Amputation et régénération des chiffres de souris adultes : un modèle simple pour étudier la formation d'blastema de mammifères et l'ossification intramembrane

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de l'amputation de phalange terminale de souris adulte pour étudier la formation de blastma de mammifères et l'ossification intramembrane, analysée par l'immunohistochemistry fluorescent et la tomographie microcomputed in-vivo séquentielle.

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de la phalange terminale adulte de souris (P3) amputation, un modèle mammifère procéduralement simple et reproductible de régénération épimorphe, qui implique la formation de blastma et l'ossification intramembrane analysée par immunohistochemistry de fluorescence et tomographie microcomputée in vivo séquentielle (CT). La régénération des mammifères est limitée aux amputations transectant la région distale de la phalange terminale (P3); les chiffres amputés à des niveaux plus proximal s'échouent et subissent la guérison fibrotique et la formation de cicatrices. La réponse de régénération est médiée par la formation d'un blastème proliférant, suivi de la régénération d'os par l'ossification intramembrane pour reconstituer la longueur squelettique amputée. L'amputation de P3 est un modèle préclinique pour étudier la régénération épimorphique chez les mammifères, et est un outil puissant pour la conception des stratégies thérapeutiques pour remplacer la guérison fibrotique par une réponse régénérative réussie. Notre protocole utilise l'immunohistochimie de fluorescence pour 1) identifier les populations tôt et tard de cellules de blastma, 2) la revascularisation d'étude dans le contexte de la régénération, et 3) étudier l'ossification intramembrane sans avoir besoin d'os complexe dispositifs de stabilisation. Nous démontrons également l'utilisation de l'in vivo séquentiel pour créer des images haute résolution pour examiner les changements morphologiques après l'amputation, ainsi que pour quantifier les changements de volume et de longueur dans le même chiffre au cours de la régénération. Nous croyons que ce protocole offre une utilité énorme pour étudier les réponses épimorphiques et régénératrices tissulaires chez les mammifères.

Introduction

Les mammifères, y compris les humains et les souris, ont la capacité de régénérer les pointes de leurs chiffres après l'amputation distale de la phalange terminale (P3)^1,2^,3. Chez la souris, la réponse de régénération est dépendante de l'amputation; les amputations de chiffre de plus en plus proximales affichent une réponse régénérative progressivement atténuée jusqu'à l'échec régénératif complet aux amputations transectant et proximal à la matrice d'ongle de P3^{4,5,6 ,}

Protocole

Toutes les techniques et l'utilisation des animaux étaient conformes aux procédures d'exploitation standard du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Texas A et M.

1. Adulte Souris Hind Limb Distal P3 Amputation

1. Anesthésiez une souris CD-1 de 8 à 12 semaines (Tableaudes matériaux)en utilisant du gaz isoflurane dans l'oxygène; d'abord anesthésier à 3% dans une chambre, suivie de 2% isoflurane fourni par un cône de nez sur la durée de la chirurgie. Appliquer un onestorme ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
   REMARQUE: Les études....

Résultats

La souris adulte régénérant des chiffres P3 à 6/7 DPA (Figure 2A-D), 9 DPA (Figure 2E-H), et 10 DPA (Figure 2I-L) ont été immunostained avec des anticorps à Runx2, OSX, et PCNA pour visualiser l'os intramembrane la régénération, et immunostained avec des anticorps à CXCR4 et vWF pour visualiser la formation de blastma. Les rendus représentatifs de la CT des chiffres numérisés avant .......

Discussion

Ce protocole décrit une procédure normalisée de l'amputation distale de P3 de souris adulte, de la coloration immunohistochemical fluorescente pour visualiser et étudier la formation de blastma et l'ossification intramembrane, et le balayage in-vivo séquentieux de CT à identifier les changements morphologiques, de volume et de longueur d'os après l'amputation. L'amputation de P3 est un modèle unique, procéduralement simple, et reproductible pour analyser un environnement pro-régénératif de blessure qui déclenche la forma.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Protein Block Serum Free	DAKO	X0909	Prêt à l’emploi
Souris anti-PCNA	anticorps Abcam	ab29	dilution 1:2000
Rat anti-CXCR4 anticorps	R& D Systems	MAB21651	dilution 1:500
Anticorps vWF XIII anti-humain	DAKO	A0082	Dilution 1:800
Anti-osterix lapin, anticorps SP7	Abcam	ab22552	dilution 1:400
Anticorps anti-Runx2	Sigma-Aldrich Co.	HPA022040	dilution 1:250
Alexa Fluor 647 chèvre conjuguée anti-souris IgG (H+L)	Invitrogen	A21235	dilution 1:500
Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG (H+L)	Invitrogen	A11008	dilution 1:500
Alexa Fluor 568 chèvre conjuguée anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077	dilution 1:500
Réactif	anti-décoloration Prolong GoldInvitrogen	P36930	Prêt à l’emploi
Surgipath Décalicificateur 1	Leica Biosystems	3800400	Prêt à l’emploi
Z-Fix, fixateur aqueux de zinc et de formol tamponné aqueux	Anatech LTD	174	Prêt à l’emploi
CD-1 Souris femelle	Envigo	ICR(CD-1)	8-12 semaines
vivaCT 40	SCANCO Medical