La fusion des membranes biologiques est catalysée par des protéines de fusion spécialisées. La mesure des propriétés fusogéniques des protéines peut être obtenue par des essais de mélange de lipides. Nous présentons une méthode pour purifier l'atlastine recombinante de Drosophila, une protéine qui médiatise la fusion homotypique de l'ER, la reconstituant aux liposomes préformés, et testant la capacité de fusion.
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Article de méthode
Reconstitution assistée par détergent de Recombinant Drosophila Atlastin en Liposomes pour des essais de mélange de lipides
Dans cet article
Résumé
Résumé
La fusion de membrane est un processus crucial dans la cellule eucaryotique. Des protéines spécialisées sont nécessaires pour catalyser la fusion. Les atlastines sont des protéines réticulum-endoplasmiques (ER) impliquées dans la fusion homotypique de l'ER. Nous détaillons ici une méthode pour purifier un glutathion S-transferase (GST) et poly-histidine marqué Drosophila atlastin par deux séries de chromatographie d'affinité. L'étude des réactions de fusion in vitro nécessite l'insertion de protéines de fusion purifiées dans une couche lipidique. Les liposomes sont des membranes modèles idéales, car la composition et la taille des lipides peuvent être ajustées. À cette fin, nous décrivons une méthode de reconstitution par l'enlèvement de détergent pour drosophila atlastin dans les liposomes préformés. Tandis que plusieurs méthodes de reconstitution sont disponibles, la reconstitution par l'enlèvement de détergent a plusieurs avantages qui le rendent approprié pour des atlastins et d'autres protéines semblables. L'avantage de cette méthode comprend un rendement de reconstitution élevé et une orientation correcte de la protéine reconstituée. Cette méthode peut être étendue à d'autres protéines membranaires et à d'autres applications qui nécessitent des protéoliposomes. En outre, nous décrivons un test de mélange de lipides basé sur FRET des protéoliposomes utilisés comme mesure de la fusion de membrane.
Introduction
La fusion de membrane est un processus critique dans beaucoup de réactions biologiques. Dans des conditions biologiques, la fusion de la membrane n'est pas spontanée et nécessite des protéines de fusion spécialisées pour catalyser ces réactions1. ER fusion de membrane homotypic est médiée chez les animaux par le dynamin liés GTPase atlastin2. Le rôle d'Atlastin dans la fusion homotypique est fondamental pour les jonctions à trois voies dans les urgences périphériques, qui constituent un grand réseau interconnecté de tubules qui s'étendent dans toute la cellule. Les atlastines ont une morphologie de domaine conservée comp....
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Protocole
1. Purification de la TPS-DAtl-His8
-
Expression protéique et préparation du lysate
- Transformez BL21 (DE3) E. coli avec la construction GST-DAtl-His8 en pGEX4-T32 et sélectionnez sur une plaque d'ampicilline.
- Sélectionnez un seul transformateur et inoculez 5 ml d'ampicilline LB (5 l d'ampicilline de 100 mg/mL) dans un tube de culture de 14 ml et incubez à 25 oC en secouant à 200 tr/min pendant 6 à 8 h.
REMARQUE: En raison de l'expression qui fuit, il n'est pas recommandé d'incuber à des températures plus élevées. La croissance à 25 oC réduit l'agrégation des protéines pendant cette ....
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Résultats
L'efficacité de la reconstitution de l'atlastine est présentée à la figure 2. Des protéoliposomes reconstitués ont été flottés dans un gradient discontinu d'iohexol. Les protéines non incorporées ont été sédimentées dans la couche inférieure (B) ou dans la couche moyenne (M). La protéine reconstituée flotterait vers la couche supérieure (T). Des échantillons du gradient ont été récoltés et analysés par SDS-PAGE et Coomassie coloration. La quantification du gel par densitométrie montre une tr.......
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Discussion
Les méthodes ici délimiter une méthode efficace pour purifier, reconstituer, et mesurer l'activité de fusion de l'atlastine recombinante. Pour assurer des rendements élevés de l'atlastine fonctionnelle, certaines étapes critiques doivent être prises en considération. L'expression de l'atlastine doit être faite à basse température (16 oC) pour éviter l'agrégation et il faut viser une concentration finale entre 0,4 et 1,5 mg/mL. Les protéines très diluées ne seront pas reconstituées de manière optimale à un rapport protéin.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions le Dr Michael Stern et son laboratoire pour leurs idées et leurs commentaires sur les projets liés à l'atlastine. Ces travaux ont été soutenus par l'Institut national des sciences médicales générales [R01GM101377] et l'Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux [R01NS102676].
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Colonnes de chromatographie poly-prep 10 mL | Biored | 731-1550 | |
| 10 mm x 75 mm Tubes en verre blanc | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm de diamètre, 0,45 &mu ; m pore whatman filtres à membrane stérile | Whatman | 7141 104 | |
| 96 puits plaque blanche | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Perturbateur cellulaire | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sel de sodium)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Recherche organiques inc. | 6381-92-6 | Acide éthylènediaminetétraacétique |
| Cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA | Roche | 11873580001 | Extrudeuse complète d’inhibiteurs de protéase |
| Sigma Aldrich | Z373400 ; | Extrudeuse de base Liposofast | |
| Système de chromatographie liquide GE Akta Prime | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Perles d’agarose au glutathion | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycérol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sel sodique hydraté |
| HEPES, sans acide | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Colonne résine de chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC) | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating Colonnes de chromatographie d’affinité métallique immobilisée HP |
| Iohexol | Société chimique et scientifique précise | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Produits de recherche international corp. | I56000-100.0 | IPTG, sans dioxane |
| L-Glutathion réduit | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Chlorure de magnésium | Fisher | 7791-18-6 | |
| Méthanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (sel d’ammonium)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl &beta ;-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Billes adsorbantes en polystyrène non polaire | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobilles |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 &mu ; m membrane poreuse | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifugeuse | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-&alpha ;-dipalmitoyl [choline méthyl-3H] | ARC | ART0284 | Lipides titriés |
| Lecteur de plaques | TECAN | TECAN infinite M200 | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Chlorure de potassium | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine, rhodamine B sulfonyle) (sel d’ammonium))Avanti | 236495 | Rh-DPPE | |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Solution de scintillation pour échantillons aqueux ou non aqueux |
| Scintillation flacons | Beckman | 592928 | Bouchon à rotation rapide Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombine à partir de plasma humain |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Tubes à centrifuger ultra-clairs 5 mm x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 à 13 mm Porte-tube | VWR | 58816-138 | Insert pour tube |
| en verre blanc vortexVortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Dispositif de retenue nécessaire pour le support de tube vortex |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 modèle G560 |
| &beta ;-mercaptoethanol biologie moléculaire grade | Calbiochem | 444203 |
Références
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
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Réimpressions et autorisations
