Mesure de bk-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Summary

Dans ce manuscrit, un protocole est présenté pour effectuer la mesure FACS-basée de bk-polyomavirus activité transcriptionnelle en utilisant des cellules HEK293T transfecté avec un plasmide journaliste bidirectionnel exprimant tdTomato et eGFP. Cette méthode permet en outre de déterminer quantitativement l'influence de nouveaux composés sur la transcription virale.

Abstract

Les polyomavirus, comme le BK-polyomavirus (BKPyV), peuvent causer des pathologies graves chez les patients immunodéprimés. Cependant, comme les antiviraux très efficaces ne sont pas disponibles à l'heure actuelle, des méthodes mesurant l'impact des agents antiviraux potentiels sont nécessaires. Ici, un journaliste à double fluorescence qui permet l'analyse de la région témoin non codante BKPyV (NCCR) conduite tôt et tardivement par l'activité de promoteur a été construit pour quantifier l'impact des médicaments antiviraux potentiels sur l'expression des gènes viraux par l'intermédiaire de tdTomato et eGFP expression. En outre, en clonant des amplicons de BKPyV-NCCR qui dans ce protocole ont été exemplarily obtenus à partir de l'ADN blood-dérivé des patients transplantés rénaux immunocompromis, l'impact des NCCR-réarrangements sur l'expression virale de gène peut être déterminé. Après clonage des amplicons dérivés de patient, les cellules de HEK293T ont été transfected avec les reporter-plasmides, et traitées avec des agents antiviraux potentiels. Par la suite, des cellules ont été soumises à l'analyse FACS pour mesurer les intensités moyennes de fluorescence 72 h après la transfection. Pour tester également l'analyse des médicaments qui ont un effet inhibiteur du cycle cellulaire potentiel, seules les cellules transfectées et donc fluorescentes sont utilisées. Puisque cet analyse est effectué dans de grandes cellules exprimant estomnons de T Antigène, l'impact de l'expression tôt et tard peut être analysé d'une manière mutuellement indépendante.

Introduction

Les polyométavirus représentent une famille indépendante de petits virus de l'ADN à double brin (ADN) avec le virus Simian 40 (SV40) comme espèce prototype. L'infection primaire se produit principalement pendant l'enfance, qui procèdent habituellement sans symptômes de maladie et causent habituellement des infections latentes dans les hôtes immunisés compétents. Le BK-polyomavirus (BKPyV) persiste principalement dans les cellules rénales de tubules sans causer des nephropathologies, cependant, en cas de affaiblissement de la immuno-compétence après transplantation rénale le virus peut réactiver et causer des dommages graves et la greffe altérée fonction lors de l'atteinte d'une virémie élevée (1 x 10⁴ copies d'ADN BKPyV/mL)^1,2. Chez environ 10 % des receveurs de greffe sinain, la réactivation du BK-polyomavirus (BKPyV) entraîne une néphropathie associée au polyomavirus (PyVAN), qui était jusqu'à 80 % associée à un risque élevé d'échecs d'allogreffe rénale^3,4 . Comme aucun antiviral approuvé n'est disponible, le traitement actuel est basé sur la réduction de l'immunosuppression. Fait intéressant, les inhibiteurs de mTOR semblent avoir un effet antiviral ; ainsi, le passage de la thérapie immunosuppressive à l'immunosuppression mTOR-basée pourrait représenter une approche alternative pour empêcher la progression de la virémie de BKPyV^5,6,7. Cependant, le mécanisme antiviral à base de mTOR est actuellement encore incomplet. Ainsi, des méthodes mesurant l'impact d'agents antiviraux potentiels dans des concentrations cliniquement pertinentes sont nécessaires.

Le génome circulaire du BKPyV se compose d'environ 5 kb abritant une région de contrôle non codante (NCCR) qui sert d'origine de la réplication et, en même temps, un promoteur bidirectionnel conduisant à l'expression des transcriptions de l'ARNm de phase précoce et tardive. Puisque les réarrangements, les suppressions et les duplications spontanément se produisant NCCR se trouvent dans LE BKPyV⁸ pathogène et significativement accumulés dans les patients souffrant de PVAN^5,9, une comparaison de l'archétype (wt) et les activités du NCCR réarrangées (rr) sont utiles pour caractériser la condition physique répliquif virale.

Comme résumé à la figure 1, ce protocole décrit une méthode couramment utilisée pour mesurer l'activité transcriptionnelle DU RNC DE BKPyV en quantifiant la fluorescence de deux fluorophores tdTomato et eGFP exprimées à partir d'un plasmide de journaliste^{5, 9,10,11}. La procédure est effectuée en présence de l'antigène T sV40 grand (lTAg), qui permet d'analyser l'impact des agents antiviraux potentiels sur le début et la fin NCCR-activité séparément⁵. Cet analyse analyse davantage l'impact des réarrangements sur l'activité du NCCR et la comparaison avec les Wt-NCCRs^5,9. Le plasmide de journaliste héberge le signal de polyadenylation en retard de SV40 en aval de chaque cadre de lecture ouvert de fluorophore pour assurer le traitement comparable et efficace des deux transcriptions pour tdTomato et eGFP, respectivement. Comparé e aux méthodes qRT-PCR^5,12, cette approche basée sur le FACS représente une alternative compatible à faible coût et à haut débit puisqu'aucun protocole d'extraction compliqué pour la culture cellulaire infectée et aucun coût des anticorps pour la coloration de fluorescence immunisée sont nécessaires. En outre, puisqu'une quantité définie de cellules fluorescentes sont analysées par cytométrie de flux, l'analyse des agents inhibiteurs du cycle cellulaire est également possible d'une manière quantitative.

Protocol

Ce protocole suit les lignes directrices de la recherche humaine approuvées par le comité éthique de la faculté de médecine de l'Université de Duisburg-Essen (14-6028-BO).

1. Collecte d'échantillons de sang ou d'urine et isolement de l'ADN du polyomavirus

1. Recueillir au moins 3 ml de sang dans les tubes EDTA ou l'urine dans les tubes d'acquisition.
2. Centrifuger l'échantillon à 2 500 x g pendant 15 min. Au besoin, pipette plasma dans un nouveau tube et stocker les échantillons de plasma à 4 oC pendant plusieurs jours ou congeler à -20 oC pour un stockage plus long.
3. Préparer 40 l de protéinase K dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml et ajouter 400 l de plasma par pipetting.
4. Lyse l'échantillon en ajoutant 400 ll de tampon de lyse, vortex pour 15 s, et incuber pendant 10 min à 56 oC.
5. Isolez l'ADN à l'aide d'une trousse d'extraction de sang d'ADN décrite dans les instructions du fabricant. En bref, ajouter de l'alcool et charger les lysates sur une colonne de spin contenant une membrane à base de silice liant l'ADN. Laver les colonnes plusieurs fois pour produire de l'ADN pur.
6. Éluter l'ADN produit dans 30-50 L de tampon TE.

2. Amplification de la région de contrôle non codante (NCCR)

1. Effectuez la procédure suivante dans des pièces physiquement séparées. Utilisez une pièce isolée pour préparer les réactifs et distribuer le mélange aux tubes PCR.
2. Préparer le Master Mix pour le pré-PCR à l'aide de la paire amorce A (tableau 1) dans un volume total de 50 L et utiliser l'ADN précédemment isolé de l'étape 1.6. Le schéma de pipetage pour la préparation du mix maître pour le PCR pré et imparable est imprimé dans le tableau 2.
3. Distribuer 45 L du mélange maître dans les tubes PCR.
4. Ajouter 5 L de l'ADN isolé dans les tubes PCR.
   REMARQUE : Utilisez une autre pièce que celle pour la préparation du mélange principal afin d'éviter la contamination.
5. Exécuter le PCR avec les conditions de réaction comme illustré dans le tableau 3. Répéter la dénaturation, l'annexion et l'extension en 35 cycles.
6. Pour l'amplification imisée utiliser la paire d'apprêt B hébergeant les sites de restriction pour AgeI et SpeI (tableau 1).
7. Exécuter le PCR inodu avec les conditions de réaction décrites dans les étapes 2.2 à 2.5 en utilisant 5 'L du pré-PCR.
8. Mélanger 10 L du produit PCR avec 2 l l de colorant de chargement de gel 6x. Chargez 10 l l du mélange sur un gel d'agarose de 1,5 % et faites fonctionner le gel pendant 30 min à 60 mA.
9. Visualisez le gel à l'aide d'un système de documentation UV approprié.
   REMARQUE : On s'attend à ce que la taille de l'amplicon se situe entre 300 et 500 pb selon qu'il y a eu des réarrangements (suppressions, insertions ou duplications) (figure2C).
10. Purifez les amplicons PCR à l'aide d'un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Elute les amplicons PCR en 30 L de tampon d'élution.
11. Envoyer les amplicons pour le séquençage Sanger à l'aide de la paire d'amorce B.

3. Clonage du NCCR dans le journaliste à double fluorescence

1. Diglesles purifiés amplicons (étape 2.10) avec AgeI et SpeI pendant 2 h à 37 oC comme décrit dans le tableau 4.
2. Répétez l'étape 2.10 et purifiez les amplicons digérés.
3. En parallèle, digérez également l'épine dorsale plasmique (1,5 g) avec AgeI et SpeI pendant 2 h à 37 oC, tel que décrit dans le tableau 5. Cette étape n'a besoin d'être effectuée qu'une seule fois. Pour les réactions ultérieures, congeler la digestion à -20 oC.
4. Analyser l'épine dorsale plasmique digérée sur un gel agarose à faible fonte de 0,8 %.
   REMARQUE: Ne pas exécuter le gel avec un courant supérieur à 40 mA. L'encart attendu de la région de l'espaceur à l'origine dérivé du plasmien pEX-K4 2-LTR CD3¹³ est de 128 pb (figure 2C).
5. Visualisez les fragments d'ADN à l'aide de la lumière UV à ondes longues (320 nm) et découpez la bande dorsale à l'aide d'un scalpel propre. Transférer le fragment de gel à faible fusion dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml. Évitez les longs temps d'exposition aux UV pour prévenir les dommages à l'ADN.
   REMARQUE : Étant donné que l'agarose à faible fonte est utilisée, il n'est pas nécessaire de purifier l'ADN avant la ligature.
6. Chauffer l'épine dorsale contenant la pièce d'agarose à faible fonte pendant 10 min à 65 oC afin de faire fondre le morceau de gel et mélanger toutes les 2 min par un vortex doux. Le gel fondu peut être directement utilisé pour la ligature.
7. Ligate l'épine dorsale et l'amplicon digéré en utilisant t4 d'ADN ligase pendant la nuit à 16 oC en utilisant le schéma montré dans le tableau 6.
8. Effectuer la transformation de E. coli en utilisant la méthode de choc thermique, les bactéries de plaque sur les plaques LB-ampères, et la culture à 37 oC pendant la nuit.
9. Le lendemain, sélectionnez trois clones positifs et préparez la culture E. coli (5 ml de LB-Amp) et la culture à 37 oC.
10. Isolez le plasmide-ADN à l'aide de protocoles standard tels que décrits ailleurs¹⁴, effectuer la digestion AgeI et SpeI pour vérifier les clones positifs et visualiser les fragments découpés sur un gel agarose 1%. La bande de l'espaceur (128 pb) sera remplacée par la plus grande séquence DuCR (300-500 pb, voir ci-dessus).
11. Envoyer le plasmide pour le séquençage Sanger à l'aide de l'amorce EGFP-N ou de la paire d'amorce B (tableau 1).
12. Puisque les mutations pourraient se produire spontanément, comparez les résultats de séquençage avec les résultats de séquençage obtenus avec l'amplicon. N'utilisez que les clones contenant des séquences identiques par rapport à l'amplicon.
13. Utiliser un logiciel d'établi moléculaire (p. ex., freeware GENtle 1.9.4 ou d'autres programmes d'édition de séquences) pour aligner et modifier les séquences obtenues (figure 3).
14. Démarrez GENtle 1.9.4 et importez les séquences d'ADN en cliquant sur le bouton Import (flèche vers le bas verte).
15. Cliquez ensuite sur L'outil et sélectionnez L'alignement du menu (Utilisez Ctrl-G comme raccourci) et choisissez les séquences d'ADN pour l'alignement.
16. Ajoutez une séquence à l'alignement en cliquant sur Ajouter ou supprimer une séquence en cliquant sur Supprimer. Inclure une séquence de consensus NCCR archétypale comme JN192438¹⁵, n'utilisez pas la séquence NCCR de la souche Dunlop couramment utilisée¹⁶, car il abrite des réarrangements et duplications autres que l'archétype BKPyV Souches.
    REMARQUE : Le NCCR contient déjà le codon de démarrage translationnel (figure 3).
17. Choisissez une méthode pour l'alignement en cliquant sur algorithme dans la barre d'outils et choisissez clustal W. Définir les paramètres d'alignement pour correspondre à 2; pénalité d'extension de l'écart -1; pénalité d'écart -2 et cliquez sur OK pour exécuter l'alignement.

4. Transfection transitoire des cellules HEK293T avec le plasmide du journaliste et traitement avec des agents antiviraux potentiels

1. Pour préparer des quantités suffisantes d'ADN plasmide pour les expériences de transfection ultérieures préparer une culture de 150 ml pendant la nuit. Isolez l'ADN plasmide à l'aide d'un kit d'isolement plasmide. Alternativement, d'autres kits de purification plasmique peuvent être utilisés.
2. Graines 1 x 10⁵ cellules HEK293T dans le DMEM contenant 10 % de FCS, de pénicilline et de streptomycine (1x) par puits d'une plaque de 12 puits 24 h avant la transfection et incuber pendant la nuit à 37 oC et 5 % de CO₂ pour maintenir la prolifération active pendant la transfection.
   REMARQUE : Les cellules doivent être environ 80 % de confluents lors de la transfection.
3. Placer 250 l de milieux sériques réduits dans un tube stérile et ajouter 1 g d'ADN plasmide de chaque journaliste et mélanger délicatement par pipetting.
4. Ajouter 3 ll du réactif transfection au mélange d'ADN, mélanger délicatement par pipetting et incuber pendant 15 min. Préchauffer le réactif transfection à la température ambiante de 22 oC et le vortex doucement avant utilisation.
5. Ajouter le mélange goutte-sage pour les puits et distribuer délicatement au puits.
6. Après 4 h, remplacer le supernatant par un milieu frais contenant les agents d'essai et le contrôle des solvants. Incuber à 37 oC jusqu'à l'analyse. Dans cet exemple, les inhibiteurs de mTOR INK128 (100 ng/mL) et la rapamycine (100 ng/mL) ont été utilisés.

5. Microscopie de fluorescence et cytométrie de flux

1. Vérifier la présence de la fluorescence rouge et verte chez les cellules rouges et vertes sous le microscope à fluorescence (figure 4).
   REMARQUE : La fluorescence rouge et verte correspond à l'expression précoce et tardive du gène BKPyV, respectivement.
2. Après 72 h après la transfection, aspirez le supernatant et lavez les cellules deux fois avec 1 ml de PBS froid.
3. Ajouter délicatement 500 l de trypsine et tourner légèrement la plaque pour éviter le détachement prématuré des cellules. Cette étape est importante pour éviter les doublets cellulaires.
4. Après plus, retirez la trypsine directement avec la même pointe de pipette.
5. Incuber les cellules pendant au moins 5 min à 37 oC.
6. Resuspendre les cellules trypsinisées avec 1 ml de PBS contenant 3% de FCS et transférer la suspension dans des tubes FACS pré-étiquetés.
7. Ajouter le DAPI (1 g/mL) avant l'analyse FACS.
8. Analyser les cellules à l'aide d'un cytomètre de débit. Pour chaque échantillon, mesurez au moins 10 000 cellules vivantes, qui sont négatives pour la coloration DAPI.

6. Analyse des données

1. Importer les données au logiciel d'analyse de cytométrie de flux et ajouter des échantillons par Click and Drag dans l'espace de travail.
2. Double cliquez sur le fichier importé et créez une parcelle graphique. Choisissez FSC-A contre SSC-A en cliquant sur l'axe x et y. Portez la population cellulaire principale en cliquant sur Polygone à la barre d'outils et en encadrant la population cellulaire (figure 5). Nommez la population cellulaire choisie au besoin (par exemple les « cellules uniques »). Les «cellules uniques» apparaîtront comme un nouvel espace de travail.
3. Procédez avec le gating "cellules uniques" pour DAPI négatif (c.-à-d., "cellules vivantes"). Pour identifier les cellules vivantes comparer la population cellulaire avec et sans coloration DAPI. Dans les deux parcelles, choisissez FSC-A contre pacific-blue-A.
4. Cliquez sur le rectangle et choisissez la population de cellules négatives DAPI, nommez la population cellulaire choisie « cellules vivantes », et créez une nouvelle parcelle de points montrant FITC (eGFP) contre PE (tdTomato) comme décrit précédemment.
5. Ajouter des quadrants dans les « cellules vivantes » en choisissant Quad à partir de la barre d'outils. Portez la population en faisant glisser le centre du quadrant au bord de chaque population. Les quadrants représentent 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOMMD, 3) eGFP-tdTOM-, 4) eGFP-tdTOMMD.
   REMARQUE : En raison de la pari spectrale des spectres d'émission entre le FITC et le PE, la compensation initiale est essentielle pour distinguer les signaux rouges et verts et obtenir des résultats précis.
6. Déterminer les intensités moyennes de fluorescence (IMF) en cliquant à droite sur le quadrant et en choisissant Add Statistics. Choisissez Moyen et cliquez sur OK. L'IMF moyenne est maintenant affichée en dessous de la population dans la section «statistiques». Les quadrants 2 et 4 correspondent à l'expression précoce, tandis que les quadrants 3 et 4 représentent l'expression tardive.
7. Ajoutez des répliques supplémentaires de la même manière pour la puissance statistique.
8. Pour l'interprétation des données, tracer les valeurs de l'IMF du début et de la fin dans une parcelle de barre :
9. Pour comparer les activités du CnrC obtenues à partir de différents donneurs ou souches virales, ajoutez un contrôle archétypale ou la souche Dunlop¹⁶ et fixez ses IMF relatives à 100 % et calculez les valeurs relatives de l'IMF. Répétez avec chaque réplique et déterminez l'écart entre la moyenne et la norme.
10. Pour évaluer l'effet des composés potentiels sur l'activité transcriptionnelle, fixez le contrôle du solvant à 100 % et tracez l'IMF des cellules traitées.

Results

Dans cette expérience représentative, l'activité transcriptionnelle pilotée par la région de contrôle non codant de BK-polyomavirus a été mesurée par cytométrie de flux. En outre, un inhibiteur de mTOR, qui pourrait être employé pour traiter des patients après la réactivation de BKPyV, a été examiné pour son inhibition de l'expression tôt virale de gène. À cette fin, un double dis-t-il de fluorescence-reporter a été employé comme édité précédemment⁵. Le schéma glob...

Discussion

Dans cet article, une méthode couramment utilisée est présentée qui permet l'analyse de la BKPyV non-codage de contrôle-région (NCCR) conduit début et tard l'activité du promoteur. L'activité du NCCR peut être mesurée simultanément et n'a pas besoin de lyse des cellules transfectées. En outre, un nombre relativement important de cellules peut être analysée et la co-transfection de marqueurs supplémentaires pour la normalisation des valeurs de fluorescence n'est pas nécessaire.

Une partie criti...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Échelle de 100 bp	NEB	N3231	Toute échelle d’une portée allant jusqu’à 1 kb peut être remplacée
une échelle à 2 bûches	NEB	N0550	Toute échelle d’une portée allant jusqu’à 10 kb peut être remplacée
par Agar-Agar, Kobe I	Carl Roth	5210.3
AgeI-HF	NEB	R3552
Ampicilline Natriumsalz Cellpure	Carl Roth	HP62.1
Aqua ad iniectabilia	Bbraun	2351744	peut être substitué par n’importe quel fabricant
BD FACSCanto&trade ; II	BD Biosciences
BD FACSDiva	BD Biosciences
DAPI	Sigma	10236276001
DFC450C module de caméra	Leica		N’importe quelle caméra peut être utilisée
DMEM	Gibco	41966-029	peut être remplacée par n’importe quel fabricant
Microscope LED DMIL	Leica		N’importe quel microscope à fluorescence peut être utilisé
DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	peut être remplacé par n’importe quel fabricant
E.coli DH5alpha Competent Cells	Thermo Scientific	18258012
FBS Superior	MerckMillipore	50615	N’importe quel FBS peut être utilisé
FlowJo v10.5.3	FlowJo, LLC		N’importe quel logiciel de cytométrie en flux FBS peut être utilisé
Gel Loading Dye, Purple (6X)  ;	NEB	B7024	Tout colorant de charge 6x peut être substitué
HEK293T cellules	ATCC	11268	Ces cellules expriment constitutivement l’antigène T du virus simien 40 (SV40), et le clone 17 a été sélectionné spécifiquement pour sa grande transfectabilité.
L’incubateur CO2 HERAcell® ; 240i	Thermo Scientific		peut être remplacé par n’importe quel fabricant
Kit PCR HotStar	Qiagen
		Tout système de visualisation pour l’ADN coloré contenant des gels d’agarose peut être utilisé
Opti-MEM	Invitrogen	31985070	peut être substitué par n’importe quel fabricant
pBKV (34-2)	ATCC	45025	hébergeant le génome complet de la souche Dunlop de BKPyV ; a été utilisé comme témoin positif ; Séquence d’ADN selon : KP412983
PBS	Gibco	14190-136
Cycleur PCR MJ Mini 48-Well Personal Cycler	Bio-Rad	produit discontinué	Tout thermocycleur peut être utilisé
Mélange de nucléotides PCR, 10	mM Promega	#C1145	peut être remplacé par n’importe quel fabricant
PCR1 et PCR2 Amorces	métabion	non applicable	Dessalé. Diluer à (10 & micro ; M) avec de l’eau de qualité PCR
PenStrep (100x)	Gibco	15140-122	peut être substitué par n’importe quel fabricant
Roti® ;-GelStain	Carl Roth	3865	Un colorant basé sur la fluorescence pour la mesure de la concentration d’ADNdb
SpeI-HF	NEB	R3133
T4-DNA Ligase	NEB	M0202
TransIT LT1	Mirus	MIR2300
Trypsine 0.05 % - EDTA	Gibco	25300-054	peut être substitué par n’importe quel fabricant
ZymoPURE II Plasmid Kit	Zymo	D4201	peut être substitué par n’importe quel fabricant