La méthode de localisation de l'immunofluorescence in vivo (IVIL) peut être utilisée pour examiner la biodistribution in vivo d'anticorps et d'anticorps conjugués à des fins oncologiques chez des organismes vivants à l'aide d'une combinaison de ciblage tumoral in vivo et d'immunostaining ex vivo Méthodes.
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Article de méthode
In Vivo Immunofluorescence Localisation pour l'évaluation de la biodistribution thérapeutique et diagnostique des anticorps dans la recherche sur le cancer
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des outils importants dans la détection, le diagnostic et le traitement du cancer. Ils sont utilisés pour démêler le rôle des protéines dans la tumorigénèse, peuvent être dirigés vers les biomarqueurs du cancer permettant la détection et la caractérisation des tumeurs, et peuvent être utilisés pour la thérapie contre le cancer comme mAbs ou des conjugués anticorps-médicaments pour activer les cellules effectrices immunitaires, pour inhiber voies de signalisation, ou tuer directement les cellules porteuses de l'antigène spécifique. En dépit des progrès cliniques dans le développement et la production des mAbs nouveaux et fortement spécifiques, les applications diagnostiques et thérapeutiques peuvent être altérées par la complexité et l'hétérogénéité du microenvironnement de tumeur. Ainsi, pour le développement de thérapies et de diagnostics efficaces à base d'anticorps, il est crucial d'évaluer la biodistribution et l'interaction du conjugué à base d'anticorps avec le microenvironnement tumoral vivant. Ici, nous décrivons In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) comme une nouvelle approche pour étudier les interactions des thérapies et des diagnostics basés sur les anticorps dans les conditions physiologiques et pathologiques in vivo. Dans cette technique, un anticorps thérapeutique ou diagnostique d'antigène-spécifique est injecté par voie intraveineuse in vivo et localisé ex vivo avec un anticorps secondaire dans les tumeurs isolées. IVIL reflète donc la biodistribution in vivo de médicaments à base d'anticorps et d'agents de ciblage. Deux applications IVIL sont décrites évaluant la biodistribution et l'accessibilité des agents de contraste basés sur les anticorps pour l'imagerie moléculaire du cancer du sein. Ce protocole permettra aux futurs utilisateurs d'adapter la méthode IVIL pour leurs propres applications de recherche basées sur les anticorps.
Introduction
Les anticorps monoclonaux (mAb) sont de grandes glycoprotéines (environ 150 kDa) de la superfamille d'immunoglobuline qui sont sécrétées par les cellules B et ont une fonction primaire dans le système immunitaire pour identifier et inhiber la fonction biologique de, ou marquer pour pathogènes bactériens ou viraux, et peuvent reconnaître l'expression protéique anormale sur les cellules cancéreuses1. Les anticorps peuvent avoir une affinité extrêmement élevée avec leurs épitopes spécifiques jusqu'aux concentrations femtomolaires, ce qui en fait des outils très prometteurs en biomédecine2. Avec le développement de la techno....
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Protocole
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité administratif institutionnel sur les soins aux animaux de laboratoire (APLAC) de l'Université Stanford.
1. Modèle de souris transgénique du développement du cancer du sein
- Observez des souris du modèle désiré de cancer pour la croissance appropriée de tumeur par l'intermédiaire de la palpation ou de la mesure d'étrier avant de procéder.
REMARQUE : Ici, le modèle murin transgénique du développement de cancer du sein (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT) a été employé. Ces animaux développent spontanément des carcinomes invasifs de sein entre 6 et 12 semaines d....
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Résultats
La méthode IVIL a été utilisée ici pour examiner la biodistribution in vivo et l'interaction tissulaire de B7-H3-ICG et Iso-ICG, en permettant aux agents, après injection intraveineuse dans un animal vivant, d'interagir avec le tissu cible pendant 96 h, puis une fois que les tissus sont d'agir comme les principaux anticorps pendant l'immunostaining ex vivo. La méthode IVIL a également été comparée à la coloration standard ex vivo IF des tissus pour le marqueur B7-H3. Les glandes mammaires.......
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Discussion
Cette méthode comporte plusieurs étapes critiques et nécessite des modifications potentielles pour assurer une mise en œuvre réussie. Tout d'abord, la posologie et le moment de l'injection intraveineuse d'anticorps/anticorps conjugués doivent être adaptés à l'application spécifique. En général, des doses doivent être utilisées qui sont compatibles avec la façon dont le conjugaison d'anticorps sera généralement utilisé, c'est-à-dire, des doses assorties de l'anticorps thérapeutique ou de l'agent de contraste à base d'anti.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions le Dr Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) pour les discussions et l'utilisation de l'équipement. Nous remercions le Dr Juergen K. Willmann pour son mentorat. Cette étude a été appuyée par la subvention du NIH R21EB022214 (KEW), la subvention de formation NIH R25CA118681 (KEW) et le NIH K99EB023279 (KEW). Le Stanford Neuroscience Microscopy Service a été soutenu par NIH NS069375.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 Femelles, 4-6 semaines | |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G | Catheter VisualSonics | Veuillez appeler pour commander Vevo | MicroMarker Tail Vein Vein Crelief Crelief Calone. |
| Lingettes imbibées d’alcool | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Éponges de gaze (4 » x 4 » 16 plis) | Cardinal Health | 2913 | |
| Lampe chauffante | Morganville Scientific | ; HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Santé animale | 29404 | |
| Pommade ophtalmique | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Ruban chirurgical | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Température de coupe optimale (OCT) Moyenne | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Pince chirurgicale London | Outils de science fine | 11080-02 | |
| Ciseaux chirurgicaux | Outils de science fine | 14084-08 | |
| Anticorps | |||
| AlexaFluor-488 chèvre anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 chèvre anti-lapin IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 chèvre anti-humain IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Contrôle des isotypes IgG humains | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Anticorps anti-nétrine-1 humanisé ; | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Lapin anti-Souris CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Souris CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Vernis à ongles Polonais | N’importe quelle pharmacie locale | ||
| Indocyanine Green - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Sérum de chèvre | normal Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldéhyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Phosphate stérile Saline tamponnée (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Lames de verre | VWR | 48311-703 | |
| Colonnes de dessalage | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Couvercles en verre | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Stylo barrière hydrophobe | Ted Pella | 22311 | |
| Tubes de microcentrifugation | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Plateau de coloration de lames | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
Références
- Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity.
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Réimpressions et autorisations
