Modèle de Murine des tumeurs métastatiques de foie dans le cadre des dommages de reperfusion d'ischémie

Résumé

Nous décrivons en détail un modèle de tumeur de métastases de foie de cancer côlorectal médicalement pertinent (CRLM) et l'influence de la reperfusion d'ischémie de foie (I/R) dans la croissance de tumeur et la métastase. Ce modèle peut aider à mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la promotion induite par la chirurgie de la croissance métastatique du foie.

Résumé

L'ischémie hépatique et la lésion de reperfusion (I/R), un défi clinique commun, demeure un processus pathophysiologique inévitable qui a été montré pour induire des dommages multiples de tissu et d'organe. En dépit des avances récentes et des approches thérapeutiques, la morbidité globale est restée insatisfaisante particulièrement dans les patients présentant des anomalies parenchymales sous-jacentes. Dans le contexte de la croissance agressive de cancer et de la métastasie, l'I/R chirurgical est suspecté pour être le promoteur régulant la répétition de tumeur. Cet article vise à décrire un modèle murine médicalement pertinent de foie I/R et métastasie colorectale de foie. Ce faisant, nous visons à aider d'autres chercheurs à établir et à perfectionner ce modèle pour leur pratique de recherche de routine afin de mieux comprendre les effets du foie I/R sur la promotion des métastases hépatiques.

Introduction

Le foie est l'un des sites les plus communs pour le développement de la maladie métastatique¹. La mortalité est presque invariablement attribuable aux complications liées à la croissance tumorale dans le foie. Dans les patients présentant les tumeurs pleines métastatiques dans le foie, la chirurgie demeure une intervention cruciale pour le contrôle de la maladie et une approche curative possible. Cependant, la grande majorité des patients se présentent finalement avec la maladie récurrente, principalement dans le foie^2,3. Pendant la chirurgie hépatique, le saignement peropératoire est commun, nécessitant souvent la transfusion sanguine et différentes approches techniques pour commander le saignement, y compris les méthodes vasculaires de serrage. Cependant, de telles mesures causent l'ischémie/reperfusion hépatique (I/R) au tissu de foie. Les effets défavorables de I/R sur la fonction hépatocellulaire ont été bien documentés. L'insulte de foie I/R enflamme des cascades inflammatoires pendant la restauration du flux sanguin par des voies inflammatoires^4. Non seulement les dommages de foie I/R contribuent à l'échec de foie, mais les preuves actuelles montrent également que les dommages d'I/Rstimulent l'adhérence de cellules de tumeur, et favorise l'incidence de la formation de métastases et la croissance de la maladie micrométastatique existante 5. Nous avons précédemment rapporté que le stress chirurgical induit l'activation des cellules immunitaires qui aide non seulement à lacroissance de la tumeur primaire, mais facilite également les métastases en capturant des cellules cancéreuses dans la circulation 6.

Ici nous décrivons en détail une technique pour établir un modèle de tumeur de souris de métastasie de foie. Dans ce modèle, nous présentons également une méthode pour induire des dommages hépatiques de reperfusion d'ischémie qui agit en tant que substitut au stress chirurgical présent médicalement pendant des hepatectomies. Les méthodes combinées de l'injection de cancer et de l'I/R hépatique peuvent interpréter avec succès le développement de CRLM dans les patients qui ont subi la résection primaire de tumeur.

Protocole

Tous les protocoles sur les animaux sont approuvés par le Comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux et sont respectés aux Lignes directrices des National Institutes of Health (NIH). Les instruments utilisés pour n'importe quelle intervention chirurgicale ont été complètement stérilisés.

1. Préparation initiale

1. Avant d'injecter des cellules cancéreuses dans la rate de la souris, autoclave et stériliser tous les instruments à utiliser pendant la procédure.
2. Stériliser et/ou autoclaver un coussin chauffant, des gants chirurgicaux, de la gaze, des paires de ciseaux, de petites pinces, un dilatateur de vaisseau, des forceps chirurgicaux et un porte-aiguille.
3. Préparer l'analgésique postopératoire (0,1 mg/kg de buprénorphine) à administrer après la splenectomy et tous les 12 h pendant 2 jours.

2. Culture cellulaire

1. Assurez-vous que les cellules cancéreuses sont exemptes de contamination par le mycoplasme à l'aide d'un kit Mycoplasma ELISA.
2. Préparer une solution de 500 ml du milieu de culture de l'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco à 4 oC pour la culture des cellules cancéreuses colorectales murines (MC38). Les supports de culture doivent être complétés par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (SGF), 100 U/mL de pénicilline, 100 g/mL de streptomycine, 15 mM de HEPES et 200 mM de L-glutamine.
3. Cellules cancéreuses de culture dans un flacon sans ARN et RNAse (75 cm²). Incuber la culture cellulaire dans un incubateur humidifié cellulaire/tissu contenant 5 % de CO₂. Maintenir la température à 37 oC.
4. Une fois que les cellules proliférantes atteignent 90 à 100% de confluence, aspirez les vieux médias, lavez les cellules avec 1x saline tamponnée par phosphate (PBS) et les traitez avec 1x trypsine (0,25%) pour détacher les cellules du flacon.
5. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml et centrifugeuse pendant 5 min à 700 x g.
6. Aspirer les médias et laver avec 1x PBS deux fois par centrifugation répétée.
7. Procédez pour confirmer la viabilité cellulaire en taclant les cellules avec la tache bleue de trypan (0.4%).
8. Resuspendre les cellules à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/ 100 l en 1x PBS. Les cellules pipet s'engouffrent complètement pour éviter les amas. Gardez les cellules cancéreuses sur la glace avant l'injection.

3. Injection de cellules tumorales

1. Anesthésiez les souris mâles de 8 à 12 semaines (C57BL6) en administrant de la kétamine (150 mg/kg) et de la xylazine (12 mg/kg) par voie intrapéritone à l'aide d'une aiguille de 1 ml 25 G (0,5 mm x 16 mm).
2. Raser la peau abdominale des souris à l'aide de tondeuses pour éviter toute infection postopératoire.
3. Placez les souris sur le système de rétraction du fixateur magnétique. Confirmez que les souris sont complètement sous l'effet de l'anesthésie en pinçant un orteil ou la queue.
4. Ajouter des gouttes saline dans les yeux pour éviter la sécheresse pendant la procédure.
5. Frotter la solution povidone-iode (7,5%) à la paroi abdominale rasée pour désinfecter la peau avant de faire une incision chirurgicale.
6. Soulevez d'abord la peau avec les forceps dentés et faites une incision de midline avec l'aide des ciseaux chirurgicaux. Ensuite, soulevez le muscle abdominal et le péritoine pour créer une incision médiane d'environ 3 cm de longueur (processus midabdominal à xiphoïde pour exposer le contenu abdominal. Prenez garde de ne pas étendre l'incision au-delà du processus de xiphoïde pour éviter les saignements importants.
7. Placez l'hemostat des deux côtés de l'incision et sous le processus xiphoïde. Étendre l'abdomen en tirant la queue vers le bas et en l'encaignant. Utilisez l'applicateur de pointe de coton stérile de 6 pouces pour séparer et exposer la rate du tissu adipeux pancréatique.
8. Avant l'injection dans la rate, vortex les cellules cancéreuses pour éviter les amas cellulaires.
9. Utilisez une seringue à insuline de 0,5 ml 28 G (0,36 mm x 13 mm) pour l'injection. Évitez les bulles d'air.
10. Insufflez lentement et soigneusement 100 l de cellules dans la pointe de la rate. Placez une pointe de coton et ajoutez une légère pression pour éviter le reflux dans la région abdominale. Une injection réussie peut être observée en identifiant le changement de couleur du foie pendant l'injection.
11. Humidifiez une gaze stérile avec 1x PBS et placez-la sur le secteur disséqué.
12. Transférer les souris sur un coussin chauffant pendant 15 minutes pour permettre aux cellules cancéreuses de circuler dans le système.
13. Pour procéder à l'ischémie chirurgicale et aux dommages de réperfusion, suivez des étapes 5.3-5.10.
    REMARQUE : Cette procédure est d'étudier l'effet de l'établissement induit d'I/R des foyers métastatiques.

4. Splenectomy

1. Pour effectuer une splencectomie, utilisez un dispositif de cautérisation portatif. Soulevez soigneusement la rate avec des forceps lisses et cautérisez les vaisseaux sanguins spléniques pour éviter les saignements excessifs. Retirez la rate en transectant les vaisseaux à la section cautérisée.
2. Immédiatement après la procédure, fermer l'incision dans un modèle de double couche en sucisant d'abord la couche musculaire, puis la peau. Utilisez 4-0 sutures en polypropylène pour la paroi abdominale et la peau.
3. Avant de répéter la procédure sur un autre animal, désinfectez tous les instruments en les pulvérisant avec 70% d'isopropanol ou en les insérant dans un bain de perles.
4. Replacez les souris dans des cages d'origine et recherchez des signes de détresse et de douleur post-chirurgicale.
5. Injecter des analgésiques postopératoires (Buprenorphine 0,1 mg/kg) tous les 12 h pendant 2 jours pour éviter les douleurs post-chirurgicales.

5. Blessures de réperfusion d'ischémie

1. À 5 jours après la première laparotomie, anesthésiez les souris en administrant de la kétamine (150 mg/kg) et de la xylazine (12 mg/kg) par voie intrapéritone à l'aide d'une aiguille de 1 ml 25 G (0,5 mm x 16 mm). Suivez les étapes 3.3-3.4.
2. Frotter la solution povidone-iode (7,5%) sur l'abdomen rasé de la souris pour désinfecter la peau et effectuer une laparotomie de midline comme décrit ci-dessus dans l'étape 3.6.
3. À l'aide de deux bouts de coton humidifiés, déplacez doucement l'intestin de la cavité pour exposer les structures associées, y compris la veine du portail. Disséquer le hilum du foie libre du tissu environnant.
4. Soulevez les lobes médians et latéraux gauches contre le diaphragme. Séparez le lobe quadrate du lobe latéral gauche en disséquant le hilum du foie avec les ciseaux de ressort à l'aide d'un microscope opératoire pour permettre une visibilité claire vers la structure de la triade du portail.
5. Placez un petit coton humide entre le lobe médian et le lobe latéral droit pour créer suffisamment d'espace pour le serrage. À l'aide des forceps du dilatateur du navire, passez soigneusement le fil de 10 cm (4,0 suture en polypropylène) pour soulever la triade du portail. Occlude toutes les structures dans la triade de portail (artère hépatique, veine de portail, et conduit biliaire) aux lobes gaucheets de foie en plaçant une pince microvasculaire utilisant un applicateur de pince micro-serrefine avec la serrure.
6. Si les lobes ne montrent pas de blanchiment significatif, réajuster la pince en enlevant et en réappliquant.
   REMARQUE : Si le blanchiment immédiat du foie ne se produit pas même après avoir réajusté la pince, examinez attentivement s'il faut procéder ou non à l'I/R.
7. Retirer le petit coton-tige placé entre les lobes médians et les lobes latéraux droits. Remplacer délicatement l'intestin dans la cavité abdominale. Couvrir la paroi abdominale d'une gaze humide (trempée de 1x PBS) et couvrir d'une pellicule plastique pour minimiser la perte d'évaporation.
8. Placer la souris sur le coussin chauffant et appliquer la pince pendant une période de 60 min.
9. Tout au long de l'intervalle ischémique, recherchez l'évidence des dommages d'ischémie en visualisant le blanching pâle des lobes médial et latéral médial et gauche s'est prolaissé.
10. Initier la réperfusion en enlevant les pinces après la période de 60 min.
    REMARQUE : L'évidence de la reperfusion peut être observée par un changement immédiat de couleur des lobes latéraux médians et gauches.
11. Immédiatement après la réperfusion, fermez l'incision avec un modèle de suture à double couche en sucisant d'abord la couche musculaire, puis la peau. Utilisez la suture 4-0 en polypropylène à l'aide d'un porte-aiguille pour fermer la paroi abdominale et la peau.
12. Avant de répéter la procédure sur un autre animal, désinfectez tous les instruments en les pulvérisant avec 70% d'isopropanol ou en les insérant dans un bain de perles chauffés.
13. Replacez les souris dans des cages d'origine et recherchez des signes de détresse et de douleur post-chirurgicale.
14. Injecter des analgésiques postopératoires (0,1 mg/kg de buprénorphine) tous les 12 h pendant 2 jours pour éviter les douleurs post-chirurgicales.
15. Pour les souris de faux foie I/R, effectuer la laparotomie, dissection hilum et sutures abdominales.
    REMARQUE: Le rôle du stress chirurgical influençant l'établissement des métastases hépatiques peut être étudié à travers deux conceptions expérimentales différentes. Le protocole ci-dessus (Modèle-1) est utilisé pour établir une maladie hépatique micrométastatique et étudier l'effet du foie I/R sur leur croissance (Figure 1A). Alternativement, l'injection de foie I/R et de tumeur peut être exécutée simultanément (modèle-2) pour étudier l'effet des dommages d'I/R dans l'établissement de nouveaux foyers métastatiques (figure 1B). Pour ce faire, injecter des cellules cancéreuses dans la rate comme décrit ci-dessus et leur permettre de circuler pendant 15 min. Effectuer le foie I / R ou une chirurgie simulée après la période de circulation pendant 60 min. Effectuer splenectomy latérale 60 min plus tard, puis fermer l'incision laparotomy.

6. Évaluation des souris opérées

1. Pendant la procédure chirurgicale s'assurer que les souris sont sous l'influence de l'anesthésie de stade III en effectuant l'essai palpebral et cornéen de réflexe. Une dose anesthésique supplémentaire doit être administrée sur les signes de réflexes.
2. Fournir des analgésiques postopératoires (Buprenorphine 0,1 mg/kg) juste après la chirurgie et tous les 12 h pendant 2 jours pour éviter les douleurs post-chirurgicales.
3. Laissez les souris de 30 à 60 min de temps de récupération après l'anesthésie. Surveillez constamment les souris et ne les laissez pas sans surveillance jusqu'à ce qu'elles soient complètement guéries.
4. Recherchez les signes de détresse tels que le dos voûté, les yeux fermés, le mouvement lent et l'incapacité à se toiletter. Traiter en conséquence jusqu'à ce que les souris retournent à leur activité normale.
5. Les soins supplimental comprenant des fluides, la chaleur, l'agent d'inversion de Yohimbine pour la xylazine, la literie douce de serviette de papier (pour éviter l'aspiration) devraient être fournis après la chirurgie pour améliorer la période de rétablissement.

7. Évaluation des lésions de réperfusion d'ischémie hépatique

1. Immédiatement après l'application de la pince, assurez-vous que le blanchissement pâle des lobes latéraux médians et gauches se produit par rapport aux lobes de caudate et de quadrate.
2. Évaluer les lésions ischémiques hépatiques en mesurant les niveaux de transaminase d'alanine (sALT) de sérum, d'aspartate de sérum (sAST) et de lactate de lactate de séride (sLDH). Le sang peut être prélevé dans la veine faciale pour extraire le sérum de 3 à 6 h après l'initiation de la réperfusion. Effectuer l'histologie du foie pour analyser la zone de la tumeur pour cent dans le lobe ischémique.

Résultats

Toutes les souris de type sauvage (C57BL6) (n - 20) ont été soumises au modèle de métastases hépatiques en utilisant le protocole décrit ci-dessus. Toutes les souris injectées avec ou sans lésion de réperfusion d'ischémie ont survécu jusqu'à la date du sacrifice. Le diagramme schématique Figure 1A d'un foie cancéreux illustre le serrage de la triade du portail (artère hépatique, veine de portail, et canal biliaire) qui induit un ischémique partiel de foie (70%) insulter les lobes latéraux mé...

Discussion

Le modèle animal décrit dans ce manuscrit est basé sur deux approches principales. La première est de reconnaître la capacité des cellules cancéreuses à localiser et à proliférer dans les lobes du foie. La deuxième est d'étudier l'effet des dommages hépatiques de reperfusion d'ischémie influençant la croissance et les métastases de tumeur. Ce modèle permet l'étude pertinente des métastases hépatiques en l'absence de métastases secondaires chez une souris immunocompétente. Le modèle est utile pour aborder les questions de...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Lonza	12-614F
Sérum fœtal bovin	Lonza	900-108
L-Glutamin	Gibco	25030-081
Pénicilline	Fisher scientifique	15-140-122
Stretomysin	Fisher scientifique	15-140-122
HEPES	Fisher Scientific
Trypsin	Hyclone	sh30042.02
Flacon de culture cellulaire 75cm	5 cellules Star	658170
15ml PP Tubes Coniques	BioExcell	41021037
Trypan Blue Stain	Giibco	15250-061
Gaze	Fisherbrand	1376152
Cautry	Bovie	AA01
Pince microvasculaire	Outils Finescience	18055-03
Micro-Serrefin pince applicatrice avec serrure	Fine science toosl	FST-18056-14
Ciseaux à ressort	Fine science toosl	FST-15021-15
Dilatateur de récipient	Fine science toosl	FST-00276-13
Fixateur magnétique Système de rétraction	Fine science toosl	FST-18200020
Pince Micro-Adson	Fine science toosl	FST-11019-12
Pince Micro-Adson	Fine science toosl	FST-11018-12
4-0 suture en polypropylène	Ethicon	K881H
Porte-aiguille	Harvard Apparatus	72-8826
Coussin chauffant	Fisher scientific
Clipper	Oster	559A
Povidone-Iodine solution	Medline	MDS093945
Seringue 1ml 25G	BD safety Glide	305903
Seringue à insuline 0,5 ml	BD Seringues à insuline	32946
Applicateur à pointe de coton	Fisher Scientific	23-400-101
Chirurgical Microscope	Leica	LR92240
Mycoplasma Elisa Kit	Roche	11663925910
Kétamine	Putney	#056344
Xylazine	NADA	#139-236
Bande ALT	Heska	15809554
Bande AST	Heska	15809542
Bande LDH	Heska	15809607

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