Mesure de bk-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Résumé

Dans ce manuscrit, un protocole est présenté pour effectuer la mesure FACS-basée de bk-polyomavirus activité transcriptionnelle en utilisant des cellules HEK293T transfecté avec un plasmide journaliste bidirectionnel exprimant tdTomato et eGFP. Cette méthode permet en outre de déterminer quantitativement l'influence de nouveaux composés sur la transcription virale.

Résumé

Les polyomavirus, comme le BK-polyomavirus (BKPyV), peuvent causer des pathologies graves chez les patients immunodéprimés. Cependant, comme les antiviraux très efficaces ne sont pas disponibles à l'heure actuelle, des méthodes mesurant l'impact des agents antiviraux potentiels sont nécessaires. Ici, un journaliste à double fluorescence qui permet l'analyse de la région témoin non codante BKPyV (NCCR) conduite tôt et tardivement par l'activité de promoteur a été construit pour quantifier l'impact des médicaments antiviraux potentiels sur l'expression des gènes viraux par l'intermédiaire de tdTomato et eGFP expression. En outre, en clonant des amplicons de BKPyV-NCCR qui dans ce protocole ont été exemplarily obtenus à partir de l'ADN blood-dérivé des patients transplantés rénaux immunocompromis, l'impact des NCCR-réarrangements sur l'expression virale de gène peut être déterminé. Après clonage des amplicons dérivés de patient, les cellules de HEK293T ont été transfected avec les reporter-plasmides, et traitées avec des agents antiviraux potentiels. Par la suite, des cellules ont été soumises à l'analyse FACS pour mesurer les intensités moyennes de fluorescence 72 h après la transfection. Pour tester également l'analyse des médicaments qui ont un effet inhibiteur du cycle cellulaire potentiel, seules les cellules transfectées et donc fluorescentes sont utilisées. Puisque cet analyse est effectué dans de grandes cellules exprimant estomnons de T Antigène, l'impact de l'expression tôt et tard peut être analysé d'une manière mutuellement indépendante.

Introduction

Les polyométavirus représentent une famille indépendante de petits virus de l'ADN à double brin (ADN) avec le virus Simian 40 (SV40) comme espèce prototype. L'infection primaire se produit principalement pendant l'enfance, qui procèdent habituellement sans symptômes de maladie et causent habituellement des infections latentes dans les hôtes immunisés compétents. Le BK-polyomavirus (BKPyV) persiste principalement dans les cellules rénales de tubules sans causer des nephropathologies, cependant, en cas de affaiblissement de la immuno-compétence après transplantation rénale le virus peut réactiver et causer des dommages graves et la greffe altérée fonction lors de l'atte....

Protocole

Ce protocole suit les lignes directrices de la recherche humaine approuvées par le comité éthique de la faculté de médecine de l'Université de Duisburg-Essen (14-6028-BO).

1. Collecte d'échantillons de sang ou d'urine et isolement de l'ADN du polyomavirus

1. Recueillir au moins 3 ml de sang dans les tubes EDTA ou l'urine dans les tubes d'acquisition.
2. Centrifuger l'échantillon à 2 500 x g pendant 15 min. Au besoin, pipette plasma dans un nouveau tube et stocker les échantillons de plasma à 4 oC pendant plusieurs jours ou congeler à -20 oC pour un stockage plus long.
3. Préparer 40 l de protéinase K dans un tu....

Résultats

Dans cette expérience représentative, l'activité transcriptionnelle pilotée par la région de contrôle non codant de BK-polyomavirus a été mesurée par cytométrie de flux. En outre, un inhibiteur de mTOR, qui pourrait être employé pour traiter des patients après la réactivation de BKPyV, a été examiné pour son inhibition de l'expression tôt virale de gène. À cette fin, un double dis-t-il de fluorescence-reporter a été employé comme édité précédemment⁵. Le schéma glob.......

Discussion

Dans cet article, une méthode couramment utilisée est présentée qui permet l'analyse de la BKPyV non-codage de contrôle-région (NCCR) conduit début et tard l'activité du promoteur. L'activité du NCCR peut être mesurée simultanément et n'a pas besoin de lyse des cellules transfectées. En outre, un nombre relativement important de cellules peut être analysée et la co-transfection de marqueurs supplémentaires pour la normalisation des valeurs de fluorescence n'est pas nécessaire.

Une partie criti.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Échelle de 100 bp	NEB	N3231	Toute échelle d’une portée allant jusqu’à 1 kb peut être remplacée
une échelle à 2 bûches	NEB	N0550	Toute échelle d’une portée allant jusqu’à 10 kb peut être remplacée
par Agar-Agar, Kobe I	Carl Roth	5210.3
AgeI-HF	NEB	R3552
Ampicilline Natriumsalz Cellpure	Carl Roth	HP62.1
Aqua ad iniectabilia	Bbraun	2351744	peut être substitué par n’importe quel fabricant
BD FACSCanto&trade ; II	BD Biosciences
BD FACSDiva	BD Biosciences
DAPI	Sigma	10236276001
DFC450C module de caméra	Leica		N’importe quelle caméra peut être utilisée
DMEM	Gibco	41966-029	peut être remplacée par n’importe quel fabricant
Microscope LED DMIL	Leica		N’importe quel microscope à fluorescence peut être utilisé
DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	peut être remplacé par n’importe quel fabricant
E.coli DH5alpha Competent Cells	Thermo Scientific	18258012
FBS Superior	MerckMillipore	50615	N’importe quel FBS peut être utilisé
FlowJo v10.5.3	FlowJo, LLC		N’importe quel logiciel de cytométrie en flux FBS peut être utilisé
Gel Loading Dye, Purple (6X)  ;	NEB	B7024	Tout colorant de charge 6x peut être substitué
HEK293T cellules	ATCC	11268	Ces cellules expriment constitutivement l’antigène T du virus simien 40 (SV40), et le clone 17 a été sélectionné spécifiquement pour sa grande transfectabilité.
L’incubateur CO2 HERAcell® ; 240i	Thermo Scientific		peut être remplacé par n’importe quel fabricant
Kit PCR HotStar	Qiagen
		Tout système de visualisation pour l’ADN coloré contenant des gels d’agarose peut être utilisé
Opti-MEM	Invitrogen	31985070	peut être substitué par n’importe quel fabricant
pBKV (34-2)	ATCC	45025	hébergeant le génome complet de la souche Dunlop de BKPyV ; a été utilisé comme témoin positif ; Séquence d’ADN selon : KP412983
PBS	Gibco	14190-136
Cycleur PCR MJ Mini 48-Well Personal Cycler	Bio-Rad	produit discontinué	Tout thermocycleur peut être utilisé
Mélange de nucléotides PCR, 10	mM Promega	#C1145	peut être remplacé par n’importe quel fabricant
PCR1 et PCR2 Amorces	métabion	non applicable	Dessalé. Diluer à (10 & micro ; M) avec de l’eau de qualité PCR
PenStrep (100x)	Gibco	15140-122	peut être substitué par n’importe quel fabricant
Roti® ;-GelStain	Carl Roth	3865	Un colorant basé sur la fluorescence pour la mesure de la concentration d’ADNdb
SpeI-HF	NEB	R3133
T4-DNA Ligase	NEB	M0202
TransIT LT1	Mirus	MIR2300
Trypsine 0.05 % - EDTA	Gibco	25300-054	peut être substitué par n’importe quel fabricant
ZymoPURE II Plasmid Kit	Zymo	D4201	peut être substitué par n’importe quel fabricant

par Système de documentation sur gel 203203 IntasAgarose à bas point de fusion Biozym 850081 peut être remplacé par n’importe quel fabricant de plasmide