Caractériser les mutants liés à la maladie des kinases familiales de la RAF en utilisant un ensemble de méthodes pratiques et réalisables

Jiajun Yap; Jimin Yuan; Zi Heng Tee; Xuchao Huang; Wan Hwa Ng; Jiancheng Hu

doi:10.3791/59795

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Article de méthode

Caractériser les mutants liés à la maladie des kinases familiales de la RAF en utilisant un ensemble de méthodes pratiques et réalisables

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DOI :

10.3791/59795

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17 juillet 2019

Jiajun Yap¹ , Jimin Yuan¹ , Zi Heng Tee¹ , Xuchao Huang¹ , Wan Hwa Ng¹ , Jiancheng Hu¹^,²

¹The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre Singapore, ²The Cancer and Stem Cell Program, Duke-NUS Medical School

Dans cet article

Résumé

Dans cet article, nous avons présenté un ensemble de méthodes pratiques et réalisables pour caractériser les mutants liés à la maladie des kinases de la famille raf, qui comprennent l'analyse in vitro de kinase, l'analyse de co-activation de RAF, et l'analyse de luciferase fractionnée complémentaire.

Résumé

Les kinases de la famille du fibrosarcome accéléré (RAF) jouent un rôle central dans la biologie cellulaire et leur dysfonctionnement conduit à des cancers et des troubles du développement. Une caractérisation des mutants de la RAF liés à la maladie nous aidera à choisir des stratégies thérapeutiques appropriées pour le traitement de ces maladies. Des études récentes ont montré que les kinases de la famille RAF ont à la fois des activités catalytiques et allostériques, qui sont étroitement réglementées par la dimerisation. Ici, nous avons construit un ensemble de méthodes pratiques et réalisables pour déterminer les activités catalytiques et allostériques et l'affinité relative dimer / stabilité des kinases de la famille RAF et de leurs mutants. Tout d'abord, nous avons modifié l'assay kinase in vitro classique en réduisant la concentration de détergent dans les tampons, en utilisant une procédure de lavage rapide doux, et en employant un glutathion S-transferase (GST) fusion pour empêcher les dissécages RAF de se dissocier pendant purification. Cela nous permet de mesurer l'activité catalytique des mutants de la RAF constitutivement actifs de manière appropriée. Deuxièmement, nous avons mis au point un nouvel essai de co-activation de la RAF pour évaluer l'activité allostérique des mutants de la RAF morts par la kinase en utilisant des protéines de la RAF tronquées n-terminales, éliminant ainsi l'exigence de Ras actif dans les protocoles actuels et réalisant ainsi une sensibilité. Enfin, nous avons généré un essai unique de luciferase fractionnée complémentaire pour mesurer quantitativement l'affinité relative dimère/stabilité de divers mutants de RAF, qui est plus fiable et sensible comparée à l'essai traditionnel de co-immunoprécipitation. En résumé, ces méthodes présentent les avantages suivants : (1) conviviale; (2) capable d'effectuer efficacement sans équipement de pointe; (3) rentable; (4) très sensible et reproductible.

Introduction

Les kinases de la famille RAF sont un composant clé de la cascade de signalisation RAS/RAF/MEK/ERK, qui transmet un signal de RAS pour activer la kinase protéine activée par mitogène (MEK)¹^,²^,³^,⁴. Cette famille de kinases joue un rôle crucial dans la croissance cellulaire, la survie et la différenciation, et leurs altérations induisent de nombreuses maladies, notamment le cancer⁵^,⁶^,7^,⁸. Récemment, les séquençages g....