La méthode de localisation de l'immunofluorescence in vivo (IVIL) peut être utilisée pour examiner la biodistribution in vivo d'anticorps et d'anticorps conjugués à des fins oncologiques chez des organismes vivants à l'aide d'une combinaison de ciblage tumoral in vivo et d'immunostaining ex vivo Méthodes.
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Article de méthode
In Vivo Immunofluorescence Localisation pour l'évaluation de la biodistribution thérapeutique et diagnostique des anticorps dans la recherche sur le cancer
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des outils importants dans la détection, le diagnostic et le traitement du cancer. Ils sont utilisés pour démêler le rôle des protéines dans la tumorigénèse, peuvent être dirigés vers les biomarqueurs du cancer permettant la détection et la caractérisation des tumeurs, et peuvent être utilisés pour la thérapie contre le cancer comme mAbs ou des conjugués anticorps-médicaments pour activer les cellules effectrices immunitaires, pour inhiber voies de signalisation, ou tuer directement les cellules porteuses de l'antigène spécifique. En dépit des progrès cliniques dans le développement et la production des mAbs nouveaux et fortement spécifiques, les applications diagnostiques et thérapeutiques peuvent être altérées par la complexité et l'hétérogénéité du microenvironnement de tumeur. Ainsi, pour le développement de thérapies et de diagnostics efficaces à base d'anticorps, il est crucial d'évaluer la biodistribution et l'interaction du conjugué à base d'anticorps avec le microenvironnement tumoral vivant. Ici, nous décrivons In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) comme une nouvelle approche pour étudier les interactions des thérapies et des diagnostics basés sur les anticorps dans les conditions physiologiques et pathologiques in vivo. Dans cette technique, un anticorps thérapeutique ou diagnostique d'antigène-spécifique est injecté par voie intraveineuse in vivo et localisé ex vivo avec un anticorps secondaire dans les tumeurs isolées. IVIL reflète donc la biodistribution in vivo de médicaments à base d'anticorps et d'agents de ciblage. Deux applications IVIL sont décrites évaluant la biodistribution et l'accessibilité des agents de contraste basés sur les anticorps pour l'imagerie moléculaire du cancer du sein. Ce protocole permettra aux futurs utilisateurs d'adapter la méthode IVIL pour leurs propres applications de recherche basées sur les anticorps.
Introduction
Les anticorps monoclonaux (mAb) sont de grandes glycoprotéines (environ 150 kDa) de la superfamille d'immunoglobuline qui sont sécrétées par les cellules B et ont une fonction primaire dans le système immunitaire pour identifier et inhiber la fonction biologique de, ou marquer pour pathogènes bactériens ou viraux, et peuvent reconnaître l'expression protéique anormale sur les cellules cancéreuses1. Les anticorps peuvent avoir une affinité extrêmement élevée avec leurs épitopes spécifiques jusqu'aux concentrations femtomolaires, ce qui en fait des outils très prometteurs en biomédecine2. Avec le développement de la technologie hybridome par Milstein et Kohler (prix Nobel en 1984), la production de mAbs est devenu possible3. Plus tard, mAbs humains ont été générés en utilisant la technologie d'affichage de phage ou souches transgéniques de souris et ont révolutionné leur utilisation comme outils de recherche et thérapeutiquesnouvelles 4,5.
Le cancer est un problème de santé mondial et une cause majeure de décès, créant la nécessité de nouvelles approches pour la prévention, la détection et la thérapie6. Jusqu'ici, les mAbs ont permis l'extraction du rôle des gènes et de leurs protéines dans la tumorigénèse et une fois dirigécontre des biomarqueurs de cancer, peut permettre la détection et la caractérisation de tumeur pour la stratification patiente. Pour la thérapie de cancer, les mAbs bispécifiques, les conjugués anticorps-médicaments, et de plus petits fragments d'anticorps sont développés comme thérapeutiques, et pour l'administration ciblée de drogue pour augmenter l'efficacité thérapeutique7. En outre, les anticorps servent pour le ciblage de biomarqueurs des agents de contraste pour des modalités d'imagerie moléculaire telles que la chirurgie fluorescence-guidée, l'imagerie photoacoustique (PA), l'imagerie moléculaire d'ultrason (US), et l'émission médicalement employée de positron tomographie (PET) ou tomographie calculée par émission de photons (SPECT)8. Enfin, les anticorps peuvent également être utilisés comme agents théranostiques permettant la stratification des patients et la surveillance de la réponse pour les thérapies ciblées9. Par conséquent, les nouveaux mAbs commencent à jouer un rôle critique dans la détection, le diagnostic et le traitement du cancer.
En dépit des progrès critiques dans le développement et la production des mAbs nouveaux et fortement spécifiques, les applications diagnostiques et thérapeutiques peuvent être rendues inefficaces en raison de la complexité de l'environnement de tumeur. Les interactions entre anticorps dépendent du type d'épitopée, c'est-à-dire qu'il soit linéaire ou conformationnel10. En plus de la reconnaissance des antigènes, les anticorps doivent surmonter les barrières naturelles telles que les parois des vaisseaux, les membranes basales et le stroma tumoral pour atteindre les cellules cibles exprimant l'antigène. Les anticorps interagissent avec le tissu non seulement à travers le domaine de liaison d'antigène à fragment variable (Fab), mais aussi à travers le fragment cristallin constant (Fc) qui conduit à des interactions hors site11. Le ciblage est également compliqué par l'expression hétérogène des marqueurs de tumeur tout au long du volume de tumeur et de l'hétérogénéité dans la vascularisation de tumeur et le système lymphatique12,13. En outre, le microenvironnement de tumeur est composé des fibroblastes cancer-associés qui soutiennent des cellules de tumeur, des cellules immunitaires de tumeur qui suppriment des réactions immunitaires antitumorales, et de l'endothélium de tumeur qui soutient le transport de l'oxygène et des éléments nutritifs, tous des qui interfèrent avec la pénétration, la distribution et la disponibilité de thérapies ou de diagnostics à base d'anticorps. Dans l'ensemble, ces considérations peuvent limiter l'efficacité thérapeutique ou diagnostique, réduire la réponse au traitement, et peut entraîner une résistance tumorale.
Par conséquent, pour le développement de thérapies et de diagnostics efficaces à base d'anticorps, il est crucial d'évaluer la biodistribution et l'interaction de la conjugaison à base d'anticorps dans le microenvironnement tumoral. Actuellement, dans les études précliniques, l'expression de marqueur dans les modèles de recherche de tumeur est analysée ex vivo par la coloration d'immunofluorescence (IF) des sections de tumeur14. La coloration standard de SI est exécutée avec les anticorps marqueurs-spécifiques primaires qui sont alors accentués par les anticorps fluorescents secondaires sur des tranches de tissu de tumeur ex vivo qui ont été isolées de l'animal. Cette technique met en évidence l'emplacement statique du marqueur au moment de la fixation du tissu et ne donne pas un aperçu de la façon dont les traitements ou les diagnostics à base d'anticorps pourraient se répartir ou interagir dans des conditions physiologiques. L'imagerie moléculaire par PET, SPECT, US, et PA peut fournir des informations sur la distribution d'agent de contraste conjugué par anticorps dans les modèles précliniques vivants8,15. Comme ces modalités d'imagerie ne sont pas invasives, des études longitudinales peuvent être effectuées et des données sensibles au temps peuvent être recueillies avec un nombre minimal d'animaux par groupe. Cependant, ces approches d'imagerie moléculaire non invasives ne sont pas assez sensibles et n'ont pas une résolution suffisante pour la localisation de la distribution des anticorps au niveau cellulaire. En outre, les caractéristiques physiques et biologiques de l'anticorps primaire peuvent être radicalement modifiées par la conjugaison d'un agent de contraste16.
Afin de prendre en considération les conditions physiologiques et pathologiques in vivo de la façon dont les thérapies et les diagnostics à base d'anticorps interagissent dans l'environnement tumoral et d'obtenir une distribution cellulaire et même sous-cellulaire à haute résolution profils des anticorps non conjugués, nous proposons une approche de IF, réputée localisation d'immunofluorescence in vivo (IVIL), dans laquelle l'anticorps antigène-spécifique est injecté par voie intraveineuse in vivo. Le thérapeutique ou le diagnostic à base d'anticorps, agissant comme un anticorps primaire, circule dans les vaisseaux sanguins fonctionnels et se lie à sa protéine cible dans le cadre tumoral très précis et vivant. Après l'isolement des tumeurs in vivo-étiquetées avec l'anticorps primaire, un anticorps secondaire est employé pour localiser les conjugués accumulés et retenus d'anticorps. Cette approche est similaire à une approche d'histologie DE LA SI précédemment décrite injectant des anticorps étiquetés fluorescents17. Bien qu'ici, l'utilisation d'anticorps non conjugués évite un changement potentiel dans les caractéristiques de biodistribution induites par la modification des anticorps. En outre, l'application ex vivo d'anticorps secondaires fluorescents évite une perte possible du signal de fluorescence pendant la collecte et le traitement des tissus et fournit l'amplification de l'intensité du signal de fluorescence. Notre approche d'étiquetage reflète la biodistribution in vivo de médicaments à base d'anticorps et d'agents ciblés et peut fournir des informations importantes pour le développement de nouveaux agents diagnostiques et thérapeutiques.
Ici, nous décrivons deux applications de la méthode IVIL appliquées dans des études précédentes portant sur la biodistribution et l'accessibilité des agents de contraste à base d'anticorps pour les approches d'imagerie moléculaire pour la détection du cancer du sein. Tout d'abord, la biodistribution d'un colorant infrarouge proche de l'anticorps (anticorps-B7-H3 liés au colorant de fluorescence infrarouge proche, vert endocyanine, B7-H3-ICG) et l'agent de contrôle de l'isotype (Iso-ICG) pour la fluorescence et la photoacoustique moléculaire l'imagerie est explorée18. La méthode de cette application est décrite dans le protocole. Ensuite, les résultats de biodistribution d'un anticorps conformationnellement sensible à la netrin-1, généralement non détectable avec l'imagerie FI traditionnelle, utilisé avec l'imagerie moléculaire par ultrasons, est quantifié et présenté dans les résultats représentatifs19. À la fin de ce document de protocole, les lecteurs devraient se sentir à l'aise d'adopter la méthode IVIL pour leurs propres applications de recherche basées sur les anticorps.
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Protocole
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité administratif institutionnel sur les soins aux animaux de laboratoire (APLAC) de l'Université Stanford.
1. Modèle de souris transgénique du développement du cancer du sein
- Observez des souris du modèle désiré de cancer pour la croissance appropriée de tumeur par l'intermédiaire de la palpation ou de la mesure d'étrier avant de procéder.
REMARQUE : Ici, le modèle murin transgénique du développement de cancer du sein (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT) a été employé. Ces animaux développent spontanément des carcinomes invasifs de sein entre 6 et 12 semaines d'âge dans chaque glande mammaire20. Les glandes mammaires normales ont été employées comme contrôles des transgene-négatifs, les compagnons de litière âge-assortis.
2. Injection intraveineuse d'agents anticorps spécifiques et non spécifiques
- Purififier les anticorps anti-souris B7-H3 et igG de contrôle de l'isotype de lapin sur une colonne de dessalement (p. ex., PD-10) pour enlever les conservateurs et les tampons de stockage suivant les instructions du fabricant.
REMARQUE: Certains anticorps peuvent avoir besoin d'une purification plus poussée avec des perles de protéines-A agarose protocole basé21. - Aliquot doses de 33 g de chaque anticorps conjugué dans des tubes de microcentrifuge individuels.
REMARQUE : Le dosage de l'agent administré peut varier en fonction de l'application et correspond aux doses auxquelles le conjugué d'anticorps est couramment utilisé. La concentration des solutions d'anticorps est nécessaire si le volume est supérieur à 100 L pour la sécurité des animaux. - Au moment désiré avant la collecte des tissus, ici 96 h, anesthésier l'animal porteur de tumeur avec 2% d'isoflurane coulant dans l'oxygène à 2 L/min, et placer sur une scène chauffée à 37 oC. Faites une pincée d'orteil pour s'assurer que le niveau approprié de l'anesthsia a été atteint avant la procédure.
- Pour se préparer à l'inoculation des veines de la queue des solutions d'anticorps, désinfectez la queue de l'animal en essuyant trois fois avec une lingette d'alcool. Dilater les veines de la queue en se réchauffant à l'auto-néavech à environ 30 s. Évitez de chauffer l'animal entier. Essuyez la queue une fois de plus avec une lingette d'alcool après avoir enlevé le coussin chauffant.
- À l'aide d'un cathéter de veine de queue de 27G, insérez l'aiguille de papillon dans l'une des deux veines latérales de queue et fixez soigneusement la queue avec l'aiguille insérée à la scène avec un morceau de ruban chirurgical.
REMARQUE : Le reflux sanguin visible dans le cathéter indique l'emplacement approprié de l'aiguille dans la veine de la queue. - Rincer le cathéter avec 25 l de phosphate stérile tamponné saline (PBS), puis injecter la solution d'anticorps dans le cathéter à l'aide de seringues à insuline. Rincer le cathéter une fois de plus avec 25 l de PBS stérile.
- Retirez l'aiguille de la queue et exercez une pression pour arrêter tout saignement.
- Éteignez l'anesthésie et observez l'animal jusqu'à ce qu'il soit complètement éveillé pour déceler tout signe de détresse.
3. Collecte et préparation des tissus tumoraux cibles
- Au moment souhaité, euthanasier humainement l'animal selon la procédure institutionnelle acceptable, ici, par inhalation progressive de 100% de CO2 à partir d'un réservoir de gaz comprimé avec un débit de déplacement de chambre de 10-30% volume/min.
REMARQUE: Certaines applications de la technique IVIL nécessitent l'euthanasie par perfusion cardiaque avec PBS pour enlever les anticorps circulant librement19,22. - Après confirmation de l'euthanasie humaine par cessation du mouvement respiratoire et cardiaque, manque de réponse de pincement d'orteil, et grisonnant des muqueuses, des tissus de tumeur d'accise utilisant des ciseaux chirurgicaux et des forceps comme suit :
- Posez la souris en position de supine et ne saisissant que la couche externe de la peau entre l'ensemble des glandes mammaires les plus proches de la queue (5e) avec des forceps, faire une petite incision avec une paire de ciseaux chirurgicaux.
- Introduisez les ciseaux fermés dans la coupe et ouvrez lentement la pointe pour séparer soigneusement la peau de la membrane abdominale sous-jacente la gardant intacte.
- Faire une incision verticale jusqu'à l'abdomen, en continuant à séparer la peau de la membrane interne. Entre les glandes mammaires 3rd et 4e, faire une coupe horizontale à travers l'abdomen pour permettre la rétraction de la peau et la visualisation des glandes mammaires.
REMARQUE : Les tumeurs et les glandes mammaires sont situées superficiellement sous la peau. - Saisir chaque tumeur ou glande normale avec des forceps, couper soigneusement la peau attachée à l'aide de ciseaux chirurgicaux.
- Placer les tissus excisés dans des moules de base jetables tissulaires, préétiquetés et remplis d'une température de coupe optimale (OCT) en castré e moyen et congeler les moules rapidement en les plaçant sur de la glace sèche. Afin d'étudier l'accouchement hors cible, exciser d'autres tissus ou organes d'intérêt(p. ex., le foie ou les poumons).
REMARQUE : Pour mettre en pause le protocole à ce stade, entreposez les blocs de tissus congelés à -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient prêts à aller de l'avant. - À l'aide d'un cryostat, sectiondes de blocs de tissus congelés d'une épaisseur de 10 m et placez les sections adjacentes sur des lames de verre d'adhérence préétiquetées.
REMARQUE : Pour mettre en pause le protocole à ce stade, entreposez les diapositives à -80 oC jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à aller de l'avant.
4. Protocole de coloration Ex vivo
REMARQUE : Pour la comparaison quantitative entre les images de microscopie de fluorescence, toutes les diapositives sont tachées en même temps avec les mêmes solutions préparées.
- Rincer les lames de tissu congelés avec PBS à température ambiante pendant 5 min pour enlever l'OCT.
- Délimiter les sections de tissu avec un stylo de barrière hydrophobe pour réduire le volume des solutions nécessaires pendant la coloration.
REMARQUE : Veillez à ne pas laisser le stylo courir sur les échantillons de tissus, car il peut soit enlever le tissu de la glissière ou empêcher la coloration appropriée sur la partie tissulaire affectée. Ne laissez pas les sections de tissu se déshydrater à tout moment. - Fixer les sections de tissu avec une solution de paraformaldéhyde de 4% pendant 5 min.
- Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min.
- Perméabilize sections de tissu avec 0.5% Triton-X 100 dans PBS pendant 15 min.
- Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min.
- Bloquer les tissus avec 3% w / v albumine de sérum bovin (BSA) et 5% v / v sérum de chèvre, à la fois en PBS (solution de blocage) pour 1 h à température ambiante.
REMARQUE : Associez le sérum de la solution de blocage à l'animal hôte de l'anticorps secondaire. - Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min.
- Incuber des sections avec des anticorps primaires de tenue de dossiers comme désiré, peut-être un nucléaire commun (par exemple, DAPI), vasculaire (par exemple, CD31), ou marqueur cytoplasmique (par exemple, actine). Ici, rat anti-souris CD31 (marqueur vasculaire) à une dilution 1:100 a été utilisé selon les instructions du fabricant dans la solution de blocage pendant la nuit à 4 oC protégé contre la déshydratation sur un plateau de diapositives.
REMARQUE : N'ajoutez pas d'anticorps primaires supplémentaires ou de conjugués d'anticorps. Le conjugaison qui a été injecté et a permis de s'accumuler dans les tissus in vivo agissent comme l'anticorps primaire. - Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min trois fois, en changeant le PBS à chaque fois.
- Incuber des diapositives avec des anticorps secondaires pour étiqueter les anticorps primaires. Pour cette application, visualisez l'anticorps anti-B7-H3 à l'aide d'anticorps anti-lapin de chèvre conjugués AlexaFluor-546 (1:200 dilution, optimisé selon les instructions du fabricant) et CD31 avec un anticorps secondaire antirat de chèvre AlexaFluor-488 (1:200 dilution, optimisée selon les instructions du fabricant) dans la solution de blocage, protégée de la lumière et de la déshydratation sur un plateau coulissant, pendant 1 h à température ambiante.
REMARQUE : Les anticorps secondaires proviennent du même animal hôte, mais correspondent à l'affinité des anticorps secondaires avec l'espèce hôte de l'anticorps primaire respectif. Les glissières sont protégées de la lumière à partir de ce point. - Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min trois fois, en changeant le PBS à chaque fois.
- Appliquer une goutte du milieu de montage dans le centre de la tranche de tissu et placer soigneusement un bordereau en évitant le piégeage des bulles d'air.
- Sceller les bords de la glissière avec du vernis à ongles transparent et laisser sécher.
REMARQUE : Pour mettre en pause le protocole jusqu'à une semaine à ce stade, rangez les diapositives à -20 oC jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à aller de l'avant.
5. Imagerie par microscopie confocale et analyse quantitative de l'image
REMARQUE : La préparation du microscope confocal et des paramètres d'imagerie dépendra du système confocal utilisé. Le microscope utilisé ici a été acheté commercialement (p. ex., système Zeiss LSM 510 Meta) et le logiciel d'acquisition associé a été utilisé (p. ex., Zen 2009). Cependant, beaucoup de ces étapes s'appliqueront à n'importe quel microscope confocal et assumeront la connaissance confocale de base de microscopie.
- Une fois que le système a été activé et réchauffé, sélectionnez l'objectif souhaité; ici, un objectif 20x (ouverture numérique de 0,8) a été utilisé.
- Chargez une glissière de contrôle positive, cale zona vers le bas, pour permettre de définir l'optimisation pour le signal le plus lumineux. Imagerie dans le canal rouge, concentrer le système sur l'échantillon en mode d'imagerie en direct.
- Pour chaque canal laser utilisé, optimisez l'intensité laser, le gain maître et la taille du sténopé comme suit :
- Passez au mode continu pour l'imagerie.
- Optimisez l'intensité laser (qui contrôle la puissance laser) et Gain (Master) (qui contrôle la tension pour le tube photomultiplicateur) des barres de glissière tout en surveillant l'histogramme de la table De recherche (LUT). Ajustez ces deux paramètres jusqu'à ce que la plage dynamique de l'histogramme soit remplie sans saturer les pixels.
REMARQUE : Si l'intensité laser est trop élevée, il y aura un photoblanchiment. Si le Gain (Master) est trop haut, l'image deviendra bruyante. Idéalement, le Gain (Master) sera au milieu de sa gamme. - Définir le trou d'épingle à 1 unité aérée (AU), qui donne la plus haute résolution et la plus fine z-tranche.
- Faites glisser la barre de compensation numérique pour minimiser le plancher de bruit sur l'histogramme LUT pour un vrai fond noir.
REMARQUE : Une fois que les paramètres de microscopie sont optimisés pour chaque canal laser et objectif, gardez-les constants tout au long de la séance d'imagerie et pour l'imagerie de toutes les diapositives, afin de permettre la comparaison quantitative entre les diapositives.
- Sous l'onglet Mode d'acquisition, sous La moyenne,sélectionnez le Nombre et la Profondeur Bitsouhaités. Cliquez sur le bouton Optimal pour définir la taille optimale des pixels.
- Utilisez le bouton d'acquisition Snap pour collecter une image de haute qualité. Ici, des champs de vision aléatoires ont été sélectionnés à l'intérieur de la tumeur, mais d'autres domaines d'intérêt peuvent s'appliquer à différentes applications (navires, marges tumorales, profondeur de pénétration, etc.)
- Enregistrer les fichiers d'images dans le format utilisé par le logiciel confocal (ici, ".lsm") pour le traitement hors ligne et la quantification.
REMARQUE : Si toutes les diapositives ne sont pas représentées au cours de la même session, enregistrez les paramètres et rechargez-les lors des visites ultérieures, bien que la réimagerie de la même diapositive ne soit pas recommandée en raison du photoblanchiment. - Effectuer les mesures quantitatives de l'intensité de la fluorescence. Open Fiji (Fiji Is Just ImageJ software)19,23 et charger un fichier d'image .lsm en faisant glisser sur la barre d'état.
- Divisez les données du canal couleur. Aller à l'image 'gt; Stacks 'gt; Split Channels.
- Prétraiter les images de fluorescence au besoin, c'est-à-savoir, soustraire le signal d'arrière-plan (Processus 'gt; Soustract Background)ou réduire le bruit via une méthode de filtrage.
- Segmenter le canal de couleur correspondant à la protéine de référence (vasculaire, nucléaire, tache cellulaire) en fixant un seuil sur l'intensité du signal (Image 'gt; Ajuster 'gt; Seuil).
REMARQUE : Le seuil manuel introduit la subjectivité dans l'analyse d'image, par conséquent, à l'aide d'un algorithme de seuil automatisé ou en faisant référence aux histogrammes d'image, ce qui rend les résultats de l'analyse d'image moins biaisés. - Utilisez ce seuil pour créer un masque binaire (Processus 'gt; Binaire 'gt; Convertir en Masque).
- Mesurer et étiqueter les ROI dans le masque (Analyser les particules 'gt; Check Add to Manager 'gt; OK).
- Appliquer ROIs sur le canal de couleur correspondant à l'anticorps d'intérêt (Cliquez sur l'image du canal, Analyser 'gt; Outils 'gt; GESTIONNAIRE de roi-roi 'gt; Mesure). Cela appliquera le masque ROIs à l'image de l'anticorps et fournira des mesures d'image pour les sections d'étiquette dans la fenêtre Résultats. Enregistrer la fenêtre de résultats (Fichier 'gt; Enregistrer).
- Calculer la statistique d'intérêt souhaitée, comme l'intensité moyenne de fluorescence telle que décrite ici24.
- Effectuez toutes les étapes de traitement de manière identique à chaque image dans un ensemble de diapositives. Créez une macro pour le faire automatiquement pour les lots d'images23.
- Pour l'affichage de l'image seulement après des mesures quantitatives, appliquer des ajustements d'image qualitativepour optimiser la visualisation des modèles de biodistribution en ajustant le minimum, le maximum, la luminosité et le contraste aux mêmes niveaux sur toutes les diapositives(Image 'gt; Ajuster Luminosité/contraste).
- Convertir le type d'image (Image 'gt; Type 'gt; RGB Color) et enregistrer des fichiers dans un type d'image sans perte tels que .tiff (Fichier 'gt; Enregistrer comme 'gt; Tiff ...) pour une utilisation dans les présentations et les publications.
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Résultats
La méthode IVIL a été utilisée ici pour examiner la biodistribution in vivo et l'interaction tissulaire de B7-H3-ICG et Iso-ICG, en permettant aux agents, après injection intraveineuse dans un animal vivant, d'interagir avec le tissu cible pendant 96 h, puis une fois que les tissus sont d'agir comme les principaux anticorps pendant l'immunostaining ex vivo. La méthode IVIL a également été comparée à la coloration standard ex vivo IF des tissus pour le marqueur B7-H3. Les glandes mammaires...
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Discussion
Cette méthode comporte plusieurs étapes critiques et nécessite des modifications potentielles pour assurer une mise en œuvre réussie. Tout d'abord, la posologie et le moment de l'injection intraveineuse d'anticorps/anticorps conjugués doivent être adaptés à l'application spécifique. En général, des doses doivent être utilisées qui sont compatibles avec la façon dont le conjugaison d'anticorps sera généralement utilisé, c'est-à-dire, des doses assorties de l'anticorps thérapeutique ou de l'agent de contraste à base d'anti...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions le Dr Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) pour les discussions et l'utilisation de l'équipement. Nous remercions le Dr Juergen K. Willmann pour son mentorat. Cette étude a été appuyée par la subvention du NIH R21EB022214 (KEW), la subvention de formation NIH R25CA118681 (KEW) et le NIH K99EB023279 (KEW). Le Stanford Neuroscience Microscopy Service a été soutenu par NIH NS069375.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 Femelles, 4-6 semaines | |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G | Catheter VisualSonics | Veuillez appeler pour commander Vevo | MicroMarker Tail Vein Vein Crelief Crelief Calone. |
| Lingettes imbibées d’alcool | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Éponges de gaze (4 » x 4 » 16 plis) | Cardinal Health | 2913 | |
| Lampe chauffante | Morganville Scientific | ; HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Santé animale | 29404 | |
| Pommade ophtalmique | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Ruban chirurgical | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Température de coupe optimale (OCT) Moyenne | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Pince chirurgicale London | Outils de science fine | 11080-02 | |
| Ciseaux chirurgicaux | Outils de science fine | 14084-08 | |
| Anticorps | |||
| AlexaFluor-488 chèvre anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 chèvre anti-lapin IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 chèvre anti-humain IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Contrôle des isotypes IgG humains | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Anticorps anti-nétrine-1 humanisé ; | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Lapin anti-Souris CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Souris CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Vernis à ongles Polonais | N’importe quelle pharmacie locale | ||
| Indocyanine Green - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Sérum de chèvre | normal Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldéhyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Phosphate stérile Saline tamponnée (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Lames de verre | VWR | 48311-703 | |
| Colonnes de dessalage | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Couvercles en verre | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Stylo barrière hydrophobe | Ted Pella | 22311 | |
| Tubes de microcentrifugation | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Plateau de coloration de lames | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
Références
- Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
- McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
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