Article de méthode

Un modèle double humanisé DE BLT-souris avec un microbiome humain stable-comme l'intestin et le système immunitaire humain

DOI :

10.3791/59773

⸱

30 août 2019

 ,  ,  , 
1Nebraska Center for Virology, 2School of Biological Sciences, University of Nebraska-Lincoln, 3Department of Food Science and Technology, University of Nebraska-Lincoln

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons une nouvelle méthode pour produire des blT-souris doublehumanisées qui comportent un système immunitaire humain fonctionnel et un microbiome d'intestin humain-comme un homme stable. Ce protocole peut être suivi sans avoir besoin de souris exemptes de germes ou d'installations gnotobiotiques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les souris humanisées (hu-mice) qui disposent d'un système immunitaire humain fonctionnel ont fondamentalement changé l'étude des agents pathogènes humains et de la maladie. Ils peuvent être utilisés pour modéliser des maladies qui sont autrement difficiles ou impossibles à étudier chez l'homme ou d'autres modèles animaux. Le microbiome intestinal peut avoir un impact profond sur la santé humaine et la maladie. Cependant, le microbiome intestinal murine est très différent de celui trouvé chez l'homme.  Il est nécessaire d'améliorer les modèles précliniques hu-mice qui ont un microbiome intestinal humain greffé. Par conséquent, nous avons créé des doubles hu-mice qui comportent à la fois un système immunitaire humain et un microbiome intestinal stable ressemblant à l'homme. hocher la tête. Les souris cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) sont l'un des meilleurs animaux pour l'humanisation en raison de leur niveau élevé d'immunodéficience. Cependant, les souris Sans germe NSG, et divers autres modèles importants de souris sans germes ne sont pas actuellement disponibles dans le commerce. En outre, de nombreux milieux de recherche n'ont pas accès aux installations gnotobiotiques, et travailler dans des conditions gnotobiotiques peut souvent être coûteux et long. Fait important, les souris exemptes de germes ont plusieurs déficiences immunitaires qui existent même après l'engraftment des microbes. Par conséquent, nous avons développé un protocole qui ne nécessite pas d'animaux exempts de germes ou d'installations gnotobiotiques. Pour générer des souris doubles hu-mice, les souris DeNG ont été traitées avec la radiothérapie avant la chirurgie pour créer des souris de moelle, de foie, de thymus-humanisées (hu-BLT). Les souris ont alors été traitées avec des antibiotiques de large spectre pour épuiser le microbiome intestinal murine préexistant. Après traitement antibiotique, les souris ont été données des greffes fécales avec des échantillons sains de donneur humain par l'intermédiaire du gavage oral. Les souris doubles de hu-BLT ont eu les profils uniques de gène de 16S de rRNA basés sur l'échantillon humain individuel de donneur qui a été transplanté. Fait important, le microbiome humain transplanté était stable chez les souris doubles hu-BLT pendant la durée de l'étude jusqu'à 14,5 semaines après la transplantation.

Introduction

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Les souris humanisées (hu-souris) ont transformé l'étude de nombreux aspects de la santé humaine et de la maladie, y compris l'hématopoiesis, l'immunité, le cancer, la maladie auto-immune, et la maladie infectieuse1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Ces hu-mice ont l'avantage distinct sur d'autres modèles de souris en ce qu'ils ont un système immunitaire humain fonctionnel et peuvent être infectés par des agents pathogènes spécifiques de l'homme. Néanmoins, l'importance du microbiome intestinal a été démontrée par son rôle dans de nombreuses maladies humaines telles que l'obésité, le syndrome métabolique, les maladies inflammatoires, et le cancer10,11,12, 13. Le système immunitaire muqueux et le microbiome intestinal sont régulés réciproquement pour maintenir l'homéostasie intestinale et systémique. Le système immunitaire est façonné par des antigènes présentés par le microbiome intestinal et, réciproquement, le système immunitaire joue un rôle réglementaire important dans la promotion des bactéries intestinales commensal et l'élimination des agents pathogènes14,15, 16. Cependant, le microbiome intestinal de hu-mice n'a pas été bien caractérisé et le microbiome intestinal murine diffère sensiblement dans la composition et la fonction des humains17. Ceci est dû aux différences évolutives, physiologiques et anatomiques entre le murine et l'intestin humain aussi bien que d'autres facteurs importants tels que l'alimentation, qui peuvent influencer les résultats expérimentaux des modèles de maladie de hu-souris18. Par conséquent, au-delà de la classification du microbiome intestinal murine de hu-mice, un modèle animal comportant à la fois un système immunitaire humain et le microbiome intestinal humain est nécessaire pour étudier les interactions complexes de la maladie humaine in vivo.

L'étude des maladies humaines directement chez les sujets humains est souvent peu pratique ou contraire à l'éthique. De nombreux modèles animaux ne peuvent pas être utilisés pour étudier les agents pathogènes humains comme le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Les modèles de primates non humains sont génétiquement dépassés, très coûteux, et ne sont pas sensibles à de nombreux agents pathogènes humains. Les souris qui ont été dérivées comme sans germe (GF) et reconstituées avec des microbiomes intestinaux semblables à l'homme ont été largement utilisées pour étudier la santé humaine et la maladie19,20. Cependant, ces animaux n'ont pas de système immunitaire humain et travailler avec des animaux GF nécessite des installations spécialisées, des procédures et de l'expertise. Par conséquent, il est nécessaire d'améliorer les modèles précliniques pour étudier la relation complexe du microbiome intestinal et du système immunitaire humain. Beaucoup de souches de souris, telles que NOD. Cg-PrkdccidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), ne sont pas disponibles dans le commerce comme GF. Les animaux DE GF peuvent également souffrir des insuffisances immunitaires de longue durée qui ne sont pas complètement renversées par l'engraftment des microbes21. Par conséquent, nous avons créé un double hu-mice comportant à la fois un système immunitaire humain fonctionnel et un microbiome intestinal stable ressemblant à l'homme dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes (FPS). Pour générer des doubles hu-mice, la chirurgie a été effectuée sur des souris NSG pour créer la moelle osseuse, le foie, les souris humanisées de thymus (hu-BLT). Les souris de hu-BLT ont été alors traitées avec des antibiotiques de large spectre et ont alors donné des greffes fécales avec un échantillon humain sain de distributeur. Nous avons caractérisé le microbiome bactérien d'intestin de 173 échantillons fécaux de 45 souris doubles de hu-BLT et de 4 échantillons humains de donneur fécal. Les souris doubles hu-BLT ont des profils génétiques uniques de 16S rRNA basés sur l'échantillon individuel de donneur humain qui est transplanté. Fait important, le microbiome humain transplanté était stable chez les souris pendant la durée de l'étude jusqu'à 14,5 semaines après la transplantation. En outre, les métagénomes prévus ont montré que les souris doubles hu-BLT ont une capacité fonctionnelle prédite différente de celle des souris hu qui est plus semblable aux échantillons de donneurs humains.

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Protocole

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Toutes les méthodes décrites ici ont été menées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et de recherche sur les animaux (IACUC) à l'Université du Nebraska-Lincoln (UNL). L'IACUC de l'UNL a approuvé deux protocoles liés à la génération et à l'utilisation de souris hu-BLT, y compris des souris doubles. De plus, le Comité de surveillance de la recherche scientifique (CSCO) de l'UNL a également approuvé l'utilisation de cellules souches embryonnaires humaines et de tissus fœtaux, qui sont achetés auprès des Ressources bioscientifiques avancées pour des études sur les souris humanisées (SROCMD 2016-1-002).

1. Logement et entretien de souris

  1. Achetez des souris NSG de 6-8 semaines (NOD. Cg-PrkdccidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
  2. Loger les souris dans des conditions de FPS avec l'échange d'air, les préfiltres et les filtres HEPA (0,22 m) dans une pièce où la température, l'humidité et la pression sont contrôlées.
    1. Maison et entretiendes des souris dans des cages de microisolateur individuelles autoclaved dans un système de rack capable de gérer l'échange d'air avec des préfiltres et des filtres HEPA (0,22 m).
  3. Effectuez toutes les procédures et manipulations des souris dans une hotte de fumée biologique de sécurité de type A2 de classe II qui a été prétraitée avec 70 % d'éthanol. Avant de travailler dans la chambre des animaux, douche et changer en gommages propres, costume de tyvek, couvre-bottes, bonnet de cheveux, masque facial, et des gants. Portez une robe de chirurgie au-dessus du costume de tyvek pendant des procédures chirurgicales.
    REMARQUE : La décontamination de la lumière ultraviolette (UV) est également préférable avant les procédures.
    1. Autoclave tous les instruments et réactifs si possible, puis désinfecter avant de transférer sur le capot de fumée.
    2. Pendant les procédures, retirer les cages aérées individuellement des animaux de la grille et les désinfecter avant de les transférer sur le capot de fumée.
  4. Nourrir les souris un régime irradié et fournir de l'eau autoclaved. Fournir des aliments irradiés ab libitum et compléter avec des aliments irradiés supplémentaires au besoin. Changer l'eau autoclaved hebdomadaire ment ou au besoin.
    REMARQUE : L'eau acidifiée autoclaved peut également être employée. Le régime irradié fourni a eu une durée de conservation de 6 mois après fabrication.

2. Génération de souris BLT humanisées

REMARQUE: Génération de souris hu-BLT a été décrit précédemment22,23,24.

  1. Le jour de la chirurgie, donner aux souris l'irradiation du corps entier à une dose de 12 cGy/g de poids corporel.
  2. Préparez les souris pour la chirurgie.
    1. Donnez à chaque souris irradiée un mélange de kétamine à la concentration de travail de 100 mg/kg et de Xylazine à la concentration de 12 mg/kg, qui variait de 130 à 170 L par souris en fonction du poids corporel par injection intrapéritonéale (IP) pour l'anesthésie. Pour préparer 3 ml du mélange de kétamine et de xylazine, ajouter 0,27 ml de kétamine à la concentration en stock de 100 mg/ml et 0,03 ml de xylazine à la concentration de 100 mg/ml à 2,7 ml de salin stérile et bien mélanger. Désinfecter la peau avec 70% d'isopropanol avant l'injection.
    2. Donnez à chaque souris irradiée Buprenorphine 1 mg/kg de poids corporel (demi-vie 72 h, SR-LAB) par injection sous-cutanée pour une gestion durable de la douleur.
    3. Donnez à chaque souris irradiée 100 l (858 g) de cefazoline par injection IP pour la prophylaxie antibiotique préopératoire.
    4. Raser les cheveux des souris à l'aide de tondeuses à cheveux électriques autour du côté latéral gauche et médial de la souris au site chirurgical ultérieur utilisé pour exposer le rein gauche.
    5. Vérifier le bon niveau d'anesthésie par réflexe de pédale (pincement ferme de l'orteil).
    6. Donnez du gaz isoflurane à 3-5% si une anesthésie supplémentaire est nécessaire à tout moment pendant la chirurgie.
    7. Appliquer l'onuleur ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la dessiccation cornéenne. Appliquer une étiquette d'oreille si nécessaire.
  3. Effectuer la chirurgie pour implanter le foie et les tissus de thymus dans la capsule rénale gauche.
    1. Désinfecter la peau au site chirurgical en appliquant un gommage à l'iode à partir du centre du site chirurgical et en se déplaçant vers l'extérieur d'une manière circulaire. Répétez ce processus avec 70% d'isopropanol et une troisième fois avec de l'iode.
    2. À l'aide de forceps, chargez d'abord un fragment de tissu hépatique fœtal humain en trocart. Puis à l'aide de forceps, charger un fragment de tissu de thymus fœtal humain dans le trocart. Puis à l'aide de forceps, charger un autre fragment de tissu du foie fœtal humain dans le trocart. Les tissus doivent être coupés à 1-1,6 mm3 pour s'adapter aux dimensions intérieures du trocart.
    3. Utilisez des forceps pour soulever la peau et utilisez des ciseaux pour faire une petite coupe longitudinalement. Étendre la coupe à 1,5-2 cm dans le côté gauche de la souris.
    4. Utilisez des forceps pour soulever la couche musculaire et utilisez des ciseaux pour faire une petite coupe longitudinalement. Étendre la coupe au besoin pour exposer le rein.
    5. Exposer le rein en saisissant doucement le tissu adipeux entourant le rein. Ne touchez pas directement le parenchyme rénal.
    6. Faire une incision de 1-2 mm à l'extrémité postérieure de la capsule rénale à l'aide d'un scalpel.
    7. Insérez lentement le trocart préchargé par l'incision parallèle au long axe du rein et relâchez les tissus entre la capsule rénale et le rein.
    8. Retournez soigneusement le rein et l'intestin à leur position normale. Utilisez des sutures absorbables 5/0 P-3 (P-13) avec une aiguille circulaire de 13 mm 3/8 pour fermer la couche musculaire et les agrafes chirurgicales pour fermer la peau.
  4. Après la chirurgie, mettre la souris dans une cage de microisolateur autoclaved propre pour la récupération.
    1. Pour minimiser la perte de chaleur pendant la récupération post-chirurgicale, placez la cage contenant les souris sur un coussin chauffant qui est relié à une pompe à eau qui réchauffe et fait circuler l'eau.
    2. Surveillez les souris jusqu'à ce qu'elles aient retrouvé une conscience suffisante pour maintenir la tension sternale.
  5. Dans les 6 heures suivant l'achèvement de la chirurgie, par l'intermédiaire de la veine de queue, injectez des cellules souches hématopoïétiques CD34MD isolées du tissu hépatique fœtal humain.
    1. Réchauffer les souris avec une lampe thermique. Désinfecter la queue avec 70 % d'isopropanol, puis injecter de 1,5 à 5 à 105 cellules souches/200 l dans la veine de la queue.
    2. Arrêtez tout saignement de l'injection et retournez les souris dans la cage du microisolateur et la cage du microisolateur dans la cage.
      REMARQUE : Les souris post-chirurgicales sont généralement logées ensemble, cinq par cage de microisolateur, pendant et après la récupération. Cependant, les souris ne sont logées ensemble que si elles ont toutes été opérées le même jour.
  6. Vérifiez les souris tous les jours. Surveillez attentivement les agrafes chirurgicales et remplacez-les au besoin. Surveillez de près les souris pour déceler tout signe d'infection ou d'inconfort. Fournir de la nourriture autoclaved sur le plancher de la cage de microisolateur pendant quelques jours après chirurgie.
  7. Retirez les agrafes chirurgicales 7-10 jours après chirurgie. Donnez du gaz isoflurane à 3-5% pour anesthésier les souris. Retirez soigneusement les agrafes et appliquez ensuite la pommade antibiotique et analgésique sur le site.
  8. Prévoyez 9 à 12 semaines pour la reconstitution des cellules immunitaires humaines, puis collectez le sang périphérique de la veine sapéne médiale de chacune des souris humanisées.
    1. Retenez les souris conscientes à l'aide d'un dispositif de retenue en plastique de taille appropriée avec une ouverture près de la tête de la souris pour la respiration et une ouverture près de l'arrière de la souris pour isoler une jambe. Mettez les souris dans la tête du cône de retenue en premier, puis tirez doucement une jambe à travers l'ouverture de la jambe.
    2. Vaporiser le côté médial de la jambe isolée avec 70% d'isopropanol, puis répandre l'onguent antibiotique et analgésique sur le même site.
      REMARQUE: La pommade aide à révéler l'emplacement de la veine sans avoir besoin d'épilation et aide également à la formation de gouttelettes sanguines.
    3. À l'aide d'une aiguille de calibre 25 à un angle de 90 degrés, perforer la veine et recueillir de 50 à 100 l de sang à l'aide d'un tube de collecte de sang enduit EDTA. Arrêtez le saignement en appliquant une pression sur le site avec de la gaze stérile. Une fois que le saignement s'est arrêté, retournez les souris dans leur cage.
      REMARQUE : Les volumes de sang maximum recueillis sont généralement de 50 L par semaine ou de 100 L toutes les deux semaines.
    4. Utilisez le sang périphérique recueilli pour tester le niveau de reconstitution des cellules immunitaires humaines à l'aide de la cytométrie du débit avec des anticorps pour hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.

3. Traitement antibiotique

  1. Avant le traitement antibiotique, pré-traitement des échantillons fécaux. Déplacez les souris vers une nouvelle cage de microisolateur autoclaved.
  2. Préparez un cocktail frais d'antibiotiques à large spectre tous les jours.
    1. Préparer 250 ml d'eau contenant du Metronidazole fraîchement préparé (1 g/L), de la néomycine (1 g/L), de la vancomycine (0,5 g/L) et de l'ampicilline (1 g/L) pour chaque cage de souris microisolatrice.
      REMARQUE : Utilisez de l'eau autoclave ou stérile pour l'eau potable complétée par les antibiotiques.
    2. Ajouter 9,2 g de mélange de boissons sucrées au sucre de raisin à 250 ml d'eau supplémentaire aux antibiotiques.
      REMARQUE : L'utilisation du mélange sucré de boisson de sucre de raisin masque le goût amer des antibiotiques et aide à empêcher la déshydratation chez les souris.
    3. Changer l'antibiotique et le sucre de raisin sucré boisson mélange complété l'eau et placer les souris dans une nouvelle cage autoclaved tous les jours.
      REMARQUE : Les souris sont copropagiques et changer les cages quotidiennement empêche les souris de se réinoquer avec des bactéries intestinales.
    4. Pour l'engraftment maximal du microbiome intestinal humain, fournir des antibiotiques pendant 14 jours. Pendant le traitement antibiotique, surveillez les souris pour la perte de poids et la déshydratation. La perte de poids est prévue pendant les 3-4 premiers jours et les plateaux après cela pour la durée du traitement. En cas de déshydratation, donnez aux souris une solution saline ou Ringers par injection intrapéritonéale.
      REMARQUE : D'autres protocoles d'humanisation de microbiome d'intestin exigent le gavage oral des antibiotiques. Bien qu'efficace à épuiser les bactéries intestinales murines, nous avons constaté que la méthode moins invasive d'ajouter des antibiotiques à l'eau potable mettre moins de stress sur nos souris humanisées et a conduit à de meilleurs résultats.

4. Échantillons de donneurs et greffe sécale

  1. Préparer des échantillons fécaux de donneurs humains.
    1. Utilisez des sources bien préparées de matériel de greffe de microbiote fécal (FMT) pour la transplantation fécale chez les souris humanisées.
    2. Décongeler les préparations FMT et les aliquot dans des conditions anaérobies dans une chambre anaérobie.
    3. Si désiré, à cette étape mélanger des parties égales des échantillons fécaux ensemble pour créer un échantillon impartial "humain".
    4. Maintenez la congélation et le dégel du matériel de FMT à un minimum, si l'aliquage ou le mélange des échantillons n'est pas nécessaire, décongelez seulement immédiatement avant la procédure.
  2. Greffe fécale humaine
    1. Après l'achèvement de 14 jours de traitement antibiotique, changer l'eau potable à l'eau autoclaved et déplacer les souris dans une nouvelle cage autoclaved. Arrêtez les changements quotidiens de cage et mettez en œuvre une fois toutes les 1-2 semaines l'horaire changeant de cage.
    2. Donnez deux greffes fécales à 24 et 48 h après l'arrêt des antibiotiques.
    3. 24 h après le traitement des antibiotiques, décongeler la quantité nécessaire de matériel FMT, donner à chaque souris 200 'L de matériel FMT par gavage oral. Répéter la procédure à nouveau à 48 h après les antibiotiques.
    4. Étendre tout matériau FMT décongelé restant ou décongelé sur la fourrure des souris humanisées ou sur la literie de la cage.

5. Collection d'échantillons fécaux frais

  1. Autoclave sacs en papier individuels avant de transférer sur le capot de fumée.
  2. Dans le capot de fumée, mettre une souris dans chaque sac en papier individuel et permettre à la souris de déféquer.
  3. À l'aide de forceps stériles, prélever l'échantillon fécal dans des tubes en plastique de 1,5 ml et congeler à -80 oC. Remettre les souris dans des cages de microisolateur.
    REMARQUE : Cette méthode de collecte des échantillons fécaux permet la collecte d'échantillons fécaux frais de souris individuelles sans aucune manipulation induisant de stress.

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Résultats

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La figure 1 montre un aperçu des méthodes utilisées pour créer des souris doubles hu-BLT et décrit brièvement le processus d'ajout d'un système immunitaire humain fonctionnel et d'un microbiome intestinal stable ressemblant à l'homme aux souris NSG. La figure 2 montre un exemple d'analyse de cytométrie de flux du sang périphérique d'une souris BLT humanisée 10 semaines après la chirurgie. La figure 3 montre l'abondance relative des ...

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Discussion

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Le protocole décrit ici est pour la création de souris doubles hu-BLT qui comportent à la fois un système immunitaire humain fonctionnel et un microbiome intestinal stable ressemblant à l'homme. Ce protocole peut être adapté à d'autres modèles de souris humanisées ou non humanisées sans avoir besoin d'animaux GF et d'installations gnotobiotiques. Bien que les méthodes décrites ici soient relativement simples, il y a plusieurs détails critiques qui sont importants pour la création réussie de souris doubles hu-BLT. Les sou...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Nous tenons à remercier Yanmin Wan, Guobin Kang et Pallabi Kundu pour leur aide dans la génération de souris humanisées par le BLT. Nous tenons à remercier l'installation de base en génomique de l'UNMC qui reçoit un soutien partiel du Nebraska Research Network In Functional Genomics NE-INBRE P20GM103427-14, The Molecular Biology of Neurosensory Systems CoBRE P30GM110768, The Fred and Pamela Buffett Cancer Center - P30CA036727, The Center for Root and Rhizobiome Innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, et Nebraska Research Initiative. Nous tenons à remercier l'Université du Nebraska - Lincoln Life Sciences Annex et leur personnel pour leur aide. Cette étude est soutenue en partie par les Subventions R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Chronic HIV Infection and Aging in NeuroAIDS (CHAIN) Center, 1R01AI11862 to Q Li.  Les bailleurs de fonds n'avaient aucun rôle à jouer dans la conception des études, la collecte et l'analyse des données, la préparation du manuscrit ou la décision de publication.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aiguilles d’alimentation animale 18GCadence Science9928B
Clidox-s ActivatorPharmacal Research Laboratories95120F
Clidox-s BasePharmacal Research Laboratories96125F
DGM 108 cage rackTechniplast
Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L  ;Grainger12R063
FMT Upper Delivery Microbiote Préparations  ;OpenBiomeFMP30
Grape Kool-AidKraft Foods Inc.
hCD19-PE/Cy5Biolegend302209
hCD3-PEBiolegend300408
hCD4-Alexa 700Biolegend300526
hCD45-FITCBiolegend304006
hCD8-APC/Cy7Biolegend 301016
Ringer’s Solution tamponnée au lactateBoston BioProducts Inc  ;PY-906-500  ;
mCD45-APCBiolegend103111
Microvette 100 K3EMicrovette20.1278.100
Neosporin First Aid Onguent antibiotique/analgésiqueNeosporin
NSG souris (NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)The Jackson Laboratory005557
PrecisionGlide 25 G AiguilleBD305127
RS200 Irradiateur à rayons XRAD Source Technologies
Sealsafe Plus GM500 Cages de micro-isolateurTechniplast
Gaze non tissée stérileFisherbrand22-028-558
Teklad global 16 % de nourriture de souris irradiée aux protéinesTeklad2916

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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