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Summary

Nous avons caractérisé une nouvelle protéine de kinase utilisant des approches biochimiques robustes : analyse de blot occidental avec un anticorps spécifique consacré sur différentes lignées et tissus de cellules, interactions par des expériences de coimmunoprecipitation, activité de kinase détectée par l’ouest Blot à l’aide d’un anticorps spécifique au phospho et par l’étiquetage ATP de³²P.

Abstract

Le séquençage complet du génome entier a permis d’identifier de nombreux cadres de lecture ouverts (ORF) fournissant de nombreuses protéines potentielles. Ces protéines peuvent avoir des rôles importants pour la cellule et peuvent démêler de nouveaux processus cellulaires. Parmi les protéines, les kinases sont des acteurs majeurs car elles appartiennent à des voies de signalisation cellulaire et ont la capacité d’allumer ou d’éteindre de nombreux processus cruciaux pour le sort de la cellule, tels que la croissance cellulaire, la division, la différenciation, la motilité et la mort.

Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur une nouvelle protéine kinase potentielle, LIMK2-1. Nous avons démontré son existence par Western Blot à l’aide d’un anticorps spécifique. Nous avons évalué son interaction avec une protéine régulatrice en amont à l’aide d’expériences de coimmunoprécipitation. La coimmunoprécipitation est une technique très puissante capable de détecter l’interaction entre deux protéines cibles. Il peut également être utilisé pour détecter de nouveaux partenaires d’une protéine d’appât. La protéine d’appât peut être purifiée soit par l’intermédiaire d’une étiquette conçue à sa séquence ou par l’intermédiaire d’un anticorps le ciblant spécifiquement. Ces complexes protéiques peuvent ensuite être séparés par SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) et identifiés à l’aide de la spectrométrie de masse. LimK2-1 immunoprécicé a également été utilisé pour tester son activité kinase in vitro par l’étiquetage ATP de³²P. Cet exemple bien établi peut utiliser de nombreux substrats différents, et des versions mutées de l’appât peuvent être utilisées pour évaluer le rôle de résidus spécifiques. Les effets des agents pharmacologiques peuvent également être évalués puisque cette technique est à la fois très sensible et quantitative. Néanmoins, la gestion de la radioactivité exige une prudence particulière. L’activité de Kinase peut également être évaluée avec des anticorps spécifiques ciblant le groupe de phospho de l’acide aminé modifié. Ces types d’anticorps ne sont pas disponibles dans le commerce pour tous les résidus modifiés par le phospho.

Introduction

Pendant de nombreuses décennies, de nombreuses voies de signalisation ont été élucidées et leur implication dans des processus cellulaires cruciaux tels que la division cellulaire, la différenciation, la motilité, la mort cellulaire programmée, l’immunité et la neurobiologie, a été démontrée. Les kinases jouent un rôle important dans ces voies de signalisation car elles régulent souvent finement leur activation ou leur inactivation et font partie de complexes polyvalents transitoires qui répondent aux stimuli externes^1,2,3. La mutation et la dysrégulation des kinases conduisent souvent à des maladies chez l’homme, et ils sont donc devenus l’une des cibles les plus importantes de drogue au cours des quarante dernières années⁴.

Dans ce contexte, il est important de pouvoir détecter l’interaction kinase avec leurs régulateurs en amont ou leurs substrats en aval et d’identifier de nouveaux partenaires. La purification d’affinité et l’immunoprécipitation sont des techniques très puissantes pour l’isolement des complexes protéiques⁵. La protéine d’appât ou la kinase peut être étiquetée avec une séquence spécifique de peptide permettant l’utilisation des perles commerciales covalently couplées avec des anticorps ciblant le peptide. Ce matériau permet une haute reproductibilité dans les expériences^6,7,8. Les protéines endogènes peuvent également être immunoprécipitées à l’aide d’anticorps ciblant directement la protéine d’appât. Les anticorps peuvent être reliés entre les protéines A ou protéines G perles d’agarose ou tout simplement incubé avec ces perles avant d’ajouter du lysate. Les tampons de lysis doivent être optimisés pour permettre la solubilité des protéines sans perdre l’interaction et pour éviter la dégradation des protéines. Un inconvénient majeur de cette approche est que l’interaction est détectée sur la lyse cellulaire; par conséquent, les interactions transitoires ou faibles, ainsi que celles qui nécessitent un contexte subcellulaire peuvent être manquées. D’autres techniques peuvent être utilisées pour travailler directement dans la cellule, comme l’analyse de la liaison de proximité (ApL)⁹, la purification in vivo d’affinités croisées (XAP)¹⁰, le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) ou l’énergie de résonance de La Transfert (FRET)^11,12. En outre, l’immunoprécipitation n’est pas appropriée pour déterminer les constantes thermodynamiques de la liaison, pour lesquelles des techniques physiques telles que la résonance plasmon de surface, la calorimétrie de titration isothermale ou la thermophoresis à microéchelle sont nécessaires ^13,14.

L’activité kinase peut être évaluée à l’aide de plusieurs techniques. Ici, nous nous sommes concentrés sur les anticorpsspécifiques au phospho et l’étiquetage in vitro de l’ATP (Adenosine TriPhosphate). Les anticorps spécifiques au phospho ciblent la modification du phosphate d’un résidu particulier dans une protéine. Ils peuvent être utilisés dans Western Blot ou ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) après la lyse cellulaire, pour l’immunohistochimie, et aussi sur les cellules intactes en utilisant la cytométrie du flux ou l’immunofluorescence. Leurs inconvénients peuvent inclure leur manque de spécificité, qui peut être évalué à l’aide d’une version mutée de la protéine cible, et leur absence de commerce disponible pour toutes les protéines. L’étiquetageATP in vitro est une méthode très robuste, bien établie et très sensible¹⁵. Des protéines immunoprécipitées ou recombinantes peuvent être utilisées, et différents substrats peuvent être testés. Les effets des médicaments peuvent également être évalués car cette méthode est quantitative. Son principal inconvénient est que la radioactivité associée à l’approche nécessite une manipulation avec prudence. D’autres méthodes sont également possibles sur la base de la mesure des substrats peptidiques fluorescents ou luminescents et en tirant parti des propriétés fluorescentes/luminescentes altérées lors de la phosphorylation. Ces méthodes permettent également un débit élevé, ce qui est nécessaire, par exemple, dans le dépistage de molécules qui peuvent être des inhibiteurs potentiels de la kinase cible. En effet, les kinases représentent l’une des plus grandes catégories de cibles pharmaceutiques poursuivies par les sociétés pharmaceutiques¹⁶.

Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la protéine LIMK2-1 (LIMK2-1 signifie Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoforme 2-1). La protéine LIMK2 kinase a été décrite pour la première fois en 1995¹⁷. Trois isoformes de LIMK2 sont produits par épissage alternatif : LIMK2a, LIMK2b et LIMK2-1. À l’heure actuelle, LIMK2-1 n’a été décrit qu’au niveau de l’ARNm dans une seule étude¹⁸. Ici, nous caractérisons cette nouvelle protéine kinase potentielle au niveau moléculaire en utilisant des approches biochimiques robustes. Tout d’abord, nous démontrons que LIMK2-1 est en effet synthétisé. Semblable à ses deux homologues, LIMK2a et LIMK2b, il interagit avec la kinase ROCK en amont (protéine kinase associée à Rho). Nous montrons LIMK2-1 a une activité kinase sur myéline protéine de base (MBP), mais pas sur la cofiline, le substrat canonique de kinases LIM.

Protocol

1. Préparation cellulaire pour la transfection

CAUTION: Toutes les étapes de la culture cellulaire doivent être effectuées dans un laboratoire dédié, et les cellules sont manipulées dans un cabinet microbiologique de classe 2.

1. Seed HEK-293 (Human Embryonic Kidney) cells in ’10 cm plates in 10 ml of DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles Medium) complété par 10% de sérum fœtal de veau. Culture pendant 3 à 5 jours sous 5% CO₂, à 37 oC, jusqu’à ce que les cellules atteignent la confluence de 90%.
2. Traiter les plaques de 10 cm avec du collagène R pour augmenter l’adhérence cellulaire aux plaques de plastique.
   1. Ajouter 5 ml d’une solution de Collagène R, diluée 200 fois dans le tampon salin de phosphate (PBS) dans une plaque de 10 cm. Recalibrer le liquide sur toute la surface de la plaque.
   2. Incuber à température ambiante pendant au moins 1 h dans l’armoire de biosécurité.
   3. Retirez la solution de collagène et jetez-la. Ajouter 5 ml de PBS, étaler sur toute la surface de la plaque, l’enlever et le jeter. Répétez ce lavage une fois.
   4. Ajouter 8 ml de DMEM complété par 10% de sérum fœtal de veau. Conservez les plaques préparées dans l’armoire de biosécurité.
3. Prenez les plaques HEK-293 de l’étape 1.1 dans l’armoire de biosécurité. Retirer le milieu des assiettes et le jeter dans une poubelle dédiée à l’eau de Javel. Ajouter 2 ml de DMEM complété, et rincer les cellules pour les détacher en utilisant le flux d’une micropipette de 1 ml, en prenant soin d’éviter de faire de la mousse.
4. Recueillir les cellules dans un tube de 15 ml et ajouter 4 ml de DMEM complété. Homogériser avec une pipette de 10 ml, en pipetting de haut en bas 3 fois.
5. Prenez 2 mL de cette solution cellulaire et ajoutez-les à des plaques traitées au collagène contenant d’autres DMEM complétés à partir de l’étape 1.2.4.
6. Cultivez pendant 24 heures dans l’incubateur à 5% CO₂ et 37 oC. Les cellules doivent être des confluents de 50 à 80 % au moment de la transfection.

2. Transitoires transitoires

1. Retirer le milieu des assiettes, le jeter dans une poubelle d’eau de Javel dédiée, et ajouter 10 ml de DMEM frais complétés. Remettre les plaques dans l’incubateur à 37 oC tout en préparant le mélange de transfection.
2. Dans un tube de 15 ml, ajouter 450 oL d’une solution de 10 mM Tris-HCl pH 7,5/1 mM EDTA (Tris signifie Tris (hydroxymethyl)aminométhane, et EDTA pour l’acide éthylènedinitrilotetracetic) et 50 oL d’une solution de 2,5 M CaCl_2. Mélanger par inversion.
3. Ajouter 10 g d’ADN plasmidic (acide désoxyribonucléique) préparé à partir d’une préparation midi sur une culture liquide de bactéries transformées avec le plasmide dédié. Mélanger par inversion.
4. Sous une agitation lisse sur un vortex, ajouter 500 l de concentré salin salin BES 2x (composition: BES, 10.7 g/L, NaCl, 16.0 g/L, Na₂HPO₄, 0.27 g/L; BES signifie N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) goutte lentement par goutte.
5. Incuber au moins 15 min (jusqu’à 45 min) à température ambiante dans l’armoire de biosécurité. Ne pas vortex, ne pas mélanger! Déplacez les tubes très soigneusement pour ne pas perturber la formation complexe entre l’ADN et le phosphate de calcium.
6. Prenez les plaques de l’étape 2.1 à l’armoire de sécurité. Ajouter les complexes d’ADN très soigneusement, goutte à goutte, sur les cellules sur toute la surface de la plaque.
7. Incuber de 24 à 72 heures dans l’incubateur à 37 oC. Habituellement, l’expression maximale des protéines est atteinte dans les 48 heures.

3. Lysis

REMARQUE : Travaillez sur la glace et avec des tampons froids pour prévenir la dégradation des protéines.

1. Préparer le tampon de lyse : 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM de pyrophosphate de sodium, 1 mM Na₃VO₄, 20 mM p-nitrophenyl phosphate, 20 mM-glycérophosphate, 10 g/mL aprotinin, 0,05 g/mLd , 1 leupeptin de 1 g/mL et 1 mM de PMSF (fluorure de phénylmethylsullsulfonyl). Environ 4 ml de tampon de lyse sont nécessaires pour chaque plaque transfectée.
2. Retirer les plaques avec les cellules transfectées de l’incubateur. Mettez-les sur la glace.
   REMARQUE : À partir de cette étape, il est possible de travailler sur un banc « normal ».
3. Retirez le support et jetez-le dans une poubelle dédiée à l’eau de Javel.
4. Laver deux fois avec 3 ml de PBS froid : ajouter 3 ml de PBS sur le côté de la plaque goutte à goutte pour éviter de détacher les cellules transfectées, répartir sur toute la surface de la plaque, enlever le PBS et le jeter; répéter cette étape une fois de plus. À la fin, retirer soigneusement le reste de PBS en inclinant la plaque pour éviter la dilution tampon de lyse pour l’étape suivante.
5. Ajouter 500 l de tampon de lyse froide sur les cellules lavées transfectées. Étendre sur toute la surface de la plaque.
6. Incuber 10 min sur glace. De temps en temps (au moins deux fois), répartir à nouveau le tampon sur toute la surface de la plaque.
7. Mettre les cellules au rebut et les recueillir dans un tube de microcentrifuge.
8. Centrifugeuse de 10 min à 10 000 x g à 4 oC.
9. Recueillir supernatant dans un nouveau tube de microcentrifuge. Cette fraction correspond au lysate (extrait de cellule entière). Jeter la pastille qui correspond aux débris de membrane cellulaire.
10. Recueillir un aliquot de cette fraction dans un nouveau tube de microcentrifuge (environ 50 l). Cette fraction correspond à la « fraction TOTAL » ou à la « lysate cellulaire » ou à l’« extrait de cellules entières » permettant d’analyser si les protéines transfectées sont exprimées par Western Blot.
    REMARQUE : À ce stade, les échantillons peuvent être directement utilisés pour les analyses western Blot. Le tampon Laemmli doit être ajouté à l’échantillon, qui est ensuite chauffé à 95 oC pendant 5 min, centrifugé à 10 000 x g pendant 5 min, et chargé sur le SDS-PAGE approprié. Les échantillons peuvent également être stockés à -80 oC.

4. Immunoprécipitation

1. Resuspendre doucement les perles d’agarose couplées à l’anticorps approprié : HA (hémagglutinine de la grippe humaine), drapeau, ou GFP (protéine fluorescente verte) par inversion lisse.
2. Couper l’extrémité d’une pointe de 200 l à partir d’une micropipette pour permettre aux perles d’entrer dans la pointe. Pipette les perles de haut en bas plusieurs fois pour saturer la pointe pour s’assurer de prendre le volume correct de perles.
3. Prendre 40 ll de perles dans un tube de microcentrifuge.
4. Ajouter 500 oL de tampon TENET (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 % Triton X-100). Mélanger par inversion. Centrifugeuse de 2 min à 1 000 x g à 4 oC. Retirer soigneusement le supernatant et le jeter. Ajouter 500 l de TENET. Incuber pendant au moins 1 heure à 4 oC sur une roue tournante.
   REMARQUE : Cette étape de pré-incubation dans TENET permet de réduire les interactions non spécifiques et ainsi de diminuer le signal de fond.
5. Laver les perles deux fois avec 500 l l de tampon de lyse.
   1. Centrifugeuse 2 min à 1 000 x g à 4 oC.
   2. Retirez soigneusement le tampon supernatant et jetez-le.
      REMARQUE : Veillez à ne pas aspirer les perles pendant ces étapes de lavage.
   3. Ajouter 500 l de tampon de lyse. Homogénéiser en inversant le tube.
   4. Répéter les étapes 4.5.1- 4.5.3.
6. Centrifugeuse de 2 min à 1 000 x g à 4 oC. Retirez soigneusement le tampon supernatant et jetez-le.
7. Incuber les perles avec le lysate de l’étape 3.9 pendant 2 à 4 heures à 4 oC sur une roue tournante.
8. Laver les perles immunoprécipitées.
   REMARQUE : À ce stade, les perles immunoprécipitées peuvent être lavées cinq fois avec le tampon de lyse, puis élucées avec le tampon de Laemmli. L’éluate peut être utilisé pour les analyses western Blot ou stocké à -80 oC. Alternativement, les perles peuvent être lavées deux fois avec le tampon de lyse, puis trois fois avec le tampon de kinase pour effectuer l’étiquetage ATP de³²P.

5. Analyses de coimmunoprécipitation

1. Laver les perles immunoprécipitées de l’étape 4.7 avec le tampon de lyse.
   1. Centrifugeuse de 2 min à 1 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 oC.
   2. Retirez soigneusement le supernatant et jetez-le.
   3. Ajouter 500 l de tampon de lyse. Homogénéiser en inversant le tube.
   4. Répétez les étapes 5.1.1-5.1.3 quatre fois.
2. Élution
   1. Centrifugeuse de 2 min à 1 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 oC.
   2. Retirez soigneusement le supernatant et jetez-le. Retirez les dernières gouttes de supernatant avec une seringue Hamilton afin d’éviter l’aspiration des perles, et jetez le supernatant.
   3. Ajouter 40 l de tampon Laemmli 4x (200 mM Tris/HCl pH 6,8, 4 % SDS, 40 % de glycérol, 0,5 M de mercaptoéthanol, 0,02 % de bleu bromophénol). Homogénéiser en tapant doucement sur le tube.
   4. Incuber 5 min à température ambiante.
   5. Centrifugeuse de 5 min à 10 000 x g à température ambiante.
   6. À l’utilisation d’une seringue Hamilton, retirez le supernatant et collectez-le dans un nouveau tube de microcentrifuge. Cette fraction correspond à l'”Eluate”, qui peut être stocké à -80 oC, ou directement analysé par Western Blot.

6. Kinase d’assay

1. Préparer le tampon de kinase: 50 mM HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES est pour 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 5 mM MnCl₂, 50 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 20 mM -glycérophosphate, 1 g/mL la leupeptine, et 1 mM PMSF. Environ 2 ml de tampon de kinase sont nécessaires pour chaque condition d’immunoprécipitation.
2. Laver les perles immunoprécipitées de l’étape 4.7 deux fois avec 500 l de tampon de lyse.
   1. Centrifugeuse de 2 min à 1 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 oC.
   2. Retirez soigneusement le supernatant et jetez-le. Ajouter 500 l de tampon de lyse. Homogénéiser par inversion.
   3. Répétez les étapes 6.2.1 et 6.2.2.
3. Laver les perles immunoprécipitées trois fois avec 500 ll de tampon de kinase.
   1. Centrifugeuse de 2 min à 1 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 oC.
   2. Retirez soigneusement le supernatant et jetez-le. Ajouter 500 l de tampon kinase. Homogénéiser par inversion.
   3. Répétez les étapes 6.3.1 et 6.3.2 deux fois.
4. Centrifugeuse de 2 min à 1 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 oC.
5. Retirez soigneusement le supernatant et jetez-le. Retirez les dernières gouttes de supernatant avec une seringue Hamilton afin d’éviter l’aspiration des perles, et jetez le supernatant.
6. Ajouter 40 ll de tampon de kinase aux perles immunoprécipitées. Resuspendre les perles en tapant doucement sur le tube.
7. Préparer le mélange pour l’étiquetage ATP de³²P (volume final est de 22,5 l, avec tampon kinase) dans un tube de verrouillage sûr.
   1. Ajouter le volume requis de tampon kinase pour atteindre un volume final de 22,5 L.
   2. Couper l’extrémité d’une pointe de 20 l d’une micropipette. Resuspendre les perles immunoprécipitées de l’étape 6.6 en faisant monter et descendre plusieurs fois. Recueillir 10 L de ces perles dans le tube de verrouillage de coffre-fort.
   3. Ajouter l’ATP d’une solution de stock de 10 M pour atteindre 50 mm de concentration finale. Selon le nombre d’échantillons traités, une dilution de la solution de stock de l’ATP dans le tampon kinase est suggérée pour permettre à la pipette 1 à 2 L, pour s’assurer que le volume est correct.
   4. Ajouter 2,5 g de substrat (cofilin ou myéline, MBP dans le cas d’étude actuel).
8. Ajouter 5 ‘Ci de^‘[32P] ATP (3 000 Ci/mmol) pour initier la réaction. Mélanger en faisant monter et descendre lentement.
   ATTENTION: À partir de ce point, le travail doit être fait dans un lieu de sécurité dédié aux manipulations de radioactivité avec précaution prudente, des protections dédiées et des contrôles appropriés (boucliers radioactifs, compteur Geiger, collecte spécifique des déchets, sein personnel et badges pour détecter l’exposition radioactive, conseils de filtre).
9. Incuber pendant 20 min à 30 oC.
10. Arrêtez la réaction avec 6 l de tampon Laemmli 5x.
11. Chauffer à 95o C pendant 5 min.
12. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
13. Chargez sur un SDS-PAGE. Procédez à la migration.
    REMARQUE : Veillez à ce que la ligne de front de l’ATP libre de³²P ne sorte pas du gel pour éviter la contamination du réservoir de migration.
14. Tachez le gel à température ambiante.
    1. Retirer le gel des plaques de verre.
    2. Procéder avec trois bains dans l’eau à température ambiante.
    3. Tainer le gel toute la nuit avec Coomassie Blue à température ambiante.
    4. Destain le gel avec plusieurs bains de lavage avec de l’eau à température ambiante.
15. Envelopper le gel d’une pellicule plastique.
16. Exposer pendant une nuit ou plus sur un écran phosphorimager.
17. Lisez l’écran sur un phosphorimager pour détecter les bandes étiquetées.

Representative Results

Discussion

Ici, nous avons utilisé des outils biochimiques robustes pour caractériser au niveau moléculaire une nouvelle protéine, LIMK2-1, considérée comme une kinase basée sur sa séquence et sur ses homologs, LIMK2a et LIMK2b²⁰.

Tout d’abord, nous avons démontré l’existence de LIMK2-1 au niveau des protéines en utilisant l’analyse Western Blot avec un anticorps spécifique. Par la suite, nous avons évalué son interaction avec la kinase ROCK1 en amont, qui est connue pour réguler LIMK2a et LIMK2b, les homologs de LIMK2-1. Enfin, nous avons évalué l’activité kinase potentielle de LIMK2-1 par l’étiquetage IN vitro de l’ATP et dans le cellulo par Western Blot à l’aide d’un anticorps phospho-spécifique.

Composition tampon Lysis
Lors de l’étude des protéines afin de les analyser par Western Blot, un soin particulier est nécessaire en ce qui concerne la composition tampon de lyse. Plusieurs paramètres doivent être pris en compte : (i) type de détergent et concentration²¹, et (ii) inhibiteurs de la protéase.

La composition tampon de lyse doit être adaptée à la protéine cible pour faciliter sa solubilisation presque complète afin de l’extraire autant que possible et de permettre sa détection par Western Blot. Pour les protéines solubles, les conditions bénignes (p. ex., un détergent doux à faible concentration) sont souvent suffisantes pour y parvenir. Pour les protéines membranaires, des conditions plus fortes sont généralement nécessaires. Différentes catégories de détergents existent : (i) ionique, comme le sulfate de dodecyl de sodium (SDS), le bromure de cétyltrimethylammonium (CTAB), (ii) non ionique tels que l’éther hexadécyl polyéthylique (BRIJ), Triton, octylGlucoside (OG), doDecylMaltoside (DDM), iii) zwitterionic tel que 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) ou zwittergents. De solides détergents peuvent perturber les interactions et des complexes peuvent être perdus. En outre, pour les expériences d’immunoprécipitation, les anticorps peuvent être sensibles aux conditions graves. De même, l’activité enzymatique peut être perturbée par la présence de détergents qui peuvent se dérouler ou dénaturer la protéine étudiée. Le type et la quantité du détergent utilisé peuvent affecter les propriétés et l’activité d’une protéine. Pour certaines protéines, une gamme très restreinte de concentration de détergent est tolérée pour préserver l’activité de la protéine. En dessous de cette plage, la protéine reste insoluble alors qu’au-delà de cette plage de concentration, la protéine n’est plus active.

Les inhibiteurs de la protéase doivent être ajoutés au tampon de lyse pour prévenir la dégradation de la protéine cible par des protéases endogènes. Les cocktails inhibiteurs de la protéase sont disponibles dans le commerce. Ils peuvent être utilisés comme point de départ d’une étude. En cas de problème, on peut envisager l’utilisation d’un mélange d’inhibiteurs préparés extemporairement à partir de solutions de stock stockées à -20 oC. Ces inhibiteurs doivent cibler les protéases de sérine et de cystéine. Le PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluorure) est couramment utilisé, mais il est très instable dans la solution aqueuse et doit être ajouté juste avant l’extraction. Les metalloprotéases doivent également être inhibées : les réactifs de chélage métallique, tels que l’EDTA (ethylenedinitrilotetraacetic acid) ou l’EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-acide tétraacetic), qui se lient à Mg^2,sont utilisés à cet effet. Pour conserver les protéines sous leur forme phosphorylée et ainsi activée, il est également recommandé d’ajouter des inhibiteurs de la phosphatase au tampon de lyse. Ces inhibiteurs doivent cibler les phosphatases alcalines, acides, sérines, thréonine et tyrosine. Il est également recommandé de travailler à basse température (4 oC) afin de ralentir le taux de protéolyse.

Protéines cibles
Ici, nous nous sommes concentrés sur les protéines étiquetées épitope. Les balises (Flag, HA, cMyc, GFP, etc.) sont très utiles pour détecter et purifier les protéines, car les anticorps et les perles couplées par anticorps sont disponibles dans le commerce et sont facilement des matériaux reproductibles. Cependant, la taille et la position de l’étiquette doivent être prises en considération car cela peut affecter l’activité, la localisation ou la fonction de la protéine cible^6,7,8. Il est également possible de travailler avec des protéines endogènes. Dans ce cas, des anticorps ciblant cette protéine particulière doivent être utilisés. Ils peuvent être couplés à des perles (protéines A ou protéines G) covalentes (lien croisé) ou être incubés avec le lysate, puis avec les perles. Lorsque vous travaillez avec des protéines étiquetées, dont le gène est exprimé sur un plasmide, il est facile de passer à une version mutée de cette protéine par mutagénèse du gène. Il est alors possible de travailler sur différents mutants pour évaluer les fonctions biologiques.

Immunoprécipitation
L’immunoprécipitation est une technique très puissante pour isoler les partenaires de la protéine cible⁵. La composition du tampon de lyse (en particulier le détergent) doit être soigneusement établie pour préserver les interactions (voir ci-dessus). Il est possible de détecter l’interaction entre deux protéines identifiées. Il peut s’agit de protéines endogènes ou de protéines surexprimées. Lorsque les protéines sont exprimées à faible abondance, il peut être nécessaire de les surexprimer afin d’avoir des signaux plus forts. De vastes lavages de perles immunoprécipitées sont nécessaires pour éliminer les protéines ou les contaminants qui ne interagissent pas spécifiquement. Avant de déterminer l’efficacité de l’immunoprécipitation ou la présence de partenaires co-immunopciés, il est important de vérifier que les différents partenaires sont bien exprimés et présents dans le lysate en analysant le lysate de la cellule entière ou la fraction d’entrée par Western pâté. En outre, à l’aide d’expériences d’immunoprécipitation, il est également possible d’identifier de nouveaux partenaires d’une protéine cible et d’isoler de nouveaux complexes. Ces nouveaux partenaires peuvent être identifiés par spectrométrie de masse.

Ces partenaires peuvent jouer un rôle important en tant qu’activateurs de la protéine cible permettant sa pleine activité pour d’autres tests biologiques. D’autre part, les protéines non désirées copurifiées peuvent être utilisées comme argument qu’il n’y a pas d’interaction directe entre deux partenaires identifiés, mais plutôt que l’interaction détectée par la co-immunoprécipitation est due à un autre partenaire inconnu. Dans ce cas précis, pour être sûr d’une interaction directe, un autre dispositif expérimental est nécessaire, comme travailler sur les protéines de mammifères purifiées par les bactéries.

Activité Kinase
L’activité kinase peut être évaluée par différentes techniques. Ici, nous nous sommes concentrés surl’analyse in vitro par l’étiquetage ATP de 32 P et sur l’analyse d’extrait de cellules entières par Western Blot à l’aide d’un anticorps phospho-spécifique. L’étiquetage ATP est une technique très sensible et quantitative permettant de détecter une faible activité kinase¹⁵. L’incorporation de radioactivité de l’ATP au substrat cible permet de mesurer directement l’activité enzymatique. Il est possible de travailler avec différents substrats pour évaluer l’activité kinase de la protéine étudiée sur différentes cibles. Il est également possible d’identifier les acides aminés essentiels à l’activité de la kinase en les mutant lorsque la protéine est surexprimée. L’activité kinase nécessite une cation divalente telle que Mg^2,qui doit être présent dans le tampon kinase.

Le principal inconvénient de cette approche est la gestion de la radioactivité, qui nécessite des installations dédiées aux expériences et à la collecte des déchets. Il existe d’autres méthodes, telles que des kits fluorescents ou luminescents qui détectent les sous-produits de la réaction, comme l’ADP (dinosphosphate d’adénosine)¹⁶. La phosphorylation protéique peut également être étudiée par spectrométrie de masse, cependant, une plus grande quantité de matériaux est nécessaire pour ces analyses. Dans notre cas, nous avons essayé d’évaluer l’activité de kinase de LIMK2 utilisant l’électrophoresis capillaire pour augmenter notre efficacité mais ceci a été malheureusement échoué.

Les anticorps phosphospécifiques sont un autre outil pour étudier la phosphorylation d’une protéine. De larges anticorps antiphosphos serine et Tyrosine existent, capables de reconnaître phospho-Ser ou phospho-Tyr de toutes les protéines. Ces dernières années, les anticorps ciblant un phospho-site spécifique d’une protéine cible ont été largement développés et reconnaissent généralement à la fois le groupe phospho et les acides aminés environnants. Des soins particuliers sont nécessaires lorsque vous commencez à travailler avec de tels anticorps, car leur spécificité doit être vérifiée par exemple avec un contrôle négatif, comme la protéine cible mutée sur le site phospho. Lors de l’enquête d’une tache avec un anticorps anti-phospho, la solution de blocage ne doit pas être le lait, car cela contient des phosphoprotéines qui peuvent interagir avec l’anticorps. L’albumine bovine de sérum (BSA) est recommandée, et des inhibiteurs de phosphatase peuvent être ajoutés dans la solution de blocage pour empêcher la libération de phosphate. Les échantillons ne doivent pas être congelés et décongelés, mais plutôt préparés comme aliquots qui sont conservés à -80 oC. En effet, les modifications phospho sont labiles.

Materials

Antibody anti-actin	Sigma-Aldrich	A1978	for Western Blot
Antibody anti-c-Myc	Invitrogen	MA1-21316	for Western Blot
Antibody anti-cofilin	Cell signaling Technology	3312/5175	for Western Blot
Antibody anti-GFP	Santa Cruz	sc-9996	for Western Blot
Antibody anti-HA	Roche Applied Science	11687423001	for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin	Cell signaling Technology	3313	for Western Blot
Antibody Anti-PP1i	Eurogentec	designed for this study	for Western Blot
Aprotinin	Euromedex	A-162B	for lysis buffer
ATP	Invitrogen	PV3227	for γ[<sup>32</sup>P] labeling
γ[<sup>32</sup>P] ATP	Perkin Elmer	NEG502A	for γ[<sup>32</sup>P] labeling
BES buffered saline	Sigma-Aldrich	14280	for transfection
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422	for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	for Laemmli
BSA	Sigma-Aldrich	A3059	for blocking buffer
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	for Laemmli
CaCl<sub>2</sub>	Sigma-Aldrich	C3881	for transfection
Centrifuge	Sigma	111-541
Collagen R	Pan Biotech	P06-20166	for transfection
Control siRNA	Ambion	AM4611	for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution	Thermo-Fisher	24620	for gel staining
EDTA	Sigma-Aldrich	3690	for lysis buffer
Electrophoresis Unit	Biorad	Mini-Protean	for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel	Sigma-Aldrich	E6779	for immunoprecipitation
GeneSys software	Ozyme		for Western Blot acquisition
GeneTolls software	Ozyme		for Western Blot quantification
GFP-trap beads	Chromtek		for immunoprecipitation
Glycine	Euromedex	26-128-6405	for transfer buffer
GST-cofilin	Upstate Cell signaling	12-556	for γ[<sup>32</sup>P] labeling
Hamilton syringe 100 mL	Hamilton	710	to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	for kinase buffer
ImageQuant TL software	GE Healthcare		for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA	Ambion	s8191	for PP1i antibody specificity
Leupeptin	Sigma-Aldrich	SP-04-2217	for lysis and kinase buffer
MBP	Upstate Cell signaling	13-173	for γ[<sup>32</sup>P] labeling
MgCl<sub>2</sub>	Sigma-Aldrich	M8266	for kinase buffer
MnCl<sub>2</sub>	Sigma-Aldrich	244589	for kinase buffer
NaCl	Euromedex	1112	for lysis and kinase buffer
NaF	Sigma-Aldrich	S-1504	for lysis and kinase buffer
Okaidic acid	Euromedex	0-2220	for lysis buffer
PMSF	Sigma-Aldrich	78830	for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate	Euromedex	1026	for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P	Merck-Millipore	IPVH00010 pore size 0,45 mm	for Western Blot
Rotating wheel	Labinco		for bead incubation
Safe lock eppendorf	Eppendorf	0030120.086	for kinase assay
SDS	Sigma-Aldrich	5030	for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate	LC Laboratories	S8507	for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate	Fluka	71501	for lysis buffer
Super Signal West Dura	Protein Biology	34075	for Western Blot
Syngene Pxi	Ozyme		for Western Blot
Tissue extracts<br/> <br/> &nbsp;	Biochain<br/> <br/> &nbsp;	P1234035 Brain<br/> P12345152 Lung<br/> P1234149 Liver<br/> P1234188 Pancreas<br/> P1234260 Testis	for Western Blot analysis<br/> <br/> &nbsp;
Transfer Unit	Biorad	Mini-Trans-Blot	for Western Blot
Tris	Euromedex	26-128-3094 B	for lysis buffer
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949	for blocking buffer
Typhoon FLA9500	GE Healthcare		to read autoradiography
Typhoon Trio	Amersham Bioscience		to read autoradiography
Whatman paper	GE Healthcare	3030-672	for Western Blot