaire solide de prostate pour laquelle les régions individuelles de prostate sont indiscernables. Les images fluorescentes de dissection...

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Discussion

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Étapes critiques dans le protocole pour la dissection de tumeur de prostate et la génération d'organoïde
Le déplacement du tissu non-prostate et de la dissection fine de la tumeur de prostate de souris est crucial pour la génération optimale des organoïdes de cancer puisque les cellules épithéliales non-prostate et les cellules épithéliales normales de prostate produiront des organoïdes. Pour les tumeurs solides de prostate spécifiquement, il est crucial d'isoler des secteurs de tumeur viable pour enl...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont pas de relations financières à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiens à remercier le laboratoire Calvin Kuo de l'Université Stanford d'avoir fourni des cellules HEK293 transfectées de la souris Noggin-Fc ou de la souris Ha Rspo1-Fc. Nous tenons également à remercier le Dr Dean Tang de nous avoir permis d'avoir accès au microscope à dissection fluorescente dans son laboratoire. Ce travail a été soutenu par CA179907 à D.W.G. de l'Institut national du cancer. Les ressources partagées du Roswell Park Comprehensive Cancer Center ont été appuyées par la subvention de soutien CA016056 des National Institutes of Health Cancer Center.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % trypsine + 2,21 mM EDTASigma25-053
1 1/4 pouce, 23 g, aiguilles de seringue jetablesBecton DickinsonZ192430
10 % de formalène neutre tamponnéeSigmaHT501128
32 % de paraformaldéhydeServices de microscopie électronique15714
A83-01MedChemExpressHY-10432
Advanced DMEM/F12+++Gibco12634
Balance analytiqueMettler Toledo30216623
B27 (50x)Gibco17504044
Collagenase IIGibco17101015
Dissection BoardThermo-Fisher36-1
EHS Sarcome, Pathclear Lot#19814A10Fabriqué par TrevigenRéquisitionné auprès de l’Institut national du cancer du Frederick National LaboratoryLes titulaires de subventions de l’Institut national du cancer peuvent demander une matrice
HEPES (1 M)Sigma25-060
facteur de croissance épidermique recombinant humain (EGF)PeproTechAF-100-15
L-glutamine (200 mM)Sigma25-005
N-acétyl-L-cystéineSigmaA9165
Pénicilline-StreptomycineSigmaP4333
Balance de précisionMettler Toledo
#23World Precision Instruments504176
Manche de scalpel #7, 16 cmWorld Precision Instruments500238
Lame de rasoir en carbone à un tranchantFisherbrand12-640
Ciseaux de dissection en acier inoxydable, 10 cm, droitsWorld Precision Instruments14393
Pince à iris en acier inoxydable, 10 cm, pointe incurvée, denteléeWorld Precision Instruments15915
Pince utilitaire Nugent en acier inoxydable, pointe droite, denteléeWorld Precision Instruments504489
Y-276632 (Inhibiteur de roche)APExBIOA3008
Scalpel 30216561

Références

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