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Article de méthode

Chirurgie de l'hémisection de la moelle épinière thoracique et évaluation locomotrice à champ ouvert chez le rat

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DOI :

10.3791/59738

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26 juin 2019

 , 
1Department of Neurosciences, Faculté de Médecine, Université de Montréal, 2Hôpital du Sacré-Cœur de Montréal, 3Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC), Université de Montréal

Dans cet article

Résumé

L'hémisection spinale thoracique de rat est un modèle valable et reproductible des dommages unilatéraux de moelle épinière pour étudier les mécanismes neurals de la récupération locomotrice et de l'efficacité de traitement. Cet article comprend un guide détaillé étape par étape pour effectuer la procédure d'hémisection et d'évaluer les performances locomotrices dans une arène de champ ouvert.

Résumé

Les lésions de la moelle épinière (SCI) causent des perturbations dans la fonction motrice, sensorielle et autonome au-dessous du niveau de la lésion. Les modèles animaux expérimentaux sont des outils précieux pour comprendre les mécanismes neuronaux impliqués dans la récupération locomotrice après SCI et pour concevoir des thérapies pour les populations cliniques. Il existe plusieurs modèles expérimentaux de SCI, y compris la contusion, la compression et les blessures par transsection qui sont utilisés dans une grande variété d'espèces. Une hémisection implique la transection unilatérale de la moelle épinière et perturbe toutes les voies ascendantes et descendantes d'un seul côté. L'hémisection spinale produit une blessure fortement sélective et reproductible par rapport aux techniques de contusion ou de compression qui est utile pour étudier la plasticité neurale dans les voies épargnées et endommagées liées à la récupération fonctionnelle. Nous présentons un protocole étape par étape détaillé pour effectuer une hémisection thoracique au niveau vertébral de T8 dans le rat qui a comme conséquence une paralysie initiale du membre postérieur sur le côté de la lésion avec le rétablissement spontané gradué de la fonction locomotrice au-dessus de plusieurs Semaines. Nous fournissons également un protocole de notation locomoteur pour évaluer la récupération fonctionnelle dans le champ ouvert. L'évaluation locomotrice fournit un profil de récupération linéaire et peut être effectuée à la fois tôt et à plusieurs reprises après les blessures afin de filtrer avec précision les animaux pour les points de temps appropriés dans lesquels effectuer des tests comportementaux plus spécialisés. La technique d'hémisection présentée peut être facilement adaptée à d'autres modèles et espèces de transection, et l'évaluation locomotrice peut être utilisée dans une variété de SCI et d'autres modèles de blessures pour marquer la fonction locomotrice.

Introduction

Les dommages de moelle épinière (SCI) sont associés aux perturbations graves dans la fonction motrice, sensorielle, et autonome. Les modèles animaux expérimentaux de SCI sont des outils précieux pour comprendre les événements anatomiques et physiologiques impliqués dans la pathologie de SCI, pour étudier les mécanismes neuronaux dans la réparation et la récupération, et pour dépister l'efficacité et l'innocuité de la thérapeutique potentielle Interventions. Le rat est l'espèce la plus couramment utilisée dans la recherche SCI1. Les modèles de rat sont peu coûteux, faciles à reproduire, et une grande batterie de tests comportementaux sont disponibles pour évaluer les résultats fonctionnels2. Malgré quelques différences dans l'emplacement des voies, la moelle épinière du rat partage des fonctions sensorimotrices similaires globales avec les grands mammifères, y compris les primates3,4. Les rats partagent également des conséquences physiologiques et comportementales analogues à l'ICS qui se rapportent aux humains5. Les primates non humains et les grands modèles animaux peuvent fournir une approximation plus proche de l'homme SCI6 et sont essentiels pour prouver l'innocuité et l'efficacité du traitement avant l'expérimentation humaine, mais sont moins couramment utilisés en raison de l'éthique et le bien-être animal considérations, dépenses et exigences réglementaires7.

Les modèles de SCI de transection de rat sont exécutés par l'interruption ciblée de la moelle épinière avec une lésion sélective utilisant un couteau de dissection ou des ciseaux d'iridectomy après une laminectomy. Comparé à une transection complète, la transection partielle dans le rat a comme conséquence des dommages moins graves, le soin postopératoire plus facile d'animal, le rétablissement locomoteur spontané, et plus étroitement des modèles SCI chez l'homme qui est principalement incomplet avec l'épargnant partiel de tissu reliant la moelle épinière et les structures supraspinales8. Une hémisection unilatérale perturbe toutes les voies ascendantes et descendantes d'un seul côté, et produit des déficits locomoteurs quantifiables et hautement reproductibles, améliorant l'exploration des mécanismes biologiques sous-jacents. La conséquence fonctionnelle la plus importante de l'hémisection est une paralysie initiale de membre du même côté et au-dessous du niveau de la lésion avec le rétablissement spontané gradué de la fonction locomotrice sur plusieurs semaines9,10, 11 Ans, états-unis ( , 12. Le modèle d'hémisection est particulièrement utile pour étudier la plasticité neuronale des voies et circuits endommagés et résiduels liés à la récupération fonctionnelle9,11,12, 13,14,15,16,17,18. Plus précisément, l'hémisection effectuée au niveau thoracique, c'est-à-dire au-dessus des circuits spinaux qui contrôlent la locomotion de l'arrière-pays, est particulièrement utile pour étudier les changements dans le contrôle locomoteur. Comme une relation non linéaire existe entre la sévérité des lésions et la récupération locomotrice après SCI19, des tests comportementaux appropriés pour évaluer les résultats fonctionnels sont primordiaux dans les modèles expérimentaux.

Une batterie complète de tests comportementaux sont disponibles pour évaluer les aspects spécifiques de la récupération locomotrice fonctionnelle chez le rat2,20. Beaucoup de tests locomoteurs ne fournissent pas de mesures fiables tôt après SCI que les rats sont trop handicapés pour soutenir leur poids corporel. Une mesure de la performance locomotrice spontanée qui est sensible aux déficits tôt après une blessure, et ne nécessite pas de formation préopératoire ou d'équipement spécialisé, est bénéfique afin de surveiller la récupération locomotrice pour les points de temps appropriés dans lesquels compléter les tests comportementaux spécialisés. Le score d'évaluation en champ ouvert10de Martinez, initialement développé pour évaluer la performance locomotrice après l'IC cervicale chez le rat, est un score ordinal de 20 points évaluant la performance locomotrice globale pendant la locomotion spontanée au-dessus du sol dans un champ ouvert. La notation est effectuée séparément pour chaque membre à l'aide d'une rubrique qui évalue les paramètres spécifiques d'une gamme de mesures locomotrices, y compris le mouvement des membres articulaires, le soutien du poids, la position des chiffres, les capacités de pas, la coordination avant-membre et le membre postérieur, et la queue position. Le score d'évaluation est dérivé de l'échelle d'évaluation en champ ouvert de Basso, Beattie et Bresnahan (BBB) conçue pour évaluer les performances locomotrices après contusion thoracique21. Il est adapté pour évaluer avec précision et fiabilité à la fois la fonction locomotrice des membres antérieurs et des membres postérieurs, permet une évaluation indépendante des différents paramètres de notation qui ne sont pas adaptés à la notation hiérarchique du BBB, et fournit une récupération linéaire profil10. En outre, par rapport à la BBB, le score d'évaluation est sensible et fiable dans les modèles de blessures plus graves10,11,20,22. Le score d'évaluation a été utilisé pour évaluer l'affaiblissement locomoteur chez le rat suivant cervical10,12 et thoracique9 SCI seul et en combinaison avec des lésions cérébrales traumatiques23.

Nous présentons ici un protocole détaillé étape par étape pour effectuer une sCI d'hémisection thoracique au niveau vertébral de T8 dans le rat long-Evans femelle, et pour évaluer la récupération locomotrice de membre arrière dans le champ ouvert.

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Protocole

Les expériences décrites dans cet article ont été réalisées conformément aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux et ont été approuvées par le comité d'éthique de l'Université de Montréal.

1. Chirurgie de l'hémisection thoracique

  1. Portez l'équipement de protection approprié (gants, masque et robe) pour maintenir un environnement aseptique pour la chirurgie. Nettoyez la zone chirurgicale avec des lingettes d'alcool, et placez des rideaux chirurgicaux stériles sur le champ chirurgical. Stériliser les outils chirurgicaux et les placer sur le terrain chirurgical.
  2. Anesthésiez le rat sous un mélange de gaz isoflurane (3 % d'induction, 0,5 à 3 % d'entretien) et d'oxygène (1 L/min). Confirmer la profondeur anesthésique chirurgicale appropriée en vérifiant l'absence de pincement d'orteil et de réponses réflexes cornéennes. Surveillez continuellement le rat pendant toute la procédure, et ajustez la quantité de livraison anesthésique au besoin pour maintenir la profondeur anesthésique chirurgicale.
  3. Raser le tronc dorsal entre la hanche et le cou, placer le rat sur le champ chirurgical, désinfecter le site d'incision avec des lingettes d'alcool et une solution de proviodine, et maintenir la température corporelle du noyau à 37 oC à l'aide d'un coussin chauffant contrôlé par rétroaction surveillé par rectal thermomètre.
  4. Placez l'onduleur ophtalmique sur les yeux pour les garder hydratés et réappliquer tout au long de la chirurgie au besoin.
  5. Faire une incision de 2,5 cm dans la peau en superposant les vertèbres T6-T10 avec un scalpel. Retirez la peau et la graisse superficielle à l'aide de ciseaux de dissection émoussés.
    REMARQUE : Les segments vertébraux T6-T10 peuvent être identifiés soit rostally par palpation douce des segments spinaux dorsaux de la base du crâne à partir de la protubérance notable de la vertèbre thoracique24, ou caudally par palpation de la nervure flottante la plus postérieure qui induira le mouvement dans les vertèbres thoraciques 13 e.
  6. Séparez les muscles paravertbral en insérant sur l'aspect dorsal des vertèbres T7-T9 à l'aide de ciseaux de dissection émoussés et d'un rétracteur auto-retenu. Débrider et effacer tout tissu restant à l'aide de forceps fins et d'applicateurs à pointe de coton pour exposer les processus spinous et lalamines vertébrales.
    REMARQUE : Ceci, et les étapes suivantes sont grandement aidés par la visualisation microscopique (5 à 15x).
  7. Couper soigneusement les facettes (articulations zygapophysiales) bilatéralement sur les vertèbres T7 et T8 avec des coupe-os délicats. Couper le tissu conjonctif dorsal entre les lamelles vertébrales T8 et T9 superficiellement avec un scalpel (1 mm de profondeur) en prenant soin de ne pas blesser le cordon de sous-pose.
  8. Enlever le processus spinous de la vertèbre T8 avec des coupe-os. Avec des forceps hémostatiques courbes soigneusement serrés sur le processus pieux T7, faites pivoter l'extrémité caudale de la lamée T8 légèrement rostalement (20 degrés), insérez les coupe-os sous la lame T8, et faites une coupe de ligne médiane s'étendant le long de la lame. Continuer la laminectomie en répétant les coupures sur le côté gauche et droit de la lame vertébrale médiale aux processus transversaux pour exposer la moelle épinière.
    REMARQUE : Veillez à enlever tous les fragments d'os créés à partir de la laminectomie.
  9. Drip lidocaïne (2%, 0.1 ml) dans le canal spinal exposé et enlever la dura superposant le segment spinal de T8 utilisant les forceps fins et les ciseaux d'iridectomy. Répétez l'administration de la lidocaïne au cordon exposé et identifiez la ligne médiane du cordon par visualisation d'une ligne centrale créée entre les processus spinous s'étendant entre les vertèbres T7-T9 exposées.
    REMARQUE : Avec les processus spinous sur T7 et T9, les ganglions de racine dorsale exposés sur T8 peuvent également être employés pour aider à identifier la ligne médiane et une aiguille de 30 G peut être placée dans la ligne médiane du cordon pour aider avec l'hmisection suivante.
  10. Hémiquer la moelle épinière de la ligne médiane vers un côté avec un couteau de dissection. Veillez à ne pas couper à travers l'artère spinale antérieure sur le côté ventral (ne pas appliquer de pression ferme sur le corps vertébral). À l'aide de ciseaux d'iridectomy, coupez soigneusement par n'importe quel tissu restant sur le côté lesionné de la moelle épinière pour s'assurer que le quadrant ventrolatéral est convenablement transecté.
  11. Placer l'éponge hémostatique stérile imbibée de saline (6 x 2 mm) dans la cavité exposée au-dessus de la moelle épinière et suturer les couches musculaires (4-0 polyglactin 910). Ensuite, suturer la peau autour du site d'incision.
  12. Fournir un analgésique adéquat (buprénorphine 0,05 mg/kg sous-cutané [s.c.]), un antibiotique (enrofloxacine, 10 mg/kg s.c.), et reconstituer les liquides perdus avec la solution de la sonnerie lactée de 5 cc (intrapéritoné [i.p.]) immédiatement après la chirurgie.
  13. Retirer le rat de l'anesthésie. Placer le rat dans un environnement chaud sous un coussin chauffant ou une lampe (33 oC) jusqu'à ce que l'animal soit complètement éveillé.
  14. Fournir une analgésie supplémentaire tous les jours au cours des 3 premiers jours post-chirurgicaux et de surveiller continuellement les signes de douleur, perte de poids, micturition incorrecte, infection, problèmes de cicatrisation des plaies, ou autophagie.

2. Procédure d'essai en plein champ et notation des performances locomotrices

  1. Manipulez les rats tous les jours pendant 1 semaine et habituez-les à l'aréna pendant deux séances de 5 minutes avant les essais pour s'acclimater à être ramassés, doucement à partir du milieu du tronc, tandis que dans le champ ouvert et pour assurer la fiabilité de mesure pendant les essais.
  2. Placez une caméra au niveau du sol face à l'arène circulaire en plexiglas en champ ouvert pour enregistrer les séances d'essai pour l'analyse hors ligne (30 à 60 images/s minimum).
  3. Commencez l'enregistrement vidéo et placez le rat au centre de l'arène dans des conditions de faible luminosité pour encourager l'activité locomotrice.
  4. Continuer la séance d'essai pendant 4 min pour assurer une quantité suffisante de combats locomoteurs pour l'analyse. Ramassez et remplacez les rats au centre de l'arène lorsqu'ils restent immobiles pendant plus de 20 s pour favoriser la locomotion.
  5. Score locomotor performance de la session d'essai enregistrée en complétant la rubrique fournie dansTableau 1selon les paramètres des sous-sections suivantes.
    REMARQUE : Il est utile de marquer chaque paramètre séparément en visualisant à plusieurs reprises la session de test enregistrée à l'aide d'un logiciel qui permet une vitesse de lecture variable et une analyse image par image (p. ex., lecteur multimédia VLC).
    1. Pour les mouvements articulaires des membres, marquer les mouvements articulaires des membres postérieurs pendant la locomotion spontanée séparément pour la cheville, le genou et la hanche comme normal (plus de la moitié de l'aire de répartition du mouvement, score attribué 2), léger (moins de la moitié de l'aire de répartition, score attribué 1), ou absent (score attribué 0).
    2. Pour le soutien du poids, évaluer la capacité des muscles extenseurs de l'arrière-pays à se contracter et soutenir le poids corporel chargé lorsque le membre est au sol séparément pour quand le rat est stationnaire ainsi que pendant la locomotion active. Attribuez une note de 1 lorsque le soutien du poids est présent et un score de 0 lorsque le soutien du poids est absent.
      REMARQUE : Le support de poids stationnaire est considéré comme un perquisite pour le soutien de poids actif.
    3. Pour la position des chiffres, évaluer la position des chiffres postérieurs pendant que le rat est stationnaire et pendant la locomotion. Attribuez une note de 2 lorsque les chiffres de l'arrière-membre sont étendus, espacés les uns des autres, et tonique pendant la locomotion dans plus de 50% de la période d'essai (considéré comme normal). Attribuer une note de 1 lorsque les chiffres restent principalement fléchis et un score de 0 lorsque les chiffres restent principalement atoniques.
    4. Pour le pas, complétez ce paramètre seulement si le rat peut soutenir son poids corporel pendant l'étape. Évaluer l'étape en évaluant l'orientation du placement de la patte postérieure au moment du premier contact et au décollage du sol en plus de la fluidité de la phase d'oscillation pendant l'étape.
      REMARQUE : Il y a 3 scores pour ce paramètre décrits dans les sous-sections suivantes évaluant séparément : 1) l'orientation axiale du placement de patte au contact de membre (placement dorsal/plantaire), 2) l'orientation longitudinale du placement de patte au contact initial et pendant la portance (parallèle à l'axe du corps ou en rotation interne/externe), et 3) la qualité du mouvement des membres pendant l'oscillation (régulière ou irrégulière).
      1. Pour le placement de patte au contact de membre, marquez l'orientation axiale du placement de patte au contact de membre comme 0 quand les placements dorsaux se produisent dans plus de 50% d'étapes.
        REMARQUE : Le placement plantaire est considéré comme un perquisite pour marquer l'orientation de la patte au contact et à l'ascenseur (étape 2.5.4.2), le mouvement d'oscillation (étape 2.5.4.3) et la coordination de l'avant-membre -hindlimb (étape 2.5.5).
      2. Pour l'orientation de la patte au contact et à l'ascenseur des membres, accordez une note de 2 lorsque les axes longitudinals de la patte et du corps sont parallèles et un score de 1 lorsque le membre est tourné à l'extérieur ou à l'intérieur, séparément pour le contact et l'ascenseur des membres.
      3. Pour le mouvement de balançoire, attribuez une note de 2 lorsque les articulations des membres postérieurs se déplacent de façon harmonieuse et régulière pendant la balançoire et un score de 1 lorsque des mouvements saccadés ou spasmodiques des articulations se produisent pendant la balançoire.
    5. Pour la coordination avant-membre-hindlimb, complétez ce paramètre seulement si 4 étapes consécutives se produisent pendant l'essai et si les membres peuvent soutenir activement le poids corporel. Attribuer une note de 3 lorsque la coordination est cohérente (90 % des étapes), 2 lorsqu'elles sont fréquentes (50 à 90 % des étapes), 1 occasionnelle (50 % des étapes) ou 0 en cas d'absence (0 % des étapes).
      REMARQUE : La coordination de l'avant-garde est définie comme une alternance régulière entre le membre postérieur marqué et le membre antérieur du même côté du corps.
    6. Pour la position de la queue, évaluez la position de la queue pendant la locomotion comme étant soit en place (hors du sol, score attribué à 1) ou vers le bas (toucher le sol, score attribué 0).
      REMARQUE : Une position élevée de la queue pendant la locomotion est un indicateur de stabilité du tronc chez le rat. Après l'hémisection, la queue est normalement tenue près du sol ou en touchant le sol, car la stabilité du tronc est altérée.
    7. Ajouter les scores individuels de chaque paramètre pour fournir un total pour chaque membre postérieur d'un maximum de 20 points.
      REMARQUE : Un score de 20 indique la performance locomotrice normale. Les scores de lt;20 représentent des quantités croissantes de déficience locomotrice et un score de 0 indique la paralysie des membres.

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Résultats

Des lésions reproductibles avec un degré élevé de cohérence peuvent être générées avec la technique d'hémisection. Pour évaluer et comparer des tailles de lésions entre les groupes expérimentaux, la zone maximale de la lésion en pourcentage de la section transversale totale de la moelle épinière peut être facilement calculée avec la coloration histologique des sections de moelle épinière. La figure 1 montre une lésion représentative de l'hémicorde gauche et une couche de la proportion de la ...

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Discussion

Une force majeure de la technique d'hémisection est la sélectivité et la reproductibilité de la lésion qui conduit à une variabilité réduite dans les phénotypes histologiques et comportementaux entre les animaux25. Afin d'assurer une lésion unilatérale au niveau spinal approprié, l'identification précise du segment vertébral approprié et de la ligne médiane de moelle épinière est critique. Comme il peut y avoir une tendance pour la moelle épinière à tourner dans la direction de la coupe au cours d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ces travaux ont été appuyés par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC; MOP-142288) à M.M. M.M. a été appuyé par une bourse salariale du Fonds de Recherche Québec Santé (FRQS), et A.R.B a été soutenu par une bourse de FRQS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BaytrilCDMV11242
Ciseaux de dissection émousséeWorld Precision Instruments503669
Buprénorphine hydrochlorureCDMV
Objectif de caméraPentaxC31204TH12.5-75mm, f1.8, format 2/3", monture C
Caméra vidéo CMOSBasleracA2000-165ucFormat 2/3", 2048 x 1088 pixels, jusqu’à 165 ips, monture C, USB3
Gaz d’oxygène compriméPraxair
Applicateurs à embout en cotonCDMV108703
Coupe-os délicatsOutils de science fine16109-14
Couteau à dissectionOutils de science fine10055-12
Pince fine DumontOutils de sciencefine11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Tressé FS-2 suture (J392H)CDMV111689
Coussin chauffant contrôlé par rétroactionHarvard Apparatus55-7020
Rats Long-Evans femellesCharles River LaboratoriesCode de souche : 006225-250g
GelfoamCDMV102348
Pince à hémostatique incurvéeFine Science Tools13003-10
Stérilisateur à billes chaudesFine Science Tools18000-45
Hydrogel70-01-5022Clear H20
IsofluoraneCDMV118740
Lactate Ringer’s solutionCDMV116373
Lidocaïne (2 %)CDMV123684
Aiguille 30 gaCDMV4799
Aire ouverteCirculaire sur mesureArène en plexiglas 96 cm de diamètre, hauteur de paroi 40 cm
Pommade ophtalmiqueCDMV110704
Ordinateur personnel  ;Avec connectivité USB3 pour enregistrer des vidéos avec la caméra répertoriée
Saline physiologiqueCDMV1399
ProviodineCDMV4568
Rongeurs diététiques liquidesBioservF1268
Lame de scalpal #11CDMV6671
Enrouleur auto-rétracteurWorld Precision Instruments14240
Vannas iridectomie ciseaux à ressortFine Science Tools15002-08
Machine d’anesthésie vétérinaire et vaporisateur d’isofluaraneDispomed975-0510-000
VLC lecteur multimédiaVideoLANvideolan.org/vlc

Références

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