Article de méthode

Identification du phosphate d'inositol ou du phosphoinositide Protéines interactatrices par chromatographie d'affinité couplée à la fente occidentale ou à la spectrométrie de masse

DOI :

10.3791/59865

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26 juillet 2019

1Institute of Parasitology, McGill University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole se concentre sur l'identification des protéines qui se lient aux phosphates inositol ou phosphoinositides. Il utilise la chromatographie d'affinité avec les phosphates d'inositol biotinylated ou les phosphoinositides qui sont immobilisés par l'intermédiaire de streptavidin à l'agarose ou des perles magnétiques. Les protéines de liaison du phosphate d'inositol ou du phosphoinositide sont identifiées par le ballonnement occidental ou la spectrométrie de masse.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les phosphates inositol et les phosphoinositides régulent plusieurs processus cellulaires dans les eucaryotes, y compris l'expression de gène, le trafic de vésicule, la transduction de signal, le métabolisme, et le développement. Ces métabolites exercent cette activité réglementaire en se liant aux protéines, modifiant ainsi la conformation des protéines, l'activité catalytique et/ou les interactions. La méthode décrite ici utilise la chromatographie d'affinité couplée à la spectrométrie de masse ou au ballonnement occidental pour identifier les protéines qui interagissent avec les phosphates inositol ou les phosphoinositides. Les phosphates inositol ou phosphoinositides sont chimiquement étiquetés avec de la biotine, qui est ensuite capturée par streptavidinie conjuguée à des perles d'agarose ou magnétiques. Les protéines sont isolées par leur affinité de liaison au métabolite, puis élucées et identifiées par spectrométrie de masse ou ballonnement occidental. La méthode a un flux de travail simple qui est sensible, non radioactif, sans liposome, et personnalisable, soutenant l'analyse de l'interaction de protéine et de métabolite avec précision. Cette approche peut être utilisée dans des méthodes de spectrométrie de masse quantitative sans étiquette d'étiquette ou d'acide aminé pour identifier les interactions protéine-métabolite dans des échantillons biologiques complexes ou à l'aide de protéines purifiées. Ce protocole est optimisé pour l'analyse des protéines de Trypanosoma brucei, mais il peut être adapté aux parasites protozoaires, aux levures ou aux cellules mammifères connexes.

Introduction

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Les phosphates inositol (IP) et les phosphoinositides (IP) jouent un rôle central dans la biologie de l'eucaryote par la régulation des processus cellulaires tels que le contrôle de l'expression génique1,2,3, le trafic de vésicule 4, transduction de signal5,6, métabolisme7,8,9, et le développement8,10. La fonction de régulation de ces métabolites résulte de leur capacité à interagir avec les protéines et donc à réguler la fonction protéique. Lors de la liaison par les protéines, les IP et les IP peuvent modifier la conformation des protéines11, l'activité catalytique12, ou les interactions13 et donc affecter la fonction cellulaire. Les IP et les IP sont distribués dans plusieurs compartiments subcellulaires, tels que le noyau2,3,14,15, réticulum endoplasmique16,17, plasma membrane1 et cytosol18, soit associée aux protéines3,19 ou avec RNAs20.

Le clivage de l'IP associé à la membrane(4,5)P2 par la phospholipase C entraîne la libération d'Ins(1,4,5)P3, qui peut être phosphorylé ou déphosphorylé par des kinases IP et des phosphatases, respectivement. Les ADRESSEs IP sont des molécules solubles qui peuvent se lier aux protéines et exercer des fonctions de régulation. Par exemple, Ins(1,4,5)P3 dans le métazoan peut agir comme un deuxième messager en se liant aux récepteurs IP3, ce qui induit des changements conformationnels des récepteurs et donc la libération de Ca2 'des magasins intracellulaires11. Ins(1,3,4,5)P4 se lie au complexe histone deacetylase et régule l'assemblage complexe protéique et l'activité13. D'autres exemples de fonction réglementaire d'IPs incluent le contrôle de l'organisation de chromatine21,le transport d'ARN22,23, l'édition d'ARN24,et la transcription1,2,3 . En revanche, les PI sont souvent associés au recrutement de protéines à la membrane plasmatique ou aux membranes d'organites25. Cependant, une propriété émergente des PI est la capacité de s'associer avec des protéines dans un environnement non-membranaire3,15,19,26. C'est le cas du facteur stéroïdomique de récepteur nucléaire, dont la fonction de contrôle transcriptionnelle est réglée par PI(3,4,5)P319, et polymérase polyzymatique qui est réglée par PI nucléaire (4,5)P226. Un rôle réglementaire pour les IP et les IP a été montré dans de nombreux organismes, y compris la levure22,27, les cellules des mammifères19,23, Drosophila10 et les vers28. Le rôle de ces métabolites dans les trypanosomes, qui s'écartait tôt de la lignée eucaryote, est important. Ces métabolites jouent un rôle essentiel dans trypanosoma brucei contrôle transcriptionnel1,3, développement8, biogenèse organelle et le trafic protéique29,30 , 31 Ans, états-unis ( , 32, et sont également impliqués dans le contrôle du développement et de l'infection chez les pathogènes T. cruzi33,34,35,Toxoplasma36 et Plasmodium 5 Annonces , 37. Par conséquent, la compréhension du rôle des IP et des IP dans les trypanosomes peut aider à élucider une nouvelle fonction biologique pour ces molécules et à identifier de nouvelles cibles médicamenteuses.

La spécificité de la protéine et de la liaison IP ou PI dépend des domaines d'interaction des protéines et de l'état de phosphorylation de l'inositol13,38, bien que les interactions avec la partie lipidique des IP se produisent également19. La variété des IP et des IP et leurs kinases et phosphatases modifiantes fournit un mécanisme cellulaire flexible pour contrôler la fonction protéique qui est influencée par la disponibilité et l'abondance des métabolites, l'état de phosphorylation de l'inositol et les protéines affinité de l'interaction1,3,13,38. Bien que certains domaines protéiques soient bien caractérisés39,40,41, par exemple, domaine d'homologie pleckstrin42 et SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domaines43 ,44,45, certaines protéines interagissent avec les IP ou LES IP par des mécanismes qui restent inconnus. Par exemple, la protéine répresseur-activateur 1 (RAP1) de T. brucei n'a pas de domaines canoniques de liaison PI mais interagit avec PI(3,4,5)P3 et contrôle la transcription des gènes impliqués dans la variation antigénique3. Chromatographie d'affinité et analyse de spectrométrie de masse des protéines ip ou PI interagissant des cellules trypanosome, levure, ou mammifères ont identifié plusieurs protéines sans domaines IP- ou PI-contraignants connus8,46, 47. Les données suggèrent d'autres domaines protéiques non caractérisés qui se lient à ces métabolites. Par conséquent, l'identification des protéines qui interagissent avec les IP ou les IP peut révéler de nouveaux mécanismes d'interaction protéine-métabolite et de nouvelles fonctions de régulation cellulaire pour ces petites molécules.

La méthode décrite ici utilise la chromatographie d'affinité couplée au ballonnement occidental ou à la spectrométrie de masse pour identifier les protéines qui se lient aux IP ou aux IP. Il utilise des IP biotinylated ou IP qui sont soit reliés à la streptavidine conjuguée à des perles d'agarose ou alternativement, capturés par l'intermédiaire de perles magnétiques conjuguées par streptavidin (figure1). La méthode fournit un flux de travail simple qui est sensible, non radioactif, sans liposome et convient pour détecter la liaison des protéines des lysates cellulaires ou des protéines purifiées3 (Figure 2). La méthode peut être utilisée dans l'étiquette-libre8,46 ou couplé à la spectrométrie de masse quantitative étiquetée acide aminé47 pour identifier la propriété IP ou PI-liaison des protéines à partir d'échantillons biologiques complexes. Par conséquent, cette méthode est une alternative aux quelques méthodes disponibles pour étudier l'interaction des IP ou des IP avec les protéines cellulaires et aidera à comprendre la fonction réglementaire de ces métabolites chez les trypanosomes et peut-être d'autres eucaryotes.

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Protocole

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1. Analyse des protéines liant IP ou PI par chromatographie d'affinité et ballonnement occidental

  1. Chromatographie de croissance cellulaire, de lyse et d'affinité
    1. Cultivez les cellules de T. brucei jusqu'à la phase médiane du journal et surveillez la viabilité et la densité des cellules. Un total de 5,0 x 107 cellules est suffisant pour un jeu d'enfant.
      1. Pour les formes de circulation sanguine, les cellules de croissance dans les milieux HMI-9 complétées par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 oC et 5% de CO2. Maintenir la densité cellulaire entre 8,0 x 105 à 1,6 x 106 cellules/mL.
        REMARQUE : Une densité supérieure à 1,8 x 106 cellules/mL peut affecter la viabilité des cellules. Le temps de doublement de la souche T. brucei 427 cultivée in vitro se situe entre 5,5 et 6,5 h.
      2. Pour les formes procycliques, les cellules de croissance dans le milieu SDM-79 complété avec 10% FBS à 27 oC et de garder la densité cellulaire entre 1,0 x 107 et 3,0 x 107 cellules/mL.
      3. Pour les protéines purifiées (p. ex., protéines recombinantes), prendre 0,5 à 1 g de protéines et diluer dans 450 l'amorti de liaison (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,2 % 4-nonyl phenyl-polyéthylène glycol, pH 7,4). Conserver 5 % de la protéine diluée (entrée) pour l'analyse de la tache occidentale. Passez à l'étape 1.1.7.
    2. Cellules centrifugeuses à 1 600 x g pendant 10 min à température ambiante (RT). Jetez le supernatant.
      REMARQUE : Voir l'étape 2.1.2 pour plus d'informations sur la centrifugation des grands volumes de culture.
    3. Resuspendre doucement la pastille dans 10 ml de phosphate tamponné pH salin 7,4 complété avec 6 mM de glucose (PBS-G) et préchauffé à 37 oC pour laver les cellules. Ensuite, centrifuger les cellules à 1600 x g pendant 5 min à RT. Répétez la procédure deux fois.
    4. Resuspendre la pastille dans 1 ml de PBS-G. Ensuite, transférer le volume dans un tube de 1,5 ml et une centrifugeuse à 1 600 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant.
      REMARQUE : Les granulés de cellules peuvent être congelés en flash dans de l'azote liquide et stockés à -80 oC ou à l'azote liquide.
    5. Resuspendre le granule en 0,5 ml de tampon de lyse (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol, pH 7.4) complété par 1,5x cocktail inhibiteur de la protéase et 1x cocktail inhibiteur de la phosphatase (Table of Materials) pré-réfrigéré dans la glace à lyse les cellules. Incuber le lysate pendant 10 min en rotation à 50 tr/min à 4 oC.
      REMARQUE : Il s'agit d'une étape critique parce que les protéines peuvent se dégrader si elles ne sont pas manipulées comme indiqué. Vérifiez l'intégrité du lysate protéique par l'électrophores gel de sulfate de sulfate de polyacrylamide de sodium (SDS/PAGE) si nécessaire.
      CAUTION: T-octylphenoxypolyethoxyethanol est toxique et peut causer une irritation de la peau et des yeux. Utilisez des gants, un pare-œil et une protection pour le visage.
    6. Centrifuger le lysate à 14 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Recueillir le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 ml pour les essais de liaison. Conserver 5 % du lysate total (entrée) pour l'analyse des ballonnements occidentaux. Le supernatant contient des protéines parasites extraites avec un tampon de lyse.
    7. Recueillir 50 L de PI ou de IP conjugués à des perles d'agarose (c.-à-d. 50 l de lisier) ou 50 l de perles d'agarose, et centrifugeuse pendant 1 min à 1 000 x g. Jeter le supernatant et le resuspendre dans 50 l de tampon de liaison pour équilibrer les perles. Utilisez des perles non conjuguées comme un contrôle. Utilisez des perles IP/PI avec différentes configurations de phosphate, y compris des formes non phosphorylées, pour contrôler les interactions non spécifiques.
    8. Ajouter 50 l de perles IP ou PI au lysate cellulaire ou aux protéines purifiées (chaque 1 ml de perles contient 10 nmol d'IP ou de IP conjugués). Maintenez le volume de perles IP ou PI dans 10 % du lysate total et, si nécessaire, ajustez le volume de réaction de liaison avec un tampon de liaison.
      1. Pour les essais de concurrence, ajoutez à la réaction contraignante diverses concentrations d'IP ou d'IP non conjugués (p. ex., 1, 10, 100 fois l'excès de molaire par rapport aux perles IP ou PI).
    9. Incuber la réaction pendant 1 h, ou toute la nuit, à 4 oC et tourner à 50 tr/min.
      REMARQUE : Les réactions de liaison avec des protéines purifiées peuvent être faites à RT selon la stabilité de la protéine. Si l'utilisation d'IP ou d'IP conjuguées à la biotine ne fait qu'aller à l'étape 1.1.9.1, passez autrement à l'étape 1.1.10.
      1. Ajouter 50 lde de perles magnétiques conjuguées à la streptavidine à la réaction de liaison et incuber pendant 1 h à 4 oC en rotation à 50 tr/min.
    10. Centrifuger le mélange pendant 1 min à 1 000 x g à 4 oC. Retirez le supernatant (flux) et conservez le granule. Gardez 5% du supernatant pour l'analyse western blot.
      REMARQUE : Si vous utilisez des perles magnétiques, retirez les supernatants et effectuez des lavages subséquents à l'aide d'un support magnétique (les centrifugations ne sont pas nécessaires).
    11. Ajouter 1 ml de tampon de lavage (25 mM HEPES, 300 mM NaCl, 0,2 % 4-nonyl phényl-polyéthylène glycol, pH 7,4) et resuspendre la résine en tapant ou en faisant tourbillonner le tube (ne pas utiliser de pipette parce que les perles peuvent se fixer à des pointes de pipette). Centrifuger la réaction pendant 1 min à 1 000 x g à 4 oC et jeter le supernatant. Répétez la procédure pour un total de cinq lavages.
      CAUTION: 4-nonyl phenyl-polyéthylène glycol est toxique et peut causer une irritation de la peau et des yeux. Utilisez des gants, un pare-œil et une protection pour le visage.
    12. Ajouter 50 l de tampon Laemmli 2x complété de 710 mM 2-mercaptoéthanol aux perles et mélanger en tapant ou en vortex pour éliper les protéines. Chauffer à 95 oC pendant 5 min, puis centrifuger pendant 10 000 x g pendant 1 min et recueillir le supernatant (contenir des protéines élucées). Alternativement, élichez les protéines avec 8 M d'urée/100 mM de glycine pH 2.9 pour éviter d'utiliser sDS. Congeler l'éluate à -80 oC, sinon procéder à l'analyse de la tache occidentale.
      CAUTION : Le 2-mercaptoéthanol est toxique et peut causer des irritations de la peau, des yeux et des voies respiratoires. Utilisez des gants et travaillez dans le capot chimique.
  2. Analyse de l'ouest de l'adrage
    1. Mélanger 15 échantillons d'entrée (à partir de l'étape 1.1.6) ou d'écoulement (à partir de l'étape 1.1.10) avec 5 'L de tampon 4x Laemmli. Chauffer les échantillons d'entrée et d'écoulement pendant 5 min à 95 oC. Pour les échantillons élifiés dans 8 M d'urée/100 mM de glycine pH 2,9, mélanger 15 l'l d'éluate avec 5 ll de tampon 4x Laemmli, et chauffer pendant 5 min à 95 oC.
      REMARQUE: Cette étape n'est pas nécessaire pour les échantillons élutés dans 2x laemmli tampon.
    2. Chargez les puits de 4 à 20 % de gel SDS/PAGE avec 2,5 l d'entrée, 2,5 l d'écoulement et 20 l d'échantillons élutés, et chargez l'échelle protéique selon la recommandation du fabricant.
      REMARQUE: Choisissez gel% en fonction du poids moléculaire de la protéine d'intérêt.
    3. Exécuter SDS/ PAGE à 150 V pendant 30-45 min en mémoire tampon en cours d'exécution, ou jusqu'à ce que le colorant bleu du tampon Laemmli soit à la fin du gel.
      REMARQUE : L'heure de course peut varier selon l'équipement de laboratoire.
    4. Retirer le gel des plaques en verre (ou en plastique) et tremper dans un tampon de transfert pendant 15 minutes.
    5. Transférer les protéines à la membrane de polyvinylidene difluorure (PVDF) ou à la membrane de nitrocellulose. Tremper les membranes et le papier filtre de 3 mm dans le tampon de transfert. Assembler un sandwich avec trois feuilles de papier filtre, de la nitrocellulose ou de la membrane PVDF, du gel et trois feuilles de papier filtre supplémentaires. Assurez-vous qu'aucune bulle d'air n'est emprisonnée dans le sandwich. Utilisez un rouleau pour enlever les bulles si nécessaire. Placez la membrane sur la cathode et le gel sur le côté anode de la cassette.
      REMARQUE : Vérifiez les instructions du fabricant de la membrane pour obtenir des renseignements sur l'activation de la membrane ou la préparation de la tache.
    6. Placez la cassette contenant le sandwich dans le réservoir de transfert avec le tampon de transfert. Placer le réservoir dans un seau à glace ou à 4 oC (p. ex., dans la chambre froide). Transférer les protéines à 100 V pendant 1 h (le courant varie entre 200-400 mA). Alternativement, transférer la nuit à un courant constant de 15 mA à 4 oC.
    7. Retirer la membrane de la cassette. Incuber la membrane dans 6% de lait sec non gras dilué dans PBS avec 0,05% de polysorbate 20 (PBS-T), ou solution de blocage compatible, pendant 1 h à RT pour bloquer la membrane.
      REMARQUE: Avant de bloquer la membrane, la qualité du transfert peut être vérifiée à l'aide de la tache Ponceau S. Incuber la membrane pendant 1 min en 15 ml de Ponceau S, rincer à l'eau et visualiser les bandes.
    8. Retirez la solution de blocage et incubez la membrane pendant 1 h à RT avec rotation de 50 tr/min dans les anticorps primaires dilués dans 6 % de lait sec non gras dilué dans LE PBS-T. Alternativement, incuber la membrane pendant la nuit à 4 oC avec rotation de 50 tr/min.
      REMARQUE : Le temps d'incubation peut varier en fonction de la qualité des anticorps; cependant, la plupart des anticorps fonctionneront avec des incubations de 1-3 h à RT. Suivez la recommandation du fabricant pour la concentration ou la dilution des anticorps.
    9. Laver la tache en couvant la membrane dans PBS-T pendant 5 min avec une rotation de 50 tr/min à RT. Répétez la procédure 3-5 fois. Plus de lavages peuvent être nécessaires selon la qualité des anticorps.
    10. Incuber la membrane dans le raifort peroxidase (HRP)-anticorps secondaires conjugués pendant 1 h à RT dans 6% de lait sec non gras dilué dans PBS-T avec rotation de 50 tr/min.
      REMARQUE : Suivez la recommandation du fabricant concernant la concentration ou la dilution des anticorps.
    11. Laver la tache comme indiqué à l'étape 1.2.9.
    12. Ajouter le substrat chemiluminescent pour couvrir la membrane. Retirer l'excès de substrat et couver pendant 5 min à RT dans l'obscurité.
      REMARQUE : Consultez les instructions du fabricant pour obtenir des recommandations sur les réactifs de chemiluminescence.
    13. Capturez le signal chemiluminescent à l'aide d'un imageur à base de caméra. Vous pouvez également utiliser un film radiographique pour capturer le signal chemiluminescent.

2. Analyse des protéines liant IP/PI par chromatographie d'affinité et spectrométrie de masse

  1. Chromatographie de croissance cellulaire, de lyse et d'affinité
    1. Cultivez les cellules de T. brucei jusqu'à la phase médiane du journal et surveillez la viabilité et la densité des cellules.
      REMARQUE : Un total de 1,0 x 1010 cellules est suffisant pour deux essais de liaison. L'utilisation de moins de cellules que ce qui est indiqué ici peut affecter la détection de protéines à faible abondance par spectrométrie de masse.
      1. Pour les formes de circulation sanguine de T. brucei, les cellules de croissance à mi-log phase (8,0 x 105-1,6 x 106 cellules/mL) dans les milieux HMI-9 complétés par 10% FBS à 37 oC et avec 5% co2. Pour 427 souches, 5 L de culture donnera 0,5-1,0 x 1010 cellules. Surveillez la croissance cellulaire pour éviter une densité supérieure à 1,8 x 106 cellules/mL, ce qui peut affecter la viabilité cellulaire. Maintenir le volume de culture cellulaire à 1/10 du volume flasque; sinon, le taux de croissance des cellules sera affecté en raison d'une mauvaise aération.
        REMARQUE: La souche 427 a un temps de doublement de 5,5-6,5 h.
      2. Pour les formes procycliques, les cellules de croissance dans le milieu SDM-79 complété avec 10% FBS à 27 oC et de garder la densité cellulaire entre 1,0 x 107 et 3,0 x 107 cellules/mL. 500 ml de culture donnera 0,5-1,5 x 1010 cellules.
    2. Centrifuger les cellules à 1 600 x g pendant 15 min à RT. Jetez le supernatant et suspendez la pastille dans 200 ml de PBS-G préchauffé à 37 oC. Utilisez des tubes de centrifugation à fond rond (Tableof Materials) parce que les granulés de forme de circulation sanguine T. brucei sont facilement perturbés lors de l'utilisation de rotors de centrifugeuse à angle fixe. Centrifuger les cellules à nouveau à 1600 x g pendant 5 min à RT.
    3. Retirez le supernatant et suspendez la pastille dans 10 ml de PBS-G. Centrifuger les cellules à 1600 x g pendant 5 min à RT. Répétez la procédure et après le lavage final, jetez le supernatant.
      REMARQUE : Les granulés peuvent être congelés au flash dans de l'azote liquide et stockés à -80 oC ou à l'azote liquide.
    4. Resuspendre la pastille cellulaire dans 5 ml de tampon de lyse pré-réfrigéré dans la glace et complété par 1,5x cocktail inhibiteur de la protéase et 1x cocktail inhibiteur de la phosphatase (Table of Materials). Incuber le lysate pendant 10 min à 4 oC en rotation à 50 tr/min.
    5. Centrifuger le lysate à 10 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Recueillir le supernatant (protéines solubilisées) et le diluer dans 20 ml de tampon de liaison.
    6. Recueillir 400 L d'IP ou de IP conjugués à des perles d'agarose (c.-à-d. 400 l de boue) ou 400 l de perles témoins, et centrifugeuse pendant 1 min à 1 000 x g à RT. Jetez le supernatant et resuspendez dans 400 l de tampon de liaison pour équilibrer les perles. Utilisez des perles d'agarose comme un contrôle négatif pour déterminer l'enrichissement spécifique des interactions protéine-métabolite par rapport aux interactions non spécifiques (par exemple, protéines qui se lient non spécifiquement aux perles). Utilisez des IP ou des IP avec différentes configurations de phosphate, y compris des formes non phosphorylées pour contrôler les interactions non spécifiques en raison de charges de phosphate ou de liaison à la biotine.
    7. Ajouter 400 l de perles IP/PI ou des perles de contrôle à 10 ml de lysate et incubé pendant 1 h, ou toute la nuit, à 4 oC tournant à 50 tr/min. Si l'utilisation d'IP ou d'IP conjuguées à de la biotine seulement (sans perles) passe à l'étape 2.1.7.1, sinon passez à l'étape 2.1.8.
      1. Ajouter 100 l de streptavidinie-conjugué aux perles magnétiques et couver pendant 1 h à 4 oC en rotation à 50 tr/min.
    8. Centrifuger la réaction de liaison pendant 1 min à 1 000 x g à 4 oC. Retirez le supernatant (flux) et conservez le granule. Gardez 5% du supernatant pour l'analyse western blot.
    9. Ajouter 5 ml de tampon de lavage à la pastille, mélanger délicatement en faisant tourbillonner le tube, puis centrifuger pendant 1 min à 1 000 x g à 4 oC. Jetez le supernatant. Répétez le lavage cinq fois. Si vous utilisez des perles magnétiques, collectez les supernatants et effectuez des lavages à l'aide d'un support magnétique (les centrifugations ne sont pas nécessaires).
    10. Ajouter 50 l de tampon Laemmli 2x (ou 8 M d'urée/100 mM de glycine pH 2,9, pour éviter d'utiliser le SDS) aux perles et mélanger en tapant ou en vortex (éviter la pipetage parce que les perles peuvent se fixer aux pointes de pipette), puis chauffer à 95 oC pendant 5 min. Centrifugeuse pendant 10 000 x g pendant 1 min et recueillir le supernatant (protéines élucées). Répétez la procédure deux fois pour recueillir un total de trois fractions.
    11. Congelez l'éluate à -80 oC, autrement séparer les protéines dans SDS/PAGE ou conservez-les en solution pour la trypsinisation et l'analyse de spectrométrie de masse.
  2. Digestion de trypsine des protéines pour la spectrométrie de masse
    REMARQUE : Deux variantes de cette procédure sont indiquées pour la section 2.2.1 (en gel) ou la section 2.2.2 (en solution) de digestion des protéines. Les tubes à faible liaison protéique s'entrouvent sont recommandés pour prévenir les pertes d'échantillons. Consulter un chimiste analytique à l'installation de protéomique la pertinence du protocole pour les échantillons et les instruments de spectromètre de masse disponibles.
    1. Trypsinisation in-gel des protéines
      1. Après la séparation des protéines dans SDS/PAGE, rincez brièvement le gel dans de l'eau de haute pureté. Transférer le gel sur une plaque de verre propre. Excisez les bandes de protéines avec une lame propre et évitez de couper du gel supplémentaire à l'extérieur des bandes. Couper les morceaux de gel en petits morceaux (c.-à-d. environ 1 mm carré) et les transférer dans un tube de 1 ml. Utilisez une pointe de pipette si nécessaire, mais assurez-vous que la pointe de pipette est rincée à l'éthanol avant utilisation.
        REMARQUE : Utilisez des gants pour éviter la contamination par le gel. Les morceaux de gel peuvent être stockés à -20 oC.
      2. Ajouter 100 ldre d'eau de haute pureté ou de haute performance de qualité de chromatographie liquide aux tubes pour rincer les morceaux de gel. Jeter l'eau.
        1. Pour les morceaux de gel teinté fluorescent à base de Coomassie ou de ruthénium, incuber les morceaux de gel dans la solution de destaining (25 mM NH4HCO3 en 50% d'acétonitrile) pendant 1 h, puis jeter la solution. Répétez la procédure jusqu'à ce que la coloration ne soit pas visible.
          REMARQUE : Préparer des solutions contenant NH4HCO3 par dilution à partir d'une solution de stock à 100 mM NH4HCO3, pH 7,8.
          CAUTION : L'acétonitrile est un solvant volatil, inflammable et toxique. NH4HCO3 peut causer une irritation de la peau ou des yeux. Utilisez des gants et travaillez sous une hotte chimique.
        2. Pour les morceaux de gel tachéd d'argent, incuber des morceaux de gel en 50 oL de solution de destaining pour la tache d'argent (15 mM K3[Fe(CN)6], 50 mM Na2S2O3) dans l'eau pendant 30 min. Jeter la solution et laver les morceaux de gel avec 200 l d'eau. Répétez le lavage cinq fois ou jusqu'à ce que la couleur jaune gel ne soit pas visible.
          CAUTION: K3[Fe(CN)6] peut causer une irritation de la peau ou des yeux. Utilise des gants.
      3. Déshydrater les morceaux de gel à l'aide de 200 l d'acétonitrile pendant 10 min à RT. Ensuite, jetez la solution.
        REMARQUE : Les morceaux de gel déshydratés sont plus petits en volume, opaques et collants. Si plusieurs morceaux de gel sont combinés dans un tube, répétez la procédure de déshydratation efficace des morceaux de gel.
      4. Ajouter 50 L (ou assez de volume pour couvrir les morceaux de gel) de la solution réducteur (10 mM dithiothreitol [DTT] en 100 mN NH4HCO3) et couver à 56 oC pendant 1 h. Ensuite, refroidir les tubes à RT et jeter l'excès de solution de réduction.
      5. Ajouter 50 L (ou assez de volume pour couvrir les morceaux de gel) de la solution d'alkylation (50 mM d'iodoacétéamide en 100 mM NH4HCO3) et couver pendant 30 min à RT dans l'obscurité. Ensuite, jetez l'excès de solution d'alkylation.
      6. Déshydrater les morceaux de gel avec 200 l d'acétonitrile pendant 10 min à RT. Retirez l'acétonitrile et hydratez les morceaux de gel avec 100 mNN4HCO3 pendant 10 min à RT.
      7. Déshydrater à nouveau les morceaux de gel avec 200 l d'acétonitrile pendant 10 min à RT et jeter l'excès de solution.
      8. Ajouter 15 ll de trypsine de qualité de spectrométrie de masse diluée dans un tampon NH4HCO3 de 50 m, ou assez de volume pour couvrir les morceaux de gel hydraté et couver pendant 4 h, ou pendant la nuit, à 37 oC. Gardez des quantités totales de trypsine entre 100 et 500 ng (ou 20 ng trypsin/g de protéines).
      9. Refroidir l'échantillon à RT, et centrifugeuse pendant 1 min à 2 000 x g dans un microcentrifugeur. Ajouter 10-20 'L d'acide formique de 5% dilué dans l'eau et couver pendant 10 min à RT.
        CAUTION : L'acide formique est inflammable, corrosif et toxique. Utilisez des gants et travaillez sous une hotte chimique.
      10. Centrifugeuse comme indiqué à l'étape 2.2.1.9, puis recueillir le supernatant (contiennent des peptides extraits) à un tube différent. Ajouter 20 ll d'acide formique dilué à 50-60% d'acétonitrile au tube et couver pendant 10 min à RT. Recueillir les fractions de peptide extraites dans le même tube.
      11. Séchez l'échantillon dans un concentrateur sous vide et reconstituez-le en 10 L d'acide acétique de 0,5 % et de 2 % d'acétonitrile pour l'analyse de la spectrométrie de masse. Centrifuge et recueillir la solution au fond du tube; solution de magasin à -20 oC ou -80 oC.
    2. Dans la trypsinisation de solution des protéines
      1. Précipitez les protéines pour réduire le volume de l'échantillon, le dessalement et l'échange de tampons. Ajouter six volumes d'acétone réfrigéré (-20 oC) à l'échantillon, par exemple, 600 l d'acétone à 100 oL d'échantillon. Vortex et incuber à -20 oC pendant 15 min à 1 h. La solution deviendra trouble ou formera un précipité.
        CAUTION: L'acétone est toxique et inflammable. Utilisez des gants et travaillez sous une hotte chimique.
      2. Échantillons de centrifugeuse à 4 oC pendant 30 min. Décanter l'acétone et sécher à l'air le granule pendant 15 min.
      3. Ajouter 10 l d'urée de 6 à 8 M ou 1 % de SDS dans 50 mNNH4HCO3 pour dissoudre le granule et le vortex pour mélanger. Pour de plus grandes quantités de protéines (à 10 g), utilisez jusqu'à 20 l de tampon de dissolution.
      4. Ajouter 5 ll de solution de réduction et de vortex. Faites tourner le volume vers le bas à l'aide d'un microcentrifugeur. Si les échantillons sont dilués dans l'urée, puis incuber pendant 1 h à RT. Si les échantillons sont dilués dans le SDS, puis incubé pendant 1 h à 56 oC.
      5. Faites tourner le volume vers le bas à l'aide d'un microcentrifugeur. Ajouter 3 ll de solution d'alkylation et de vortex. Ensuite, faites tourner le volume vers le bas et incubez dans l'obscurité pendant 30 min à RT.
      6. Ajouter 3 ll de solution de réduction pour neutraliser la réaction. Diluer lentement l'échantillon à 1 M d'urée ou 0,05 % de SDS à l'aide de 50 mN NH4HCO3.
        REMARQUE : Le tampon de digestion de trypsin doit avoir le détergent ou le dénaturant. Les limites de concentration pour les dénaturants sont les suivante : 0,05 % de SDD; 0,1 % d'octyl B-D-glucopyranoside; 0,1 % 4-nonlphényl-polyéthylène glycol; 0,1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol; 0,1 % polysorbate 20; 0,1 % 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate; 1 M d'urée ou de thiourea.
      7. Ajouter 5 ll de trypsine de catégorie spectrométrie de masse diluée dans un tampon De 50 mNH4HCO3 et incuber pendant 4 h, ou toute la nuit, à 37 oC. Gardez des quantités totales de trypsine entre 100 et 500 ng (ou 20 ng trypsin/g de protéines).
      8. Refroidir l'échantillon à RT, et faire tourner le volume vers le bas à l'aide d'un microcentrifugeur. Ajouter 5% d'acide acétique (ou 5% d'acide formique dans 50% d'acétonitrile) pour étancher la réaction.
      9. Séchez les échantillons dans un concentrateur sous vide indiqué à l'étape 2.2.1.11. Entreposer les échantillons à -80 oC. Désaler et concentrer les peptides à l'aide d'une colonne de phase inversée comme la pointe zippée C18, puis analyser par spectrométrie de masse.

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Résultats

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Analyse de rap1 et PI(3,4,5)P3 interaction par chromatographie d'affinité et de ballonnement occidental
Cet exemple illustre l'application de cette méthode pour analyser la liaison des IP par RAP1 à partir du lysate de T. brucei ou par la protéine recombinante T. brucei RAP1. Lysates de T. brucei formes de circulation sanguine qui expriment hémagglutinine (HA) marqué RAP1 ont été utilisés dans les essais de liaison. RAP1 est une protéine impliquée dans le contrôle transcript...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'identification des protéines qui se lient aux IP ou aux IP est essentielle pour comprendre la fonction cellulaire de ces métabolites. La chromatographie d'affinité couplée à la tache occidentale ou à la spectrométrie de masse offre l'occasion d'identifier les protéines interagissant IP ou PI et donc d'obtenir des informations sur leur fonction réglementaire. IPs ou IP chimiquement marqués [p. ex., Ins(1,4,5)P3 chimiquement liés à la biotine] et reliés entre des perles d'agarose par l'intermédiaire de streptavidin ou ca...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'auteur n'a rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été appuyés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG, RGPIN-2019-04658); Supplément de lancement de découverte du CRSNG pour les chercheurs en début de carrière (DGECR-2019-00081) et par l'Université McGill.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AcétoneSigma-Aldrich650501
acétonitrileSigma-Aldrich271004solvant
Bicarbonate d’ammoniumSigma-AldrichA6141sels inorganiques
Avanti J6-MIBeckman CoulterAvanti J6-MICentrifugeuse pour grands volumes (par exemple, 1L)
Bouteilles de centrifugeuseSigma-AldrichB1408Flacons pour la centrifugation de 1L de billes de contrôle
EchelonP-B000-1mlRéactif de chromatographie d’affinité - contrôle
Sucre D-(+)-glucoseSigma-AldrichG8270, ajouté dans le PBS pour maintenir la viabilité des cellules
Dithiothréitol (DTT)  ;Bio-Rad1610610Agent réducteur
Dynabeads M-270 StreptavidinThermoFisher Scientific65305Billes de streptavidine pour la liaison aux ligands de la biotine
Cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTARoche11836170001Inhibiteurs de protéase Tampon
d’électrophorèseBio-Rad161073225 mM Tris, 192 mM de glycine, 0,1 % SDS, pH 8,3
Falcon 15 mL Tubes de centrifugation coniquesCorning Life Sciences430052Pour centrifuger des cultures de 10 mL Acide
formique Acide 106526Sigma-AldrichGlycine
Sigma-AldrichG7126Acide aminé
HMI-9 Milieu de culture cellulaire ThermoFisherScientificME110145P1Milieu de culture cellulaire pour T. brucei formes de circulation sanguine
Imperial Protein StainThermoFisher Scientific24615Coloration de Coomassie pour la détection des protéines dans les billes SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3EchelonQ-B0145-1mlRéactif de chromatographie d’affinité  ;
Instantané  ; Sans gras  ; Sec  ; MilkThomas ScientificC837M64Réactif bloquant pour le western blot
IodoacétamideSigma-AldrichI6125Réactif alkylant pour protéines ou peptides de cystéine
Lab  ; RotatorThomas Scientific1159Z92Pour les tests de liaison
Tubes de microcentrifugation LoBindThermoFisher Scientific13-698-793Tubes de liaison à faible teneur en protéines pour la spectrométrie de masse
Nonidet  ; P-40 (Igepal CA-630)Sigma-Aldrich21-3277Détergent
PBS, pH 7,4ThermoFisher Scientific10010031Tampon physiologique
Substrat de peroxydase pour chimiluminescenceThermoFisher Scientific32106Substrat pour ballonnement Western détection des protéines
PhosSTOP Inhibiteur de phosphatase Comprimés cocktailRoche4906845001Phosphatase inhibiteurs
PI(3)P Perles PIPEchelonP-B003a-1mlRéactif de chromatographie d’affinité  ;
PI(3,4)P2 Perles PIPEchelonP-B034a-1mlRéactif de chromatographie d’affinité  ;
PI(3,4,5)P3 diC8EchelonP-3908-1mgRéactif de chromatographie d’affinité  ;
PI(3,4,5)P3 Perles PIPEchelonP-B345a-1mlRéactif de chromatographie d’affinité  ;
PI(3,5)P2 Perles PIPEchelonP-B035a-1mlRéactif de chromatographie d’affinité  ;
PI(4)P Perles PIPEchelonP-B004a-1mlRéactif de chromatographie d’affinité  ;
PI(4,5)P2 diC8EchelonP-4508-1mgRéactif de chromatographie d’affinité  ;
PI(4,5)P2 Perles PIPEchelonP-B045a-1mlRéactif de chromatographie d’affinité  ;
PI(5)P Perles PIPEchelonP-B005a-1mlRéactif de chromatographie d’affinité  ;
Ponceau S solutionSigma-AldrichP7170Coloration des protéines (0,1 % [p/v] dans de l’acide acétique à 5 %)
Hexacyanoferrate de potassium(III)Sigma-Aldrich702587Sel de potassium  ;
PtdIns PIP BeadsEchelonP-B001-1mlRéactif de chromatographie d’affinité  ;
Membrane PVDFBio-Rad1620177pour western blot  ;
Centrifugeuse réfrigéréeEppendorf5910 RMicrocentrifugeuse pour petits volumes (par ex. 1,5 mL)
Dodécylsulfate de sodiumSigma-Aldrich862010Détergent
Thiosulfate de sodiumSigma-Aldrich72049Chimique  ;
Concentrateurs sous vide SpeedVacThermoFisher ScientificSPD120-115 Concentration del’échantillon (par exemple, pour la spectrométrie de masse)
Fioles T175 pour la culture cellulaire  ;ThermoFisher Scientific159910Pour cultiver 50 mL T. brucei culture
Trypsine, spectrométrie de masse QualitéPromegaV5280Trypsine pour la digestion des protéines
UréeSigma-AldrichU5128Réactif dénaturant
VortexFisher Scientific02-215-418Pour les réactions de mélange
Tampon de transfert Western blotBio-Rad161073425 mM de Tris, 192 mM de glycine, pH 8,3 avec 20 % de méthanol
Papier 3 mmSigma-AldrichWHA3030861Papier pour transfert Wester
2-mercaptoéthanol (14,2 M)Bio-Rad1610710Agent réducteur
2x Laemmli Tampon d’échantillonBio-Rad161-0737Tampon de chargement de protéines
4&ndash ; 20 % Mini-PROTEAN  ; TGX Precast Protein GelsBio-Rad4561094Gel pour l’électrophorèse des protéines
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0747Tampon de chargement de protéines
cétonique Centrifugeuse à .

Références

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