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Article de méthode

Dans Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

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DOI :

10.3791/59831

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28 juin 2019

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1Physics of Synthetic Systems - E14, Physics-Department and ZNN, Technische Universität München, 2Departmant of Chemistry, Center for Integrated Protein Science (CIPSM), Technische Universität München, 3Nanosystems Initiative Munich

Dans cet article

Résumé

Présentés ici sont des protocoles pour la création de petits vésicules unilamellar à base de peptides capables de croître. Pour faciliter la production de vesiculo du peptide membranaire, ces vésicules sont équipées d'un système de transcription-traduction et du plasmide codant peptide.

Résumé

La compartimentation des réactions biochimiques est un aspect central des cellules synthétiques. À cette fin, les compartiments de réaction à base de peptides constituent une alternative attrayante aux liposomes ou aux vésicules à base d'acides gras. Extérieurement ou à l'intérieur des vésicules, les peptides peuvent être facilement exprimés et simplifier la synthèse des précurseurs de la membrane. Fourni ici est un protocole pour la création de vésicules avec des diamètres de 200 nm à base de l'élastine amphiphile-comme polypeptides (ELP) en utilisant la déshydratation-réhydratation à partir de perles de verre. Sont également présentés des protocoles pour l'expression et la purification bactériennes du PEL par le biais du cycle de température inverse, ainsi que leur fonctionnalisation covalente avec des colorants fluorescents. En outre, ce rapport décrit un protocole pour permettre la transcription du dbroccoli dBroccoli d'aptamer d'ARN à l'intérieur des vésicules d'ELP comme exemple moins complexe pour une réaction biochimique. Enfin, un protocole est fourni, qui permet dans l'expression vesiculo des protéines fluorescentes et le peptide de membrane, tandis que la synthèse de ce dernier entraîne la croissance vésiculeuse.

Introduction

La création de systèmes cellulaires vivants synthétiques est généralement approchée à partir de deux directions différentes. Dans la méthode descendante, le génome d'une bactérie est réduit à ses composants essentiels, conduisant finalement à une cellule minimale. Dans l'approche ascendante, les cellules artificielles sont assemblées de novo à partir de composants moléculaires ou de sous-systèmes cellulaires, qui doivent être intégrés fonctionnellement dans un système cellulaire cohérent.

Dans l'approche de novo, la compartimentation des composants biochimiques nécessaires est généralement réalisée à l'aide de membranes faites de phospholipides ou d'acides gras1,2,3,4. C'est parce que les membranes cellulaires "modernes" se composent principalement de phospholipides, tandis que les acides gras sont considérés comme des candidats plausibles des enceintes de membrane prébiotique5,6. Pour la formation de nouvelles membranes ou pour faciliter la croissance des membranes, les blocs de construction amphiphiles doivent être fournis à partir de l'extérieur7 ou idéalement par la production dans un compartiment membranaire en utilisant les processus anabolisants correspondants4 ,8.

Tandis que la synthèse de lipide est un processus métabolique relativement complexe, les peptides peuvent être produits tout à fait facilement utilisant des réactions d'expression de gène cell-libres9,10. Par conséquent, les membranes peptidiques formées par les peptides amphiphiles représentent une alternative intéressante aux membranes lipidiques comme enclos pour les imitations de cellules artificielles qui sont capables de se développer11.

Les copolymères de di-bloc d'élastine amphiphiles (PEL) sont une classe attrayante de peptides, qui peuvent servir de bloc de construction pour de telles membranes12. Le motif de base de séquence d'acide aminé des PEL est (GaGVP)n, où "a" peut être n'importe quel acide aminé excepté la proline et « n » est le nombre de répétitions de motif13,14,15,16,17 . Les PEL ont été créés avec un bloc hydrophobe contenant principalement de la phénylalanine pour un bloc hydrophile et principalement composé d'acide glutamique11. Selon les paramètres d'une solution, tels que le pH et la concentration de sel, les PEL présentent une transition de température dite inverse à la température Tt, où les peptides subissent une transition de phase entièrement réversible d'un hydrophile à l'hydrophobe état. La synthèse des peptides peut être facilement mis en œuvre à l'intérieur des vésicules à l'aide de l'extrait de cellules bactériennes "TX-TL"11,18,19,20,21, qui fournit tous les composants nécessaires pour les réactions couplées de transcription et de traduction.

Le système TX-TL a été encapsulé ensemble, avec le modèle d'ADN codant les PEL en vésicules ELP en utilisant la déshydratation-réhydratation des perles de verre comme un soutien solide. La formation de vésicules se produit par la réhydratation des peptides séchés de la surface de perle11. D'autres méthodes22 pour la formation de vésicules peuvent être utilisées, qui peuvent potentiellement montrer une polydispersity plus faible et de plus grandes tailles de vésicule (par exemple, électro-formation, transfert de phase d'émulsion, ou méthodes microfluidiques). Pour tester la viabilité de la méthode d'encapsulation, la transcription de l'aptamer fluorogénique dBroccoli23 peut alternativement être utilisée11, ce qui est moins complexe que l'expression génique avec le système TX-TL.

En raison de l'expression des blocs de construction de membrane dans vesiculo et de leur incorporation ultérieure dans la membrane, les vésicules commencent à se développer11. L'incorporation de membrane des PEL peut être démontrée par un analyse FRET. À cette fin, les PEL utilisés pour la formation de la population initiale de vésicules sont conjugués avec des colorants fluorescents en parts égales constituant une paire FRET. Lors de l'expression des PEL non étiquetés en vesiculo et de leur incorporation dans la membrane, les PEL étiquetés dans la membrane sont dilués et, par conséquent, le signal FRET diminuede 11. Comme méthode polyvalente et commune pour la conjugaison, le cuivre catalysé azide-alkyne cycloaddition est utilisé. Avec l'utilisation d'un ligand stabilisateur tel que tris (benzyltriazolylmethyl)-amine, la réaction peut être effectuée dans une solution aqueuse à un pH physiologique sans l'hydrolyse des réactifs11, ce qui est approprié pour les réactions de conjugaison peptides.

Le protocole suivant présente une description détaillée de la préparation pour la croissance des peptidosomes à base de PEL. L'expression des peptides et de la formation de vésicule utilisant la méthode de perles de verre sont décrites. En outre, il est décrit comment mettre en œuvre la transcription de l'aptamer fluorogénique dBroccoli et la réaction de transcription-traduction pour l'expression de protéine à l'intérieur des vésicules d'ELP. Enfin, à condition est une procédure pour la conjugaison des PEL avec des fluorophores, qui peut être utilisé pour prouver la croissance de la vésicule par un test FRET11.

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Protocole

1. Expression de polypeptides de l'élastine

  1. Jour 1: Préparation d'une culture de démarrage et fournitures pour l'expression peptide
    1. Préparer et autoclaveexpression des flacons de culture d'expression (4 x 2,5 L) et 3 L de milieu LB. Pour 1 L de lb moyen, ajouter 25 g de poudre LB à 1 L d'eau ultrapure.
    2. Préparer une culture de démarrage avec 100 ml de milieu LB, 50 l de solution de chloramphenicol filtrée stérile (0,22 m) (25 mg/mL en EtOH) et 50 l de solution de carbenicilline filtrée stérile (0,22 m) (100 mg/mL dans 50 % et 50 % d'eau ultrapure).
    3. Ajouter une petite strie à partir d'un stock bactérien préfabriqué contenant la souche E. coli BL21(DE3)pLysS avec le vecteur d'expression pET20b (MD) codant la séquence de polypeptide MGHGVGVP((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP)4(GVGVP))3 (GFGVP)4GWP (abrégé en EF) à une culture de démarrage pré-chauffée de 100 ml et incuber à 37 oC pendant 16 h avec 250 tr/min dans un incubateur secouant (les souches et vecteursE. coli sont disponibles sur demande).
    4. Préchauffez les flacons de culture d'expression et les supports LB à 37 oC pendant la nuit afin qu'ils soient préparés pour le lendemain.
  2. Jour 2 : Expression protéinée
    1. Ajouter 750 ml de lb-moyen à chaque flacon de culture d'expression, 375 l de bouillon de chloramphenicol filtré stérile (0,22 m) (25 mg/mL dans EtOH), et 375 l de stock de carbenicilline filtré e (0,22 m) (100 mg/mL dans 50 % et 50 % d'eau ultrapure).
    2. Après l'agitation pour distribuer les antibiotiques, prendre 2 mL du support comme échantillon de référence pour la mesure de densité optique à 600 nm (OD600).
    3. Ajouter 7,5 ml de la culture de départ à la flacon d'expression et incuber pendant 1 h à 37 oC avec 250 tr/min.
    4. Après cette étape, l'OD600 de chaque flacon sera vérifié toutes les 20 min.
    5. Lorsque la densité optique atteint environ 0,8 réduire la température à 16 oC et induire l'expression peptide en ajoutant 750 L de 1 M stérile-filtré - isopropyl thiogalactoside (IPTG) dans l'eau ultrapure dans chaque flacon d'expression.
    6. Incuber le flacon d'expression avec les bactéries induites à 16 oC pendant 16 h avec 250 tr/min.
  3. Jour 3 : Extraction du polypeptide exprimé
    1. Pré-peser le flacon de centrifugation pour permettre la détermination de la masse de la granule cellulaire après la récolte.
    2. Récoltez toutes les bactéries des flacons d'expression par centrifugation pendant 20 min à l'aide d'une centrifugeuse pré-réfrigérée à 4 000 x g et 4 oC.
    3. Verser le supernatant et éponger les bouteilles de centrifugeuse sur un essuie-tout stérile.
    4. Peser les flacons de centrifugation et calculer la masse de granules cellulaires.
    5. Resuspendre les cellules, qui sont granulées à partir de 750 ml de culture cellulaire d'origine, dans 15 ml de saline tamponnée de phosphate (PBS, pH 7,4) par pipetting, et centrifugeuse à 4 000 x g pendant 20 min à 4 oC. Verser le supernatant et éponger les bouteilles de centrifugeuse sur un essuie-tout stérile.
    6. Resuspendre la pastille cellulaire pour l'étape de lyse dans 2 ml de tampon par 1 gramme de granule cellulaire à l'aide de PBS (pH 7,4) complété avec du lysozyme (1 mg/mL), 1 mM de phénylmethylsulfonyle fluorure (PMSF), 1 mM de benzamidine, et 0,5 U de DNase I.
    7. Sonicate les cellules pour une lyse supplémentaire sur la glace avec un sonicator à 8 W pour 9 min avec une alternance de 10 s sonication et 20 étapes de pause, suivie d'une pause de 9 minutes au cours de laquelle l'échantillon doit être refroidi sur la glace. Répétez l'étape de sonication de 9 min une fois de plus.
    8. Ajouter 2 ml de 10 % (w/v) de polyéthylèneimine (PEI) par 1 L de culture cellulaire originale pour les précipitations d'acide nucléique.
    9. Distribuer l'échantillon dans des tubes centrifugeuses de 2 ml et couver à 60 oC pendant 10 min, puis une incubation de 10 min à 4 oC.
    10. Centrifuger la solution à 16 000 x g pendant 10 min à 4 oC et recueillir le supernatant contenant le PEL.
  4. Purification des protéines par cycle de température inverse :
    1. Ajustez le supernatant à un pH de 2 pour passer la partie hydrophile du peptide à l'agrégation hydrophobe et induire. Pour ajuster le pH, l'acide phosphorique et l'hydroxyde de sodium sont utilisés. Les rayures de pH sont suffisantes pour déterminer le niveau de pH.
    2. Pour améliorer le rendement de la purification de l'échantillon, chauffer l'échantillon à 60 oC et ajouter du chlorure de sodium jusqu'à 2 M.
    3. Par la suite, centrifuger l'échantillon à 16 000 x g pendant 10 min à température ambiante (RT).
    4. Jetez le supernatant et re-dissoudre le granule dans PBS (mais seulement la moitié du volume initial est utilisé par rapport à l'étape précédente).
    5. Ajuster le pH à 7 avec de l'acide phosphorique et de l'hydroxyde de sodium. Les rayures de pH sont suffisamment précises pour déterminer le pH.
    6. Centrifuger l'échantillon par la suite à 16 000 x g pendant 10 min à 4 oC.
    7. Recueillir le supernatant et répéter les étapes 1.4.1 -1.4.6 jusqu'à 3x total, sauf que dans la dernière répétition de l'étape 1.4.4, seule l'eau est ajoutée au lieu de PBS.
    8. Mesurer la concentration des peptides à l'eau à l'eau avec un spectromètre d'absorption. Utilisez un coefficient d'extinction de 5500/M/cm à 280 nm.
    9. Ajuster la concentration du PEL à 700 M.

2. Production de vésicule utilisant la méthode des perles de verre

  1. Concentrez la solution ELP à 1,1 mM à l'aide d'un concentrateur à vide centrifuge.
  2. Mélanger 200 l de la solution D'ELP concentrée avec 1 250 l d'un mélange chloroforme/méthanol de 2:1 suivi d'un vortex.
  3. Ajouter 1,5 g de perles de verre sphériques (212 à 300 m) sur un flacon rond de 10 ml.
  4. Ajouter la solution contenant le PEL et le mélange chloroforme/méthanol au flacon de fond rond et mélanger par une secousse douce.
  5. Connectez le flacon à un évaporateur rotatif. Ajuster la vitesse à 150 tr/min et réguler la pression à -0,2 x 105 Pa (-200 mbar) pendant environ 4 min jusqu'à ce que le liquide soit évaporé à température ambiante.
  6. Placer le flacon de fond rond dans un dessiccateur pendant au moins 1 h pour s'assurer que le chloroforme et le méthanol restants sont évaporés. Pour éviter la perte des perles de verre, le papier d'aluminium lâchement attaché devrait être enroulé autour de l'ouverture ronde de flacon de fond.
  7. Pour une seule expérience, mélanger 100 mg de perles de verre recouvertes de peptide avec 60 L de la solution de gonflement, comme le PBS. Incuber cet échantillon à 25 oC pendant 5 min.
  8. Centrifugez l'échantillon rapidement à l'eau avec une centrifugeuse de table pour sédimenter les perles de verre.
  9. Utilisez une pipette pour recueillir le supernatant qui contient les vésicules.

3. Transcription de l'ARN Aptamer dBroccoli à l'intérieur des vésicules

  1. Nettoyez le banc de laboratoire avec des lingettes contenant une solution de décontamination RNase pour créer un environnement de travail sans RNase.
  2. Mélanger l'ADNs (5 M) comprenant la séquence promotrice et dBroccoli T7 (GAGACGGTCGGCCATCTGAGACGGTCGGGTCACGATATTCGTTTGTTGTTGTCGTCGAGTAGGTGTGTGCTCAGATGTCGAGGagTAGTAGGTGTGTGTGGGCTC Tampon de réaction RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT), et 2 mM spermidine], pour préparer le modèle d'ADN pour la réaction de transcription.
  3. Incuber la solution à 90 oC pendant 5 min, suivie d'une baisse lente de la température à 20 oC pendant 30 min.
  4. Préparer une solution de 1 mM (5Z)-5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2,3-dimethyl-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one (DFHBI) en dissolvant 1,26 mg de DFHBI en 5 mL de DMSO.
  5. Préparer la réaction de transcription en mélangeant le tampon de réaction RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (TNT), et 2 mM spermidine] avec 125 mM KCl, 15 mM MgCl2, 4 mM rNTP, 10 M DFHBI, 200 nM DNA template, 0.5 U/L RNase murine inhibiteur, et l'eau.
  6. Juste avant le début de la réaction, ajouter 4 polymérases T7 U/L T7.
  7. Utilisez ce mélange de réaction comme solution de gonflement à l'étape 2.7 et incubez à 37 oC pendant la durée de l'expérience, qui est généralement de 1 h.

4. Transcription-traduction (TX-TL) Réaction

REMARQUE: Pour la réaction de transcription-traduction, un extrait brut de cellules est exigé aussi bien que le tampon de réaction et l'ADN. L'extrait de cellules brutes est préparé comme décrit dans Sun et al.18. Pour une réaction TX-TL, utilisez ce qui suit : 33 % (v/v) de l'extrait brut d'E. coli, 42 % (v/v) tampon de réaction et 25 % (v/v) adn purifié phénol-chloroforme plus additifs. Les concentrations finales sont d'environ 9 mg/mL de protéines, 50 mM HEPES (pH 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzyme A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 68 mM d'acide folinique, 1 mM sM , 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2 % PEG-8000, 13,3 mM maltose, 1 U de T7 RNA polymérase, et 50 nM d'ADN plasmide dans l'eau ultrapure.

  1. Purification phénol-chloroforme du modèle d'ADN
    1. Préparer six cultures de nuit avec 5 ml de lb moyen et 5 l de solution de carbenicilline filtrée stérile (0,22 m) (100 mg/mL dans 50 % d'EtOH et 50 % d'eau ultrapure).
    2. Ajoutez une petite strie à partir d'un stock bactérien préfabriqué contenant du DH5 E. coli avec le vecteur d'expression pET20b(MD) à chaque culture de nuit préréchauffée de 5 ml et incubez à 37 oC pendant 16 h avec 250 tr/min. Selon le peptide (EF) ou la protéine (YPet ou mVenus) qui doit être exprimé, un plasmide d'encodage spécifique est utilisé.
    3. Extraire le plasmide avec un kit de mini-préparation tel que décrit dans le manuel de l'utilisateur ou en suivant le protocole fourni par Zhang et al.24.
    4. Préparer 100 L de l'ADN plasmide prépurifié (la concentration peut varier de 200 à 600 ng/L) et mélanger avec 100 OL de Roti-phenol/chloroform/isoamyl alcohol (pH - 7,5 à 8,0) dans un tube microcentrifugeur pour permettre une meilleure séparation de phase.
    5. Inverser délicatement le tube jusqu'à 6x et la centrifugeuse pendant 5 min à 16 000 x g à RT.
    6. Ajouter 200 l de chloroforme à la phase supérieure du tube et inverser le tube jusqu'à 6x.
    7. Centrifugelifuger l'échantillon à 16 000 x g pendant 5 min à RT.
    8. Pipet le supernatant à un tube séparé et ajouter 10 L de 3 M d'acétate de sodium pour les précipitations d'éthanol.
    9. Ajouter 1 ml d'éthanol froid de -80 oC et conserver l'échantillon à -80 oC pendant 1 h.
    10. Centrifuger l'échantillon à 16 000 x g pendant 15 min à 4 oC.
    11. Décant le supernatant et ajouter 1 ml d'éthanol froid de -20 oC 70 % (v/v).
    12. Centrifugeuse à 16 000 x g pendant 5 min à 4 oC.
    13. Retirer le liquide par pipetage. Veillez à ne pas déranger la pastille d'ADN.
    14. Conservez l'échantillon à RT pendant environ 15 minutes pour évaporer le reste de l'éthanol.
    15. Ajouter de l'eau ultrapure à l'échantillon pour ajuster la concentration de l'échantillon à environ 300 nM, qui est mesurée par absorption à 260 nm.
  2. Préparation de la réaction TX-TL
    1. Décongeler l'extrait de cellules brutes préparé et le tampon de réaction sur la glace.
    2. Pour un mélange de réaction de 60 l, ajouter l'ADN plasmide (phénol-chloroforme purifié) à 37,5 l du tampon de réaction [50 mM HEPES (pH 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzyme A, 0,33 mM NAD , 0,75 mM de cAMP, 68 mM d'acide folinique, 1 mm de spermidine, 30 mM de PEP, 1 mM de TNT, 2 % de PEG-8000 et 13,3 mM de maltose), suivi de l'ajout de 28,7 l d'extrait de cellules brutes. Remplir à un volume final avec de l'eau ultrapure à 58,8 L.
    3. Juste avant le début de la réaction, ajouter 1,2 l de la solution de polymérase à ARN T7 et mélanger l'échantillon en tirant de haut en bas.
    4. Utilisez ce mélange de réaction comme solution de gonflement à l'étape 2.7 et incubez à 29 oC pendant toute la durée de l'expérience, qui est généralement de 4 à 8 h.

5. Conjugaison de polypeptides de forme d'élastine avec des fluorophores via Copper Catalyzed Azide-alkyne Huisgen Cycloaddition

  1. Préparer une solution de 20 mM nhs-azide linker (azidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester) dans DMSO.
  2. Mélanger 250 oL de la solution ELP (600 M) avec PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L Na2HPO4, 0,27 g/LK 2HPO4, pH -7,2) et NHS-azide (1,2 mM) et incuber pendant 12 h à RT.
  3. Chargez l'échantillon dans une cassette de dialyse de 10 kDa et conservez-le à 4 oC pendant 12 h dans 1 L d'eau ultrapure pour enlever les sels et les résidus de NHS-azide.
  4. Mélanger le PEL activé (500 M) avec le colorant conjugué à l'alkyne (500 M), le Cy5-alkyne ou le Cy3-alkyne.
  5. Mélanger cet échantillon avec 1 mM TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine), 10 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochlorure) et 10 mM CuSO4 et incuber à 4 oC pendant 12 h.
  6. Chargez l'échantillon dans une cassette de dialyse de 10 kDa et conservez-le à 4 oC pendant 12 h dans 1 L d'eau ultrapure, pour enlever les sels et les colorants résiduels conjugués à l'alkyne.
  7. Ces PEL modifiés par colorant sont utilisés dans un mélange 1:1 des PEL étiquetés Cy3 et des PEL étiquetés Cy5 analogues aux peptides dans la deuxième partie.

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Résultats

Production de vésicules
La figure 1 montre des images de microscopie électronique de transmission (TEM) de vésicules préparées avec différentes solutions de gonflement et la méthode des perles de verre (voir aussi Vogele et al.11 ). Pour l'échantillon de la figure 1A, seul le PBS a été utilisé comme solution d'enflure pour prouver la formation de vésicules et déterminer leur taille. Lorsque TX-TL a été utilisé comme so...

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Discussion

La réhydratation du film est une procédure courante pour la création de petites vésicules unilamellar. La principale source de défaillance est la mauvaise manipulation des matériaux utilisés dans la procédure.

Initialement, les PEL sont produits par des cellules E. coli. Le rendement après la purification du PEL peut varier considérablement en fonction de la prudence avec soin du protocole au cours de ses étapes cruci...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Nous remercions le soutien financier par le biais de la DFG TRR 235 (Emergence of Life, projet P15), du Conseil européen de la recherche (accord de subvention no 694410 AEDNA) et de la TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (projet no 9.05) . Nous remercions E. Falgenhauer pour son aide dans la préparation des échantillons. Nous remercions A. Dupin et M. Schwarz-Schilling pour leur aide dans le système TX-TL et pour leurs discussions utiles. Nous remercions N. B. Holland pour les discussions utiles.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2xYTMP biomedicals3012-032
3-PGASigma-AldrichP8877
5PRIME Phase Lock GelTM tubeVWR733-2478
alkiné Cy3Sigma-Aldrich777331
alkine-conjugué Cy5Sigma-Aldrich777358
ATPSigma-AldrichA8937
BenzamidineCarl RothCN38.2
BL21 Rosetta 2 E. coli soucheNovagen71402
Bradford BSA Protein Assay KitBio-rad500-0201
cAMPSigma-AldrichA9501
CarbenicillineCarl Roth6344.2
ChloramphénicolSigma-AldrichC1919
ChloramphénicolCarl Roth3886.3
ChloroformeCarl Roth4432.1
CoASigma-AldrichC4282
CTPUSB14121
CuSO4Carl RothP024.1
DFHBILucerna Technologies410
DMSOCarl RothA994.1
DNase INEBM0303S
DTTSigma-AldrichD0632
ÉthanolCarl Roth9065.2
Acide foliniqueSigma-AldrichF7878
Perles de verre, lavées à l’acideSigma-AldrichG1277
GTPUSB16800
HEPESSigma-AldrichH6147
IPTG (&beta ;-isopropyl thiogalactoside )Sigma-AldrichI6758
KClCarl RothP017.1
K-glutamateSigma-AldrichG1149
LB BouillonCarl RothX968.2
LysozymeSigma-AldrichL6876
MéthanolCarl Roth82.2
MgCl2Carl RothKK36.3
Mg-glutamateSigma-Aldrich49605
Colonnes de chromatographie Micro Bio-SpinBio-Rad732-6204
NADSigma-AldrichN6522
NHS-azide linker (ester d’oxysuccinimide d’acide y-azidobutyrique)BaseclickBCL-033-5
PEG-8000Carl Roth263.2
Bandes de pHCarl Roth549.2
Fluorure de phénylméthylsulfonyleCarl Roth6367.2
Solution saline tamponnée au phosphateVWR76180-684
AcidephosphoriqueSigma-AldrichW290017
PolyéthylèneimineSigma-Aldrich408727
Phosphate de potassium dibasiquesolution Sigma-AldrichP8584
Phosphate de potassium monobasiqueSigma-AldrichP8709
Qiagen Miniprep KitQiagen27106
Tampon de réaction RNAPolNEBB9012
Inhibiteur de la RNase murineNEBM0314S
Lingettes RNaseZapThermoFisherAM9788
rNTPNEBN0466S
Roti-Phenol/Chloroforme/Alcool isoamyliqueCarlrothA156.1
RTS Échantillonneur d’acides aminés5 Cassettes de
Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (Kit)Thermo-Scientific66382
Chlorure de sodiumCarl Roth9265.1
Hydroxyde de sodiumCarl Roth8655.1
SpermidineSigma-Aldrich85558
Filtré stérilement (0.22 µ ; Filtre m)Carl RothXH76.1
T7 polyméraseNEBM0251S
TBTA (tris(benzyltriazolylméthyl)amine)Sigma-Aldrich678937
TCEP (chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)-phospine)Sigma-AldrichC4706
Tris baseFischerBP1521
ARNt (issu d’E. coli)Roche Applied ScienceMRE600
UTPUSB23160
dialyse Prime 2401530

Références

  1. Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
  2. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
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V sicules peptidiquesexpression d ELPformation de v siculesd shydratation r hydratationm thode des billes de verrediffusion dynamique de la lumi relecteur de plaques fluorescenceessai FRETtranscription de l ARN
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