Ici, nous présentons plusieurs méthodes simples pour évaluer la viabilité et la mort dans les sphéroïdes 3D de cellules cancéreuses, qui imitent les gradients physico-chimiques des tumeurs in vivo beaucoup mieux que la culture 2D. Le modèle sphéroïde permet donc d'évaluer l'efficacité du médicament contre le cancer avec une meilleure traduction aux conditions in vivo.
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Article de méthode
Évaluation de la viabilité cellulaire et de la mort dans les cultures sphéroïdes 3D des cellules cancéreuses
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les sphéroïdes tridimensionnels des cellules cancéreuses sont des outils importants pour les deux dépistages de médicaments anticancéreux et pour obtenir un aperçu mécaniste de la biologie des cellules cancéreuses. La puissance de cette préparation réside dans sa capacité à imiter de nombreux aspects des conditions in vivo des tumeurs tout en étant rapide, bon marché, et assez polyvalent pour permettre un dépistage relativement à haut débit. Les conditions de culture sphéroïde peuvent récapituler les gradients physico-chimiques dans une tumeur, y compris l'acidité extracellulaire croissante, le lactate accru, et la disponibilité décroissante de glucose et d'oxygène, de la périphérie sphéroïde à son noyau. En outre, les propriétés mécaniques et les interactions cellule-cellule des tumeurs in vivo sont en partie imitées par ce modèle. Les propriétés spécifiques et par conséquent les conditions optimales de croissance, des sphéroïdes 3D, diffèrent considérablement entre les différents types de cellules cancéreuses. En outre, l'évaluation de la viabilité cellulaire et de la mort chez les sphéroïdes 3D nécessite des méthodes qui diffèrent en partie de celles employées pour les cultures 2D. Ici nous décrivons plusieurs protocoles pour préparer les sphéroïdes 3D des cellules cancéreuses, et pour l'utilisation de telles cultures pour évaluer la viabilité et la mort de cellules dans le contexte d'évaluer l'efficacité des drogues anticancéreuses.
Introduction
L'utilisation de modèles sphéroïdes multicellulaires en biologie du cancer est de plusieurs décennies1,2, mais a gagné un élan substantiel ces dernières années. Cela reflète en grande partie une prise de conscience accrue de la façon dont le phénotype des cellules cancéreuses dépend fortement de leur microenvironnement et de leurs conditions de croissance spécifiques. Le microenvironnement dans les tumeurs pleines est fondamentalement différent de celui dans les tissus normaux correspondants. Cela comprend les conditions physico-chimiques telles que le pH, la tension de l'oxygène, ainsi que la pression interst....
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Protocole
1. Génération de sphéroïdes
- Préparation des suspensions cellulaires pour la formation de sphéroïdes
REMARQUE : Différentes lignées cellulaires ont des propriétés d'adhérence très différentes et le protocole de formation sphéroïde le plus approprié doit être établi dans chaque cas. Nous avons constaté que les cellules MCF-7 et BxPC-3 conviennent à la formation spontanée de sphéroïdes, tandis que MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 et MiaPaCa exigent l'addition de la membrane reconstituée de sous-sol pour former avec succès des sphéroïdes. Seulement Les cellules MDA-MB-231 et BxPC-3 ont été employées pour le protocole de chute suspendue, cependant d....
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Résultats
Les essais de croissance sphéroïdes basés sur le protocole de formation sphéroïde schématiquement illustré dans la figure 1A et la figure 1B, ont été utilisés comme point de départ pour l'analyse des effets des traitements anticancéreux dans une tumeur 3D imitant le réglage. La facilité avec laquelle les sphéroïdes sont formés est spécifique à la lignée cellulaire, et certaines lignées cellulaires nécessitent une supplémentation.......
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Discussion
L'utilisation des sphéroïdes de cellules cancéreuses 3D s'est avérée un outil valable et polyvalent non seulement pour le criblage de drogue anticancéreux, mais également pour gagner la perspicacité mécaniste dans la régulation de la mort et de la viabilité de cellules cancéreuses dans des conditions imitant ceux dans la tumeur microenvironnement. Ceci est particulièrement crucial car l'accessibilité, l'utilisation cellulaire, et les effets intracellulaires des drogues chimiothérapeutiques sont profondément impactés par .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants à Katrine Franklin Mark et Annette Bartels pour l'excellente assistance technique et à Asbjarn N'hr-Nielsen pour l'exécution des expériences dans figure 1D. Ce travail a été financé par la Fondation Einar Willumsen, la Fondation Novo Nordisk et la Fondation Juchum (tous à SFP).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2-(4-amidinophényl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 ; | Pour la coloration des noyaux |
| 5-Fluorouracile (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Composant dans le traitement chimiothérapeutique |
| 5-(N-éthyl-isopropyl)amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibiteur de NHE1 Anticorps |
| signalisation cellulaire | PARP et cPARP | #9542 | Utilisé dans le western blot |
| Anticorps contre la signalisation cellulaire Ki-67 | #9449 | Utilisé pour l’IHC | |
| Anticorps contre la | signalisation cellulaire | #2524 ; | Utilisé pour IHC |
| Anticorps contre la bêta-actine | Sigma | A5441 | Utilisé dans le western |
| blot Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Utilisé pour la préparation de gel d’agarose |
| Échelle protéique de référence | Invitrogen | #10747-012 | Utilisé pour SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 ; ; | Utilisé pour la détermination des protéines à partir de lysats |
| Bü ; Chambre de | Marienfeld | 610311 | Pour le comptage cellulaire |
| Microscope épifluorescent BX63 | Olympus | Utilisé pour l’imagerie fluorescente | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Utilisé pour le test de viabilité cellulaire |
| Cisplatine | Sigma-Aldrich | #P4394 ; | Composante dans le traitement chimiothérapeutique |
| Microplaque sphérique Corning, 96 puits, noire avec fond rond transparent, ; Accessoire ultra-bas, Avec couvercle, | Corning | stérile#4520 | Utilisé pour la croissance de sphéroïdes avec des mesures de luminescence comme point final |
| Corning 96 puits, fond rond transparent, ; Microplaque à très faible fixation, Avec couvercle, Corning stérile | #7007 | Suffisant pour la croissance sphéroïde sans mesures de luminescence comme point final | |
| Critère TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Utilisé pour SDS-PAGE |
| Doxorubicine | Abcam | #120629 | Composant dans le traitement chimiothérapeutique |
| FLUOStar Optima Lecteur de microplaques | BMG Labtech | Utilisé pour l’enregistrement de la luminescence | |
| Formaldéhyde ; | VWR Chemicals ; | #9713.1000 ; | Utilisé pour la fixation cellulaire |
| Geltrex LDEV-free Reduced Growth Factor Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Maintenir à 4 ° ; C pour empêcher la solidification. Appelé rBM dans le protocole. |
| Sigma | #F9665 | inactivé thermiquement | Sérum pour milieu de croissance |
| ImageJ | NIH | Scientific Analyse d’images | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Utilisé pour le stockage de sphéroïdes intégrés |
| Mini comprimés cocktail inhibiteurs de protéase | Roche Diagnostics GmBH ; | # 11836153001 | Utilisé pour la préparation du tampon de lyse |
| microscope MZ16 | Leica | Utilisé pour les images microscopiques optiques | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer ; | Invitrogen | #NP0007 | Utilisé pour le western blot |
| Pierce ECL Substrat de western blot | Thermo scientific | #32106 | Utilisé pour le western blot |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Utilisé pour la coloration des bandes protéiques |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific Logiciel de graphisme et de statistiques | |
| Propidium iodure (solution de 1 mg/ml dans l’eau) | Invitrogen ; | P3566 | Sensible à la lumière ; |
| Réservoirs stériles, multicanaux | SPL lifesciences | 21002 | Utilisé pour l’ensemencement de cellules pour la formation de sphéroïdes |
| Superfrost Ultra-Plus Lame d’adhérence ; | Menzel-Glä ; ser | #J3800AMNZ | Lame de verre de microscope utilisée pour l’enrobage |
| Tamoxifène | Sigma-Aldrich | #T5648 | Utilisée comme traitement chimiothérapeutique |
| Trans-blot Turbo 0.2 µ ; m membranes nitrocellulosiques | Bio-Rad | #170-4159 | Utilisé pour le western blot |
| Tris/Glycine/SDS tampon courant ; | Bio-Rad ; | #161 0732 | Utilisé pour SDS-PAGE |
| Trypsine-EDTA solution | Sigma | #T4174 ; | Enzyme de dissociation cellulaire |
Références
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen....
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